培养基的选择-整理

培养基的选择和优化（初稿）

一、培养基的概念：culture medium

是人们提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物需要的多种营养物质的混合物。其成分和配比对微生物的生长、发育、代谢产物的合成，甚至对于发酵工业的生产工艺都有很大的影响。

二、用途和分类：

用途：筛选菌种、保藏菌种、检验杂菌、培养种子、发酵生产。

分类：

1.天然：用化学成分还不清楚或化学成分不恒定的天然有机物配制。 例：牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基。

合成：化学成分完全了解的物质配制而成的培养基。

例：查氏培养基、高氏 1号培养基

复合（半合成培养基）：天然成分+化学试剂

2.1.5%--3.0%，

常用来微生物的分离、鉴定、活菌计数及菌种保藏。

半固体： 琼脂0.3%--0.5%，观察运动特征，分类鉴定

液体： 不加任何凝固剂，

大规模生产及在实验室进行微生物的基础理论和应用方面的研究。

3.按实验目的：基础：适合大多数微生物生长的培养基，如牛肉膏蛋白胨培养基

加富：在基础培养基中加入某些特殊营养物质制成的一类培养基。如高糖培养基

选择：在培养基中加入相应的特殊营养物质或化学物质，抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物的生长。如麦康凯培养基

鉴别：用于鉴别不同微生物的培养基，微生物产生某种代谢产物，与培养基中的化学物质发生化学反应，产生明显的特征变化，如EMB培养基

三、成分来源：

（人工配制的、适合微生物生长、繁殖或产生代谢产物的营养基质 ，是微生物学研究和微

生物发酵生产的基础。任何培养基都应具备微生物所需要的六大营养要素，且其间的比例合适。）

营养: 有机体吸取和利用营养物质的过程。

营养物质: 微生物为了生存就必须从环境中吸取各种物质以合成细胞物质、提供能量以及在新陈代谢中起调节作用。这些物质就称为营养物质。

微生物的营养物质：水、碳源、氮源、无机盐、生长因子。

1、水 ：维持细胞的膨压和作为生化反应的溶剂。

a.水是构成微生物细胞的重要物质，其含量约占微生物细胞的70%-90%。细菌75%-85%，酵母菌70-90%，丝状真菌85-90%，芽胞50%左右。

b.溶剂：生化反应、物质的吸收。

c.比热大。

d.供氢体。

一般情况下，配制培养基时，可用自来水、井水等天然水，但在测定微生物某些生理特性、合成产物数量以及其他要求精确性高的试验时，则必须采用蒸馏水甚至重馏水，以保证结果的准确。

2、碳源 （carbon resource）

概念：凡是能够被微生物用来构成细胞物质或代谢产物中碳素来源的营养物质，都称为碳源。碳源是组成微生物细胞的主要元素，也是异养微生物生命活动的能源。 碳素养料在微生物细胞中含量最稳定,约占细胞干重的50%。

可作为培养基的碳源物质很多，最常用的碳源为葡萄糖，因为能利用葡萄糖的微生物最多，其他糖类如蔗糖、麦芽糖、甘露醇、淀粉、纤维素，以及蛋白质、脂肪、有机酸、醇类、烃等都可作为培养不同微生物时选择使用的碳源。自养型的微生物以CO2作为碳素营养在细胞内合成有机物质，故不需要向它们提供现成的有机碳化物作为碳素营养 工业发酵中常用作碳源的有:米粉、玉米粉、淀粉、饴糖、红薯粉等。

实验室常用作的碳源的有：葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉、甘油、甘露醇、有机酸等。 碳源的生理功能：

1、作为构成细胞物质的C素骨架；

2、提供机体生命活动所需要的能量。

3、氮源 (nitrogen resource)

概念： 凡是能够被微生物利用来构成菌体物质或代谢产物中氮素来源的营养物质,都称为氮源。氮素是组成细胞蛋白质的主要成分,也是构成所有微生物细胞的基本物质。 某些固氮细菌可利用分子态氮素,其他微生物都需要化合态氮作为氮素养料。 化合态氮有无机氮和有机氮两类,无机氮有铵盐、硝酸盐等。

