不溶性药物脂质体的制备

目 录

中文摘要 ....................................................................................... 错误！未定义书签。 Abstract ........................................................................................ 错误！未定义书签。

一 前言 . .................................................................................................................. 2

（一）羟基磷灰石的研究背景 ...................................................................................... 2

1．结构与性质 ...................................................................................................... 2

2．学术背景 .......................................................................................................... 2

3．制备方法 .......................................................................................................... 3

4．应用领域 .......................................................................................................... 5

（二）HAP 脂质体 . ...................................................................................................... 6

1．脂质体的来源和特点 ........................................................................................ 6

2．HAP 脂质体 ..................................................................................................... 6

(三) 课题的研究内容 ..................................................................................................... 7

二 材料与方法 . ....................................................................................................... 8

（一）材料 . .................................................................................................................. 8

1．仪器 ................................................................................................................. 8

2．试剂 ................................................................................................................. 8

（二）试验方法 ........................................................................................................... 9

1． ....................................................................... 羟基磷灰石（HAP ）晶体的制备 9

2. 磷酸缓冲液（PBS ）的制备 .............................................................................. 9

3. 钙指示剂的配制 ................................................................................................ 9

4．空白脂质体的制备 . ........................................................................................... 9

5. HAP晶体与空白脂质体混合液的制备 . ............................................................. 10

6. 表征方法 . ........................................................................................................ 10

三 结果与讨论 . ..................................................................................................... 11

1. 包结温度对脂质体的影响 ............................................................................... 12

2. HAP 的量对脂质体的影响 .............................................................................. 12

3. 吐温-80 的量对脂质体的影响 ........................................................................ 12

4. 乳化时间对脂质体的影响 ............................................................................... 13

6. 正交设计确定HAP 脂质体的配方 ................................................................... 13

四 结论 . ................................................................................................................ 16

致 谢 .................................................................................................................... 17 参考文献 ....................................................................................... 错误！未定义书签。

不溶性药物脂质体的制备

一 前言

（一）羟基磷灰石的研究背景

1．结构与性质

羟基磷灰石（Hydroxylapatite ，简称为HA 或HAP ）, 分子式为Ca 10(PO4) 6(OH)2，Ca /P 为1.67，分子量1004，理论密度较大，为3.156g/cm3，折射率为1.64～l.65，呈弱碱性（pH=7-9），是六方晶系结构的白色粉末或多孔颗粒，低pH 时易被破坏，宜在中性或偏碱性时应用，不溶于水、乙醇、氯仿等 [1]，是构成人体骨骼、牙齿的无机质，具有良好的生物活性、生物相容性、骨传导性及与自然骨矿物组分的相似性[2]，在体液的作用下，可发生部分降解，被人体组织吸收并利用，产生骨传导作用[3]。此外，羟基磷灰石被用于牙膏添加剂以防止牙龈炎，作为植皮装置应用于临床[4]。

图1 羟基磷灰石的结构式

2．学术背景

羟基磷灰石的研究可以追溯到1790年，Wemer 用希腊文字记载并命名为磷灰(Apatite)。在1926年，Bassett 通过X —射线衍射的方法证实人骨和牙齿中的无机矿物成分与磷灰石的成分相似。从20世纪50年代以来，人们广泛关注于HAP 的合成。不仅

表现在合成高纯度的HAP 单晶[5,6]方面，而且还合成出与人骨极为接近的CHAP [7,8]和较高稳定性的FHAP [9,10]，并且利用陶瓷致密的烧结工艺，烧制出HAP 多晶体，并在临床医药方面得到广泛应用[11]。在1974年到1975年间，Aoki 等[12]通过实验研究发现，羟基磷灰石的生物相容性与其洁净与否没有一点关系。从此，HAP 因其具有良好的生物相容性和生物活性，被广泛应用于人体骨组织的修复和替代技术[13-15]，羟基磷灰石的全方位的基础与临床研究也就在世界各国随即展开[16]。

