计算机辅助蛋白质分子理性设计院

第24 卷第5 期化　 学　 进　 展

Vol. 24 No. 5 计算机辅助蛋白质分子理性设计院

∗

从肌红蛋白到一氧化氮还原酶

林英武1 , 2∗∗

( 1. 南华大学化学化工学院　 衡阳421001 ; 2. 南京大学配位化学国家重点实验室　 南京210093 ) 摘　 要　 计算机辅助蛋白质分子理性设计在解决化学及生物学重要问题中被证实十分有效。 在NOR 能型一氧化氮还原酶( NOR ), 所设计的NOR 蛋白质模型— — — Fe B Mb 一年后被天然NOR 的晶体结构所证实。 机分子模拟, 获得Mb 处于双组氨酸配位的非天然状态的原子层次结构信息, 而这些信息很难通过实验方法来获得。 计算机辅助蛋白质分子理性设计的广泛应用将会为生物体系提供更深刻的内涵。

关键词　 肌红蛋白　 一氧化氮还原酶　 金属结合位点　 分子设计　 分子模拟

中图分类号: O614; Q554; O629. 7　 文献标识码: A　 文章编号: 1005⁃281X(2012)05⁃0784⁃06 本文综述了设计Fe B Mb , I107E Fe B Mb 以及Fe B Mb ( ⁃His ) 的研究过程及其设计合理性, 评述了通过使用计算本身三维结构未知的情况下通过计算机分子模拟, 使用肌红蛋白( Mb ) 作为蛋白质分子模型, 设计了结构功

Computer⁃Aided Rational Protein Design :

From Myoglobin to Nitric Oxide Reductases

(1. School of Chemistry and Chemical Engineering, University of South China, Hengyang 421001, China;

(2. State Key Laboratory of Coordination Chemistry, Nanjing University, Nanjing 210093, China) Abstract 　 Computer⁃aided rational protein design was demonstrated to be effective in addressing important

Lin Yingwu 1, 2∗∗

issues in chemistry and biology. With computer simulation, a structural and functional nitric oxide reductase (NOR) was successfully designed using myoglobin (Mb) as a protein model, which was accomplished at the time Fe B Mb, was confirmed by an X⁃ray structure of native NOR one year later. The progress and rationalities of design of Fe B Mb, I107E Fe B Mb, as well as Fe B Mb(⁃His), were reviewed herein. The use of molecular simulation to

with no three dimensional structure available for NOR itself. More importantly, the designed NOR protein model, obtain atomic structural information on Mb in a non⁃native state with bis⁃Histidine coordination was also highlighted, as the information was otherwise difficult to obtain experimentally. The general application of computer⁃aided rational protein design will provide deep insight into biological systems.

Key words 　 myoglobin; nitric oxide reductase; metal⁃binding site; molecular design; molecular simulation

2　 Myoglobin: an ideal scaffold for protein molecular 3　 Nitric oxide reductase: both a chance and a

design

Contents

1　 Introduction

　 　 收稿: 2011 年9 月, 收修改稿: 2011 年12 月

　 ∗ 国家自然科学基金青年基金项目(No. 21101091)、 南京大学配位化学国家重点实验室开放基金项目、 湖南省自然科学基∗∗Corresponding author　 e⁃mail:linlinying@ hotmail. com

金青年基金项目(No. 11JJ4017) 和湖南省教育厅青年基金项目(No. 11B105) 资助

第5 期林英武　 计算机辅助蛋白质分子理性设计: 从肌红蛋白到一氧化氮还原酶·785 　 ·

4　 Exploring challenge for unknown protein molecular areas: ongoing design molecular design

of protein 5　 1　 Conclusion 引言

and outlook

通过蛋白质分子理性设计模拟天然蛋白质结构与功能, 不但可以揭示在研究复杂天然蛋白质时容易被忽略的隐藏结构特征, 而且可以创造出新颖的具有生物工程与医药前景的蛋白酶分子, 是化学生物学领域一项长期追求的目标, 这一过程也最终检验我们对蛋白质的认识程度[1] 理性设计具有一定的挑战性, 这一领域在近。 尽管蛋白质分子10 年依

然取得了很大的进展, 这要归功于计算生物学与结构生物学的发展, 其中计算机辅助蛋白质分子设计发挥着不可忽视的作用[2—10]