大多数真菌利用铵盐以及硝酸盐；许多细菌能利用铵盐,但对硝酸盐则不利用。 有机氮有蛋白胨、牛肉膏或牛肉浸汁、各种氨基酸等,此外,豆芽汁、酵母膏等也是常用的有机氮源。

一些含蛋白质较多的农副产品如豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼等常可作为培养放线菌的氮源，又如鱼粉、蚕蛹等，也可作为培养某些微生物的氮素养料。

N源物质主要用做微生物合成含氮有机物质，一般不用做能源。少数自养菌以NH4+作为氮源和能源。

氨基酸既做碳源，又可以做氮源

4、无机盐类（矿质营养元素）

磷、硫、钾、钙、镁、铁等，一般采用含有这些元素的盐类即可。当用天然的植物性或动物性物质制备培养基时，往往不必加这些盐或只加一部分，因为它们本身含有这些元素。除某些特殊生物的特殊需要外，一般在配制培养基时，不加微量元素，因为在营养物质

及天然水中已含有一些可供微生物的微量元素。

生理功能：

1、参与酶的组成：辅助因子或辅酶；

2、维持细胞结构的稳定性：Mg2+与核糖体；

3、微生物生长的能源物质：Fe2+，S；

4、控制细胞的氧化还原电位；

5、调节和控制细胞的渗透压平衡。

6、酶的激活剂或抑制剂。

5、生长因子

概念：是一类需要量很少却能够促进微生物生长的小分子有机物质的总称。 核苷类（嘌呤、嘧啶）；

维生素；

氨基酸

野生型（wild type）:不需生长素而能够在基础培养基上生长的菌株。

营养缺陷型（auxotroph）：自发或诱导突变后需要特定生长物质才能生长的菌株。常用于遗传和代谢的研究工作中。

6、前体和产物促进

发酵工业生产中，除必须营养成分以外，考虑到代谢控制，添加某些特殊功用的物质，调节产物的形成，而并不促进微生物的生长，目的在于大幅度提高发酵产率，降低成本。

前体物质：是指当添加到发酵培养基中的某些化学物质基本上不改变其分子结构而直接 进入产物中的小分子物质，从而在一定条件下控制产物的合成方向和提高产量。 在发酵中添加前体物质将有利于产物的合成和显著提高产量，如苯乙酸及其衍 生物被认为是青霉素的前体物质。

大多数前提物质具毒性，生产中采用少量多次的流程。

诱导物（产物促进物）：目前工业用微生物酶多数为诱导酶，如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶

等。

诱导物的存在能大大强化诱导酶的生物合成。酶的正常底物或底物的类似物都 可作为诱导物。在各种微生物酶的发酵培养基中必须加入诱导物，例如淀粉、 糊精或麦芽糖是淀粉酶或糖化酶的诱导物。只有添加这些物质的培养基，才能 获得高产。

四、发酵生产中常用的培养基有哪些？

往往根据生产的流程和作用：斜面培养基、种子、发酵、摇瓶。

1.斜面培养基：作用：这是供微生物细胞生长繁殖用的，包括细菌，酵母等的斜面培养基以及霉菌、放线菌生孢子培养基或麸曲培养基等。这类培养基主要作用是供给细胞生长繁殖所需的各类营养物质。

特点：富含有机氮源，少含或不含糖分。有机氮有利于菌体的生长繁殖，能获得更多的细胞。 对于放线菌或霉菌的产孢子培养基，则氮源和碳源均不宜太丰富，否则容易长菌丝而较少形成孢子。斜面培养基中宜加少量无机盐类，供给必要的生长因子和微量元素。

2.种子培养基（包括摇瓶种子和小罐种子培养基）：

必须有较完全和丰富的营养物质，特别需要充足的氮源和生长因子。

种子培养基中各种营养物质的浓度不必太高。供孢子发芽生长用的种子培养基，可添

加一些易被吸收利用的碳源和氮源。

种子培养基成分还应考虑与发酵培养基的主要成分相近。

3.发酵培养基：发酵培养基是发酵生产中最主要的培养基，是决定发酵生产成功与否的重要

因素。

五、培养基的设计和优化：

配制原则：“目的明确，营养协调，理化条件适宜，经济节约”