纳米技术是20世纪90年代开始迅速发展的研究领域，其粒子具有小尺寸效应、量子尺寸效应、宏观量子隧道效应、表面效应等[17]独特的性能。在国际性生物技术领域中占据着最前沿的地位，而用于诊断、修复生物体病损组织的纳米生物材料已经是纳米生物技术的核心。

3．制备方法

制备纳米HAP 的方法主要有水热反应法、酸碱反应法、微乳液法等[18]。本文采用的是溶胶-凝胶法。

3.1 水热反应法

水热反应法的特点是在一个特制的密闭容器内，在高压的环境中，以水溶液为反应介质，使介质的温度上升到200-400℃，从而使OH — 加入晶格，即可获得结晶较好的高纯度HAP 多晶体粉末。

3.2 酸碱反应法

酸碱反应法是依据酸碱的中和反应制得HAP 。首先，将一定量的Ca(OH)2的粉体用

水调成糊状，加入到盛有70℃蒸馏水的烧杯中并搅拌，缓慢滴加H 3PO 4便于调节pH 值，即生成了HAP 。

3.3 微乳液法

微乳法是将CaCl 2与(NH4) 2HPO 4制成微乳液，以环己醇为油相，以正己烷为表面活性剂，混合两种微乳液并静置一定时间，用无水乙醇洗涤其沉淀物，即可获得20-40nm 的HAP 粉体。

图2 微乳液法制备HAP 的流程图

3.4 溶胶-凝胶法

溶胶-凝胶法是利用Ca 2+溶胶缓慢滴入(PO4) 3-溶胶中，用氨水调节pH 值在8-10之

间，生成的HAP 凝胶经24h 老化、洗涤、干燥制得。

4．应用领域

羟基磷灰石作为一种活性生物材料，因其与人体组织相容性好，在临床上被广泛应用于如种植牙、制作人工骨及人工关节、骨填充材料[19]等人体硬组织的修复和置换，也可以作为如鞍鼻充填之类的整形植入物，但其缺点是在人体生理环境中质地脆弱且抗疲劳性差，并且在肿瘤治疗过程中也起到举足轻重的作用[20]。

4.1 治疗牙齿疾病

有报道称，羟基磷灰石的糊剂可用于治疗因外伤、龋齿引起的牙根停止发育和牙早失等牙齿疾病，并且产生相当不错的效果。HAP 并没有成骨性，但可封闭根尖孔，因此HAP 的糊剂是一种理想的诱导生物大分子材料，值得临床推广与研究。

4.2 治疗癌症

纳米HAP 粉体对癌细胞的扩散有很好的抑制作用，故其在癌症治疗的方面表现出了一些特异的功能。Covaliu 等人[21]发现纳米HAP 粉体对骨肿瘤细胞的抑制有明显的治疗作用；李世普教授[22-25]研究发现，纳米HAP 在体外实验中对多种癌细胞均有一定的抑制作用，而其对正常的细胞基本上无作用。故纳米HAP 极有可能成为癌症治疗方面的“精英”。

4.3 分离和纯化生物大分子

羟基磷灰石可适用于蛋白质、酶、病毒、核酸、肽、糖类、氨基酸等生物大分子材料的分离与纯化，具有适于中（碱）性体系、耐高温、不溶胀等特点，是一种集高选择

性、良好生物相容性、强通用性和使用安全方便等优点于一身的分离介质。

4.4 作为载体

有大量实验研究表明，纳米羟基磷灰石可作为药物载体使用，并且其不会被胃肠液溶解，而且在释放药物后可被其降解吸收或者随粪便全部排出体外。纳米HAP 由于在制备过程中便于放入放射性元素，故可用于癌细胞的灭活[26]，更加有利于药物的透皮吸收。