子设计从结构方面模拟天然蛋白分子已经报道数。 尽管通过蛋白质分

年

[11—13]

到最近才见报道

, 但从功能方面成功模拟天然蛋白分子[14, 15]

拟应用到既从结构又从功能双方面模拟天然蛋白分。 而成功地将计算机分子模

, 直

子的开创性工作, 则是由作者与相关成员在美国伊利诺伊大学香槟分校。 利用肌红蛋白Yi ( myoglobin, Lu 教授课题组所完成的研究

[16]

子框架, 成功设计与构建了结构及功能型一氧化氮Mb) 作为蛋白分

还原酶(nitric oxide reductase,NOR), 而且当时还没有天然NOR 晶体或溶液结构的报道。 这一研究成果在一年。

以后被天然NOR 晶体结构的报道所证实

[17]

本文着重综述NOR 分子设计思路及相关进展, 探讨如何利用蛋白质分子框架, 结合计算机分子模拟, 理性设计与模拟复杂天然蛋白质, 解决生物体系中没有解决的问题, 或者通过研究天然蛋白质难以解决的问题; 如何超越天然蛋白的局限, 设计新型蛋白质分子; 以及如何利用计算机分子模拟, 获得通过实验方法难以获得的蛋白质结构信息, 进而拓展计算机辅助蛋白质分子理性设计在生物体系中的应用。

2　 肌红蛋白院蛋白质分子设计的理想框架

(heme) 肌红蛋白基因工程和蛋白质工程获得高纯度蛋白等优点辅基组成Mb , 具有分子量小由153 个氨基酸和一个血红素

、 稳定性高、 易通过

, 长期以来备受研究者的青睐, 广泛作为蛋白质分子框架, 用来研究蛋白质特别是血红素蛋白结构与功能

关系[1, 18—32] 子。 Mb 的生物功能是贮存和运输氧分NO Xe , 结合位点在蛋白质分子内分布有一定体积的空穴和CO) 迁移途径)( 图1a 如( 如氙

[33] [34] 。 ), 这些空穴的存在形成气体小分子, 也为( O Mb

2 ,

结合其它有机物或药物小分子提供了可能。

目前, 基于Mb 的蛋白质分子设计研究[1, 18—32]

主要包括:(1) 通过对Mb 活性中心进行适当的修饰与调整( 如氨基酸定点突变), 改变其微环境, 可以实现Mb 由氧载体蛋白向具有生物催化功能的血红素蛋白转变, 如过氧化物酶( peroxidase)、 过氧化氢酶( catalase)、 血红素加氧酶( heme oxygenase,HO) 和细胞色素P450( cytochrome P450) 等;(2) 通过活性中心氨基酸定点突变与血红素化学修饰相结合, 特别是heme 丙酸根的化学修饰, 提高Mb 的催化效率和对底物分子的选择性, 以及对Mb 进行分子自组装;(3) 通过引入与heme 化学结构类似的金属配合物如M⁃salen / salophen ( M: Fe、Cr、Mn 等), 与脱辅基Mb(Apo⁃Mb) 进行体外重组, 构建催化性能优越的人工金属蛋白酶分子;(4) 通过人工金属结合位点的理性设计, 实现Mb 向其它类型的血红素蛋白酶, 如锰过氧化物酶( manganese peroxidase) 和血红素⁃ 铜氧化酶( heme⁃copper oxidase, HCO) 结构及功能的转变等。

与一般血红素蛋白只具有heme 辅基不同的是,HCO 活性中心除heme 外, 还有与3 个组氨酸进

行配位的铜离子( 称为Cu 心, 其功能是将O B ), 形成Fe⁃Cu 双金属中用。 如何利用蛋白质分子框架2 还原为H 2 O, , 在呼吸中起关键作设计这样的活性中心结构, 无疑具有一定的挑战性。 美国伊利诺伊大学香槟分校Yi Lu 教授及其课题组成员通过将抹香鲸肌红蛋白( sperm whale myoglobin,swMb) 的活性中心( 图1b [35] ) 与HCO 结构作仔细比较, 进而通过Leu29 计算机模拟及实验研究发现和Phe43 突变成His, 再加之, 若将Mb heme 活性中心的