1.对菌体生长与产物相偶联的发酵类型，充分满足细胞生长繁殖的培养基就能获得最

大的产物。

2.对于生产氨基酸等含氮的化合物时，它的发酵培养基除供给充足的碳源物质外， 还应该添加足够的铵盐或尿素等氮素化合物。

3.发酵培养基的各种营养物质的浓度应尽可能高些，这样在同等或相近的转化率 条件下有利于提高单位容积发酵罐的利用率，增加经济效益。

4.发酵培养基需耗用大量原料，因此，原料来源、原材料的质量以及价格等必须予以

重视。

细菌（常用牛肉膏蛋白胨琼脂）；放线菌（常用高氏一号）；真菌（PDA）。

PH, 水活度，氧还电位。

以粗代精，以野代家，以废代好，以简代繁，以氮代朊，以纤代糖，以烃代粮，以国代进

1.必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分。

2.有利于减少培养基原料的单耗，即提高单位营养物质所合成产物数量或最大产率。

3.有利于提高培养基和产物的浓度，以提高单位容积发酵罐的生产能力。

4.有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期。

5.尽量减少副产物的形成，便于产物的分离纯化。

6.原料价格低廉，质量稳定，取材容易。

7.所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响，以利于提高氧的利用率，降低能耗。

8.有利于产品的分离纯化，并尽可能减少产生“三废”的物质。

培养基的优化设计：

① 根据前人的经验和培养基成分确定时一些必须考虑的问题，初步确定可能的培养基成分； ② 通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分；

③ 当培养基成分确定后，剩下的问题就是各成分最适的浓度，由于培养基成分很多，为减少实验次数，常采用一些合理的实验设计方法。 （正交，拉丁方等）

从实验室到工业大生产，过程上转变，参数变化？

不同之处：

1.消毒方式不同：摇瓶是蒸汽静态加热；发酵罐是直接蒸汽动态加热，部分是直接和蒸汽混合，影响培养基的质量，体积，PH，透光率等指标。

2.接种方式不同：摇瓶是吸管加入，发酵罐是火焰直接接种（还有其它方式），接种时，菌株的损失和菌种的适应特性等。

3.空气的通气方式不同：摇瓶是表面直接接触，发酵罐是空气混合接触，其中CO2的浓度和氧气的溶解度情况不同。

4.蒸发量不同：摇瓶的蒸发量不好控制，湿度控制好的话，蒸发量会少，发酵罐蒸发量大，但可以通过补料来解决。

5. 搅拌方式不同：摇瓶是以摇转的形式进行，对菌株的剪切力较小；发酵罐是直接搅拌，剪切力影响较大。

6.pH控制方法不同：摇瓶一般加入碳酸钙和间断补料控制；发酵罐直接加酸碱，方便。

7.温度控制不同：摇瓶是空气直接接触或者热传控制；发酵罐是蛇罐或者夹套水降温控制，应注意降温和加热的影响。

8.染菌的控制方法不同：发酵罐可以根据染菌的周期和类型采取一定的措施。摇瓶直接处理。

9.检测方法不同：摇瓶量少，不能方便的控制和检测；发酵罐可以取样或者仪表时时检测。

10.原材料不同：发酵罐廉价粗放，工艺控制和摇瓶有很大区别。

摇瓶和发酵罐有很大区别，摇瓶优化是培养基设计的第一步，一般用再菌种的筛选，以及作为反应器水平上研究的基础，从反应器水平的优化可作为最终发酵基础配方。

六、培养基的灭菌和消毒

常用的方法有：

（一）火焰灭菌

将物品直接放在火焰上进行烧而达到灭菌的方法。如接种环、接种针、玻璃刮铲等灭菌。

（二）干热高温灭菌

用于耐高温而干燥的物品的灭菌，不能用于培养基等的灭菌。160-170℃下保温1-2小时。

（三）高压湿热灭菌

可用于所有耐温物品的灭菌。

高压锅中121℃保温30分钟。

2 0.1MPa、1kgf/cm、15磅保温30分钟。

对一些特殊培养基需要采取特殊的灭菌方法。

灭菌：用一些物理化学方法来杀死所有微生物的过程。

消毒：用一些物理化学方法来杀死病原微生物的过程。

防腐：用一些物理化学方法来抑制微生物生长的过程