（二）HAP 脂质体

1．脂质体的来源和特点

脂质体（Li posome ）也称为微脂粒、液晶微囊或类脂小球，系指将药物包封于类脂质双分子层内而形成的微型泡囊体，是一种靶向给药系统的新型的药物制剂。1965年，由英国科学家Bangham 和Standish 在电镜下观察磷脂在水中分散系时首次发现 [27]。1971年，由英国科学家Rymen 等人首次作为药物载体使用。其特有的分子结构使其具有靶向性和淋巴定向性、缓释作用、降低药物毒性及提高稳定性等特点[28]。

2．HAP 脂质体

随着生物技术的发展和制备工艺的完善，HAP 脂质体优良的生物特点逐步被发现，如生物靶向性和相容性、降低药物毒性和提高药物稳定性。将脂质体作为一种药物载体用于包裹HAP ，以确保其口服给药后更容易吸收到体内，更加有效地发挥HAP 粒子的作用。HAP 与脂质体联合作用后，可以牢固地粘附在细胞的表面，使其更易进入细胞，并且能在一段时间内确保其不被消化降解，更加有效的发挥HAP 在机体中的作用[29]。

(三) 课题的研究内容

众多研究表明，用脂质体包裹HAP ，以确保其口服给药吸收后，有效的发挥HAP 粒子在机体的作用。由于脂质体的脂溶性，HAP 脂质体更易进入细胞，使其牢固地粘附在细胞表面，且保持一段时间不被消化降解，更有效的发挥作用。

本课题旨在研究HAP 脂质体的制备方法，通过表征粒径、电位和包封率，从而摸索出最优方案。

为了能够制备出高度包封的HAP 脂质体，本论文进行了一系列的实验研究与探索，最终确定用薄膜分散法制备HAP 脂质体。首先测定了不同条件下脂质体的粒径和电位，然后对其包封率进行了测定，最后通过正交试验软件分析得出最优实验设计。

图3 薄膜分散法制备HAP 脂质体的流程图

二 材料与方法

（一） 材料

1．仪器

KH3200DE 型数控超声波清洗器 昆山禾创超声仪器有限公司

JY92-11超声波细胞粉碎机

Z36HK 高速离心机

UV-2系列紫外可见分光光度计

WH-71电热恒温干燥箱

CR3i 型多功能冷冻离心机

10-100μl 移液枪

西门子双开门家用电冰箱

CJ-1型搅拌器

RE 型旋转蒸发器

HX-105型恒温循环水槽

ESJ200-4型电子天平

ZS90型纳米-电位粒度测定仪

2．试剂

磷酸氢二铵

吐温- 80

氨水

大豆磷脂

胆固醇

丙酮

无水碳酸钠

无水乙醇

硝酸钙

磷酸氢二钠

磷酸二氢钠

宁波新芝生物科技股份有限公司 Made in Germany 尤尼柯仪器有限公司 天津市泰斯特仪器有限公司 美国热电公司 法国制造 博西华家用电器有限公司 上海伟业仪器厂 巩义市英峪予华仪器厂 北京长流科学仪器公司 沈阳龙腾电子有限公司 Made in UK 天津市大茂化学试剂厂 天津市大茂化学试剂厂 天津市大茂化学试剂厂 供注射用，上海太伟药业有限公司上海金穗生物科技有限公司 分析纯，天津市星月化工有限公司分析纯，天津市大茂化学试剂厂 分析纯，沈阳市华东试剂厂 分析纯，沈阳市华东试剂厂 沈阳市华东试剂厂 天津市大茂化学试剂厂

钙试剂 天津市大茂化学试剂厂

氯化钠 天津开发区海光化学制药厂

硝酸 分析纯，山东省莱阳市双双化工有限公司

（二）试验方法

1． 羟基磷灰石（HAP ）晶体的制备

精密称取Ca(NO3) 2·4H 2O 量为23.6946g ，（NH 4) 2HPO 4量为7.9842g ，以保证

Ca/P=1.67，分别溶解并定容至100ml ，用氨水调PH 至10，再将Ca(NO3) 2·4H 2O 以5ml/min的速度缓慢滴入（NH 4) 2HPO 4中，在反应过程中保持pH 值恒定在10，滴完后，在磁力搅拌器上充分搅拌5h ，随后置电炉上加热约2h ，边加热边搅拌，直到水分完全蒸发（大约剩余50ml ），静置24h ，洗涤三次，抽滤至滤液呈中性，所得的滤过物即为HAP 无定形固体。把HAP 固体置于电热恒温鼓风干燥箱中200℃下恒温干燥2h ，所得乳白色固体即为HAP 晶体，在研钵中研成粉末备用。