本身的远一系列光谱结果证实( 端配体称为Cu His64, 在所得到的突变体F43H Mb

B Mb) 分子中,Cu , 活性中心即存在L29H / 3 个His。

点可以结合一个Cu 2 + ( 运B Mb 在设计的金属结合位d 2 + = 对于9 μM) [36] 示。 进一步研究表明,Cu Cu , 如图1c 所其还原具有重要的作用[37] 。 不够完美的是B Mb 结合O 2 及在结合Cu 2 + 后, 称为Cu(Ⅱ)⁃Cu B Mb, 表现出一定的

,Cu B Mb heme 血红素加氧酶转化为胆绿素HO 的催化活性verdoheme , 后者将辅基血红素

[37] 。

图1　 基于肌红蛋白理性设计的蛋白质分子模型及天然一氧化氮还原酶NOR:(a) 肌红蛋白分子内空穴[33] ,( b) 肌红蛋白

3K9Z [16] ),(e)I107E Fe B Mb( 蛋白数据库编码3M39 [45] ),(f) 天然NOR( 蛋白数据库编码3O0R [17] ),(g)Fe B Mb(⁃His)( 蛋白数据库编码3MN0 [51] ) 氰基桥连Cu(Ⅱ) 和血红素Fe(Ⅲ) 和(h)Fe B Mb(⁃His) 双组氨酸配位模拟结构[52]

血红素活性中心结构( 蛋白数据库编码1JP6 [35] ), ( c) Cu B Mb ( 未发表的晶体结构), ( d) Fe B Mb ( 蛋白数据库编码

Fig. 1　 Rationally designed protein models based on myoglobin vs native nitric oxide reductase ( NOR): ( a) cavities in Mb [33] , 3K9Z [16] ), (e) I107E Fe B Mb (PDB entry 3M39 [45] ), (f) native NOR (PDB entry 3O0R [17] ), (g) Fe B Mb(⁃His) (PDB entry coordination [52]

(b) heme active site of Mb ( PDB entry 1JP6 [35] ), ( c) Cu B Mb ( unpublished X⁃ray structure), ( d) Fe B Mb ( PDB entry

3MN0 [51] ) with a cyanide bridging Cu( Ⅱ) and heme Fe( Ⅲ), and ( h) the modeling structure of Fe B Mb(⁃His) with bis⁃His

3　 一氧化氮还原酶院蛋白质分子设计的机遇与挑战

　 　 一氧化氮还原酶的生物功能是催化生物体内NO 还原为N 2 O (2NO + 2H + + 2 e - __ → N 2 O + H 2 O), 在生物体系N 2 循环中起重要的作用[38] 。 由于NOR 是一种膜结合蛋白, 由多个结构域组成, 包含多个血红素辅基, 蛋白稳定性差, 分离纯化困难, 同时具有复杂的光谱学特征, 限制了对其深入研究, 直到2010 年底, 还没有天然NOR 晶体或溶液结构的相关报道[17] 。 氨基酸序列分析显示NOR 与细胞的同源性, 后者属于HCO 家族, 具有Cu B ⁃heme Fe 的双金属中心, 生物功能是催化O 2 还原为H 2 O( O 2

应中发挥重要作用, 如传递质子[41] 。 一方面, 模拟Fe B 仍有7 Å, 提示没有直接配位的可能性[40] ; 另一配位,NO 催化还原反应会经历能量最优化的途结构显示, 最近的Glu ( E267) 其侧链O 原子距离

方面, 量子力学理论研究表明, 如果Glu 参与Fe B 的

径[42] 。 这种由于天然蛋白的复杂性所出现的研究争议, 给蛋白质分子理性设计提供了一种机遇, 同时也是一种挑战, 即是否可以通过蛋白质分子理性设计, 构建类似NOR 的活性中心, 来探讨其结构与功能关系, 从而克服研究天然NOR 的局限性。 Cu B Mb, 在结合Cu 2 + 后还会表现出一定的NOR 催

研究[43] 表明, 作为HCO 分子模型而设计的

色素c 氧化酶(cytochrome c oxidase, C c O) 具有很高

化活性, 如同有些C c O 蛋白也表现出一定的NOR

验显示NOR 含有非血红素铁离子, 称为Fe B [38] 。 通过计算机辅助同源蛋白分子建模[40] , 研究者发现在NOR 的Fe B 结合位点附近存在有2 个保守的氨基

+ 4H + + 4 e - __ → H 2 O) [39] ; 与C c O 不同的是, 实

酸Glu, 它们或者参与Fe 的配位, 或者在NO 还原反

Glu 有可能直接参与Fe 2 + 的配位。 因而, 要设计Fe B

位点的不同性, 而且暗示天然NOR 活性中心保守性

子模型。 这些结果从另一方面也说明了Cu B 与Fe B

出NOR 活性, 因而Cu B Mb 不能作为真正的NOR 分

Fe 2 + 的证据, 而且Cu B Mb 在Fe 2 + 存在条件下表现不

催化活性[44] 。 然而, 实验不能提供Cu B Mb 结合

第5 期林英武　 计算机辅助蛋白质分子理性设计: 从肌红蛋白到一氧化氮还原酶·787 　 ·

位点, 一种可能是在Cu Glu, 使其能够参与Fe 2 B 位点附近适当的位置引入+ 的配位而对蛋白的整体结

构产生很大的影响。 在进行实验之前, 我们通过计算机模拟发现, 若将Cu B 结合位点附近的Val68 突变成Glu, 则可能达到上述的实验目的。 进而实验研究证实了计算机模拟与实验结果的一致性。 一系列光谱( 紫外⁃ 可见UV⁃vis, 电子自旋EPR) 结果显示,Cu Fe 2 + B Mb 的突变体V68E( 称为Fe B Mb) 能够结合为1. 。 72 最直接的证据是来自晶体结构数据Å), 如图1d 所示。 可以看出, 其中( 分辨率E68 侧链的一个O 原子直接参与Fe 2 + 的配位。 而且, 更为

重要的是,Fe 催化活性。 因B Mb 而在结合Fe 2 + 后表现出一定的NOR

NOR 分子模型, 这一研究发表于, Fe B Mb 可看作结构2009 功年能12 型月的天然

Nature [16] 又从功能双方面成功模拟天然复杂蛋白酶分子, 是第一例使用计算机辅助设计, 既从结构

的重要性Fe , 而分子建模结果显示Fe 。

B Mb 的研究揭示了B 位点附近保守性Glu

,Fe 有2 个保守性Glu, 倘若其中之一直接参与B 位点附近存在

Fe 2 + 的配位( 如Fe 可能在质子传递中有重要作用B Mb 中所设计的E68), 。 因此则另一个, 为了进一步Glu 有

优化Fe 分子内、 B 结合位点, 我们通过计算机模拟, 在Fe Fe B Mb

Ile107。 研究B 结表合明, 位将点Ile107 外围, 突找变到成了合Glu, 适的突位变点I107E Fe 体构显示,E107 B Mb 的整体结构没有很大的扰动不直接参与Fe 2 + 的配位, 与。 Fe 晶体结2 + 之间

存在桥连的水分子( 图1e), 形成氢键网络, 显示与理性设计一致,E107 有可能在质子传递中发挥重要作用。 而且, 实验结果表明,I107E Fe 性是Fe B Mb 的催化活

因而, 相对于B Mb 的Fe 2 倍, 进一步说明了E107 的功能性。 更好模型, 这一B 研Mb,I107E 究成果发Fe 表B Mb 于2010 是天然年NOR 5 月的的PNAS [45] 作者在Science 。 2010 上年发12 表月了, 分日本研究者辨率为2. Hino 7 Å 的及其合天然比NOR , 这一研究晚了整整一年晶体结构[17] 。 与我们发表于。 更令人兴奋的是Nature 的工作相

, 这一

研究证实了我们通过计算机辅助设计的I107E Fe B Mb 和结构显示Fe B ,Fe Mb 蛋白模型的正确性具有3⁃His⁃1⁃Glu 结合模式。 天然NOR , 另一个晶体Glu 不直接参与B Fe 2 + 的配位, 而是形成氢键网络, 如图1f 所示, 与I107E Fe 研究在另一方面也反映出分子建模B Mb 活性中心很类似[40] 的可靠性值

。 这一得进一步商榷。 同时, 在一定程度上支持了量子力学理论计算的结果[42] I107E Fe 。

活性中心保守性B Mb Glu 的研究不但可以揭示天然的功能, 而且还可以研究NOR NOR

金属中心Fe 到的有些C c B 的功能。 一个有趣的现象就是上述提

C 题就是c O 的金属中心不是O 也表现出一定的, 如果NOR 金属中心Fe NOR 催化活性, 但B , 而是Fe Cu B 。 一个延伸的问被Cu 2 + 取