2. 磷酸缓冲液（PBS ）的制备

精密称取Na 2HPO 4·12H 2O 量为0.3700g ，NaH 2PO 4·2H 2O 的量为2.0000g ，加蒸馏水适量，使其充分溶解，并稀释定容至1000ml ，即得0.067mol/L的磷酸盐缓冲液（pH 值约为5.7）。

3. 钙指示剂的配制

1g 钙指示剂与100g NaCl 晶体混合磨匀，配制成固体指示剂，每次加入约0.1g 的量。

4． 空白脂质体的制备

处方：注射用大豆磷脂0.9000g ，胆固醇0.3000g ，无水乙醇10-15ml ，磷酸缓冲液

（PBS ）适量（约30ml ），制成30ml 的脂质体。

（1）精密称取处方量大豆磷脂和胆固醇于50ml 小烧杯中，加无水乙醇15-20ml ，置

于30℃水浴中，超声助溶20-30min 至其完全溶解。

（2）将含磷脂和胆固醇的乙醇液倒入500ml 的圆底烧瓶中，置旋转蒸发仪上

（10rrp/min）减压蒸发，在圆底烧瓶内壁旋转，均匀成膜，用电吹风吹至乙醇全部挥去。 （3）另取PBS 缓冲液 30ml 于小烧杯中，同样置于等温水浴中保温待用。

（4）取预热的PBS 缓冲液 30ml ，加至含磷脂和胆固醇质膜的圆底烧瓶中，30℃水

浴中超声水化10min ，随后移入小烧杯中，置于磁力搅拌器上，室温搅拌30-60min （若溶液体积减少，可补加PBS 缓冲液）。

（5）用超声粉碎机探头超声溶解（时间：10s ，间隔：6s ，次数：30次）得空白脂质体，呈乳白色悬浊液。

5. HAP 晶体与空白脂质体混合液的制备

精密称取处方量HAP 晶体加至空白脂质体中，混合均匀，置磁力搅拌器上搅拌

20min ，随后在13℃，100W 条件下超声20min ，取吐温-80加至上述混合液中，超声乳化适当时间，置磁力搅拌器上搅拌20min ，超声粉碎机下探头超声溶解，0.22μm 微孔滤膜过滤3次，置于4℃冰箱中备用。 6. 表征方法

（1）用激光粒度测试仪，测得脂质体的粒径、Zeta 电位。 （2）用离心-沉淀法测定包封率

包封率（Entrapment Efficiency，EE%）是指被包裹在脂质体内囊中的药物占脂质体

混悬液中的药物总量的比例[30]。

包封率＝（脂质体中药物总量－脂质体中未包封的药物／脂质体中药物总量）×100%

将上述所制脂质体于4℃冰箱中，静置24h ，观察在其底部是否有沉淀产生。若有沉淀产生，则不需振摇，倾倒小烧杯中的脂质体于10ml EP 管中，在4℃，10000rrp/min条件下离心20min ，取上清液即为可能含未包封HAP 的脂质体[31]，加10% HNO 3溶液30ml 充分解离出HAP 中的Ca 2+，加入Ca 指示剂，显粉红色，加足够的无水碳酸钠至溶液显蓝色，抽滤并水洗（洗去多余的碳酸钠）得碳酸钙沉淀，120℃烘干碳酸钙沉淀和小烧杯底部的沉淀，称量并计算出未包封HAP 的量。若无沉淀产生，同法离心并沉淀小烧

杯内脂质体得碳酸钙沉淀，称量并计算出未包封HAP 的量。

三 结果与讨论

测定包封率的关键技术是把未包封的游离药物从脂质体上分离出来，常用的分离方法有柱层析法、透析法、超滤膜过滤法等。本论文采用的是超速离心法。

1. 包结温度对脂质体的影响

本实验采取的是选择同一处方固定其他组分的比例和条件不变，只改变温度制备HAP 脂质体，包封率结果见表1。

温度（）

35 45 55 65

粒径（）

208.0 189.9 179.6 219.2

电位（）

-26 -30.1 -34.3 -24.8

包封率（）

98.79 94.30 99.34 97.95

从表1中可以得出，固定其他实验条件不变的情况下，当温度为55℃时，HAP 脂质体包封率最高，为99.34%，由此确定最佳温度为55℃。 2. HAP 的量对脂质体的影响

固定其他组分的比例不变，只改变HAP 的量制备HAP 脂质体，包封率测定的结果见表2。

表2 HAP 与大豆磷脂和胆固醇的配比对脂质体的影响

HAP 的量（g ）

0.3

0.5 0.7 0.9

粒径（nm ）

299.6 277.6 237.9 144.6

电位（mV ）

-21.5 -15.4 -23.7 -26.8

包封率（%）

94.91 97.29 92.31 90.07

从表2得出，固定其他组分的比例时，当HAP 的量为0.5g ，其包封率最高，为97.29%，进而确定最佳HAP 的量为 0.5g 。 3. 吐温-80 的量对脂质体的影响

考察了乳化剂吐温-80对HAP 脂质体包封率的影响，选择同一处方固定其他组分，只改变吐温-80的量制备HAP 脂质体，包封率结果见表3。

表3 吐温—80的量对脂质体的影响

吐温的量（g ）

0.5

1.0 1.5 粒径（nm ）

257.2 307.9 245.1 电位（mV ）

-21.9 -22.1 -17.7 包封率（%）

92,75 95.70 98.67

从表3得出，固定其他组分，当吐温-80的量为1.5g 时，HAP 脂质体的包封率最高，为98.67%，确定吐温-80的最优配比为1.5g 。 4. 乳化时间对脂质体的影响

吐温-80的乳化时间对HAP 脂质体包封率的测定是有一定影响的，对于同一组方，固定其他组分的比例不变，只改变其乳化时间来制备HAP 脂质体，包封率结果见表4。

表4 吐温—80的乳化时间对脂质体的影响

乳化时间（min ）

10

15 20 25

粒径（nm ）

317.7 412.5 413.1 390.5

电位（mV ）

-16.3 -18.1 -22.2 -15.1

包封率（%）

97.11 95,68 95.58 93,86

从表4得出，固定其他组分的比例不变，当吐温-80的乳化时间为10min 时，HAP 脂质体的包封率最高，为97.11%，确定吐温-80的最优乳化时间为10min 。 6. 正交设计确定HAP 脂质体的配方 6.1 正交试验

表5 正交试验条件下HAP 脂质体的制备与表征

组别 1 2 3 4 5 6 7 8 9

A. 温度（℃） 55 55 55 60 60 60 65 65 65

B. HAP（g ） 0.4 0.8 1.2 0.4 0.8 1.2 0.4 0.8 1.2

C. 吐温（g ） 0.5 1.0 1.5 1.0 1.5 0.5 1.5 0.5 1.0

D. 乳化时粒径 间（min ） （nm ）

10 15 20 20 10 15 15 20 10

154.5 161.6 294.2 220.3 212.0 274.2 202.8 283.1 245.4

电位

（mV ） -34.1 -22.1 -14.7 -17.7 -15.9 -11.5 -13.3 -12.2 -15.6

包封率（%） 96.65 82.47 73.65 86.55 79.18 64.97 89.91 75.83 65.46

表6 正交设计试验与结果

因素 实验1 实验2 实验3

温度(A) 1 1 1

HAP(B) 1 2 3

吐温(C) 1 2 3

乳化时间(D)