代后,NOR 能否继续表现出NOR B 的Fe 2 + 催化活性? 这一问题不能通过研究天然NOR 蛋白来解决, 这是因为天然NOR 在分离纯化后, 其Fe 2 + 结合很稳定, 使用化学的方法将其除去会破坏蛋白的整体结构, 实现Cu 2 + 对Fe 2 + 的置换。 使用I107E Fe , 则可以解决这一难题。 B 这一蛋白Mb 作为无法蛋白质分子模型是在包涵体中分离纯化得到protein), , 。 为脱辅基蛋白在进行体外heme ( Apo⁃ 组后, 其Fe 即不包含heme 辅基重

有金属离子B 金属结合位点被水分子所占据, 不结合。 此时, 可以通过金属离子滴定的方法,

使其结合不同的金属离子, 如Fe 2 + ,I107E Fe 、Cu 2 + 和Zn 2 + 等。 晶体结构显示后, 会出现不同的配位状态B Mb ; 在结合不同金属离子I107E Fe 催化实验结果显示,

B Mb 而结合在结合Zn 2 Fe 2 + 或Cu 2 + 后均表现出NOR 催化活性, + 或水分子状态下没有催化活性, 说明Fe 金属离子对于B 位点结合有氧化还原价态可逆变化的

NOR 催化活性至关重要, 也进一步说明从NO 到N 是来自heme 2 中O 心还原反应所需要的Fe, 另一个是来自2 个电子Fe , 一个

心[45] 。 Fe B 金属中步用于研究天然B Mb 和NOR I107E 催化活性分子机制的其它方Fe B Mb 分子模型还可进一面, 如NO 分子与heme Fe 以及non⁃heme Fe 合等[46] 研究天然蛋白所不具有的优势。 由此可见, 使用蛋白质分子框架模型有着B 的结[47] 源摇探索未知领域院蛋白质分子设计的继续深入

。

　 计的是具有　 在Fe B Mb [3⁃His⁃1⁃Glu] 和I107E Fe B 配位结合的Mb 分子模型中non⁃heme , 我们设Fe 结合位点。 综观自然界中其它含铁的蛋白酶分子, B

有很多是具有[2⁃His⁃1⁃Glu / Asp] 的结合域, 而并非必须是3 个His 配体[48,49] 列分析显示, 在NOR 蛋白家族中。 更有趣的是, 有一种独特的醌, 基因组序氧化His NOR( quinone⁃oxidizing NOR, gNOR), 其3 结构仍没有相关研究报道配体中有一个配体被[50] Asp 催化活性的基本结构单元, 以及探讨将自然界常见

。 所替代为了探讨支持, 但其具体的个NOR

的non⁃heme Fe 可能性, 我们对B 结合域引入到NOR 分子设计中的Fe 计B Mb 进行了进一步分子理性设

His29, 。 通过计算机分子模拟将其突变成所Glu, 得而将, 我们选择了到的Glu68 突变体突变还原为野生Fe B Mb 中His), 型蛋白即与中的Fe Val, 称为Fe B B Mb 相比, 减少了一个实His 验研配体究表, Mb 具有(⁃ Fe [2⁃His⁃1⁃Glu B Mb(⁃His) ] 可以结合金属结Fe 合2 中+ 或心Cu 。 2 + 明, NOR 结合催化活性。 此外, 我们还得到了, 而且均表现出Fe B Mb(⁃His)