1 2 3

实验结果 96.65 82.47 73.65

实验4 实验5 实验6 实验7 实验8 实验9 均值1 均值2 均值3 极差

2 2 2 3 3 3 84.257 76.900 77.067 7.357

1 2 3 1 2 3 91.037 79.160 68.027 23.010

2 3 1 3 1 2 79.150 78.160 80.913 2.753

3 1 2 2 3 1 80.430 79.117 78.677 1.753

86.55 79.18 64.97 89.91 75.83 65.46

由正交设计表可知，影响HAP 脂质体包封率的主次因素顺序依次为：HAP 、温度、吐温、乳化时间。依据正交设计遴选原则，可得到各影响因素的最佳搭配为A 1B 1C 3D 1，即最佳工艺为HAP 的量为0.4g ，温度为55℃，吐温的量为1.5g ，乳化时间为10min 。

6.2 验证试验

按A 1B 1C 3D 1条件的试验在上述结果中并没有出现，因此需要做三次平行实验，以验证其结果是否与实际相符。三次平行试验的包封率分别为98.67%，96.53%，96.85%，大于结果中的最高值96.65%，说明正交试验优化HAP 脂质体的制备工艺是成功的。

6.3 HAP 脂质体的粒径和电位的表征

图4 空白脂质体的粒径（171.5nm ）

图5 空白脂质体的电位（-37.1mV ）

图6 最优条件的HAP 脂质体的粒径（308.3nm ）

图7 最优条件的HAP 脂质体的电位（-11.7mV ）

四 结论

本文通过薄膜分散法，以大豆磷脂、胆固醇和PBS 缓冲液为原料，加入不等量的HAP 和吐温-80，在不同的反应温度和乳化时间下，合成出不同规格的HAP 脂质体。并且通过正交试验确定了HAP 脂质体的最佳制备条件为HAP 的量为0.4g ，温度为55℃，吐温的量为1.5g ，乳化时间为10min 。在此条件下，HAP 脂质体的粒径为308.3nm ，电位为-11.7mV ，包封率为97.35%。

致 谢

到现在为止，大学生涯即将结束，昨日的一切依然在眼前重现。此时此刻，心情万分激动与复杂，千言万语于心头，却不知从何说起！本片文章虽然不算厚重，但是承载着我四年学习和研究的汗水与热忱。在此衷心的感谢曾经无私帮助我的老师和同学们！

首先，诚挚感谢我的导师李森教授！从最开始的选题、文献抄读、实验设计到实验开展、结果分析和论文撰写，每一个环节都倾注了恩师大量的心血。她教导我如何用严谨的态度做科研、用科学的方法分析实验结果，并且不厌其烦地和我一次又一次的讨论和分析实验步骤与方法，这一切都令我终生难忘，也是我人生中一笔宝贵的精神财富。我知道感念师恩不能挂在嘴边，我会用我的实际行动证明我会在科研的这条道路上越走越长。

感谢李明慧老师和宗明老师，她们开朗的性格和严谨的态度，都帮助了我很多。在毕业设计的整个过程中，任何工作的开展都离不开大家的帮助与支持。特别感谢甄细娥

师姐和高文彦师兄在科研中给予的点滴帮助，我将铭记于心。李茂圆为我的实验生涯奠定了坚实的基础。宋艳萍和郑林玉是一个实验室的朋友，半年来朝夕相处的日子是最温暖的回忆。学妹刘佳、许文娟都是很好的朋友，在实验过程中给了我很大的帮助，是你们让我的实验更加顺利！

特别感谢同窗好友：任丹丹、贺俊斌、朱庭华和宁大玮，感谢你们带给我的所有感动与帮助！

感谢药学院的所有领导和老师们！

最后衷心感谢我的父母、亲人多年来对我的理解与支持！

大学生涯即将结束，但是生命不止，学习不断。我，仍将积极进取，奋斗不息！ 祝愿老师工作顺利，同学学业有成！