(Ⅱ)⁃CN Cu 2 + 后氰基桥连双金属中心的晶体结构-

所示。 这一研究发表于⁃Fe Mb(⁃His), 2010 分辨率为年6 月的1. 65 JACS Å, 如图,Cu

B [51] 天Fe 然NOR 晶体结构的报道也要早出半年。 , 1g

比与gNOR B Mb 在提供了理想的蛋白分子模型一样,Fe B Mb(⁃His) 为研究自然界中未知的Fe B Mb(⁃His) 的研究中。

趣的实验现象, 即在Fe 处于双组氨酸(bis⁃His) B 没有结合金属离子时, 我们还发现一个有

, 蛋白配位状态状态; 而当Fe Fe , 只有很少部分是处于如同Fe B Mb 或I107E B Mb 的单组氨酸配位

B Mb(⁃His) 结合金属离子如Cu 2 +

后,

蛋白质发生构象变化, 原本与heme 配位的His 变化到与( - His) Cu

2 +

处于配位bis⁃His ( 图1g)。 配位状态的晶体结构我们曾试图获得, 但未能Fe B Mb

成功, 原因可能是由于Bis⁃His 配位状态存在有少量的单组氨酸配位状态, 无法获得单一的晶体。 为了

研究Fe 征, 我们利用计算机分子模拟B Mb(⁃His) 处于这种非天然状态的结构特

, 获得了从实验中很难获得的结构信息。 计算机分子建模及分子动力学模拟揭示His64 态, 而且形成氢键作用( 图1h), 在Bis⁃His His43 所在结构区域表现出很大的柔韧性, 近一步稳定配位状态时Bis⁃His ,Glu29 配位会与状,

暗示在蛋白分子折叠中发挥重要的作用。 到目前为止, 仍然没有Mb 处于这种非天然状态的晶体结构或溶液结构的报道, 因而这一研究可以为Mb 正确与错误折叠提供理论信息。 这一研究发表于2011 年3 月的Proteins [52] 日, 比天然NOR , 最早网络发表时间是晶体结构的网络报道时间2010 年(2010 11 月年5

域的研究如同一场接力赛11 月25 日) [17] 早出20 天。 由此也可以看出, 相近领

, 如何赢得比赛, 关键在于选择正确的研究思路和正确的研究方法。

作为从Mb 到NOR 分子理性设计的延伸与拓展, 我们实验室正在设计与构建N 血红素蛋白酶2 循环中的另一种

NiR), 催化NO , 亚硝酸盐还原酶( nitrite reductase, 2

-

还原为NO( NO

2

- + 2H

+

+ e -

__ →

NO + H 2 O)。 目前, 已经取得了初步研究进展[57] 事实上, 在N 的产物NO 正是NOR 的。 底物, 因而用同一种蛋白来模拟两种相互关联的蛋

2 循环中,NiR 白酶分子具有十分重要的意义与应用价值。 缘摇结论与展望

利用Mb 作为蛋白质分子框架模型子模型Fe Cu B B Mb, 再到Mb, gNOR 到NOR 分子模型分子模型Fe B Mb(⁃His) Fe , 从HCO 分

B Mb 和I107E

计中, 计算机模拟发挥着至关重要的作用, 推进了整

的理性设

个研究进程的发展, 也最终赢得竞争性研究的胜利。

比较Cu 的突变(V68E), B Mb 和Fe 然而关于B Mb 的差别Cu , 仅仅在于一个氨基酸B Mb 研究的报道[36] 和Fe 计算机辅助蛋白质分子理性设计道路的曲折和艰辛B Mb 研究的报道[17] 时间间隔将近10 年, 说明探索

。 尽管如此, 从Mb 到NOR 的研究历程, 使我们认识到了计算机辅助蛋白质分子理性设计的强大功能。

值得强调的是, 国内开展蛋白质分子设计研究已近10 年, 如复旦大学黄仲贤教授和谭相石教授课题组在计算机辅助蛋白质分子理性设计方面也取得cyt 了卓越成就b , 分别利用细胞色素b 5 ( cytochrome b 5 ,

氧化物酶催化活性的蛋白酶分子5 ) 和Cyt c 作为蛋白质框架, 成功设计出具有过[53—55] 出Cyt c ⁃Cyt P450 杂合体蛋白, 表现出, Cyt 而且还设计c 不具备的单加氧酶催化活性[56] 的蛋白质分子框架, 计算机辅助蛋白质分子理性设

。 由此可见, 通过选择合适计可广泛用于研究其它复杂天然蛋白特别是膜蛋白的结构与功能, 以及创造出新颖的蛋白酶分子, 克服天然蛋白质结构与功能的局限性。 这是生物无机与蛋白质化学的新兴领域, 有助于我们从分子水平进一步认识复杂的天然生物体系, 获得通过研究复杂天然蛋白质本身所无法获得的内在信息。

致谢: 美国伊利诺伊大学香槟分校Yi Lu 教授为作者提供博士后研究, 得到美国健康研究院NIH 基金的资助(GM062211)。

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第5 期

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