共聚焦显微拉曼光谱的应用和进展1

共聚焦显微拉曼光谱的应用和进展

许永建, 罗荣辉, 郭茂田, 吴俊富, 李明玉

(郑州大学物理工程学院, 河南郑州　450001)

提要:介绍了共聚焦显微拉曼光谱的原理和优点, 总结了国内外运用该技术在肿瘤检测、公安与法学、文物考古等多个领域的最新应用和

进展, 并对其前景进行了展望。

关键词:显微拉曼光谱; 检测; 应用; 进展中图分类号:O433.4　　　　文献标识码:A　　　　文章编号:0253-2743(2007) 02-0013-02

The application and development of confocal R am an micro -spectroscopy

X U Y ong -jian ,LUO R ong -hui , G UO M ao -tian ,W U Jun -fu ,LI M ing -yu

(School of Physical Engineering , Zhengzhou University , Zhengzhou 450001)

Abstract :The principle and the advantages of the con focal Raman micro -spectroscopy was studied in this paper. The recent application and development of this technique in many fields such as malignancy detection ,archaeology was summarized and presented.

K ey w ords :Raman micro -spectroscopy ; detection ; application ; development

　　拉曼光谱属于分子振动光谱,1928年由印度物理学家拉曼(Raman ) 发现。拉曼光谱具有非破坏性和精细如“指纹”的分辨能力以及不受水的干扰等优点, 日益受到重视。共聚焦显微拉曼光谱不仅具有常规拉曼光谱的特点, 还有自己的独特优势。显微拉曼仪具有很好的空间分辨率, 样品分析时将入射光通过显微镜聚焦到样品上, 从而可以在不受周围物质干扰的情况下, 精确获得所照样品微区的有关化学成分体结构、。与其他传统技术相比, 用进展作一概述, 。

综上所述, 共聚焦显微拉曼光谱仪比传统的色散型拉曼光谱仪在分辨率、工作频率、、灵敏度和微量样品分析诸方面都有了很大提高, 。

1　共聚焦显微拉曼光谱的原理和优点

1. 1　原理

显微拉曼光谱技术是将拉曼光谱分析技术与显微分析技术结合起来的一种应用技术。拉曼光谱属于分子振动光谱, 每种物质的拉曼线可以有若干队, 每对线对应于物质的两个能级间差值(振动、转动或电子能量间的差值) , 所以能从分子水平上反映样品化学组成和分子结构上的差异。显微拉曼技术可将激发光的光斑聚焦到微米量级, 进而对样品的微区进行精确分析, 激光在样品上产生作用的确切部位, 可以通过CC D 鉴定仪和一个T V 监视仪, 清晰地显示出来, T V 屏幕, 可以选择有关分析所感兴趣的任何样品的任意部位, 整个分析鉴定过程, 都非常直观, 易于进行观察和控制。这对于肿瘤细胞间细微差异的检测、文物考古、公安法学中的痕量物质分析等而言, 是一个十分理想的手段。1. 2　优点

共聚焦显微拉曼光谱仪具有很好的空间分辨率, 利用共聚焦显微拉曼光谱可以得到样品体积很小和不同深度的光谱信息。典型的如RE NISH AW 显微拉曼光谱仪, 其空间分辨

μμ率好于1m , 纵向分辨率达2m 。它采用干涉窄带滤光片技

术, 实现了拉曼光谱二维直接成像, 可方便快捷地获得物质成分的微观空间分布; 使用计算机控制高精度XY Z 三维平台, 可实现逐点扫描, 获得高分辨率的三维Raman 图像。

共聚焦系统能够消除物镜自身产生的光谱。当入射光和散射光通过光学系统特别是通过显微镜的物镜时, 物镜材料的拉曼和荧光光谱会出现并叠加到样品的拉曼光谱上, 尤其是在检测高反射率的样品时。共聚焦系统主要给出聚焦

1〕

区域的光谱, 能避免物镜光谱出现〔。

共聚焦显微拉曼光谱仪有多个频率可供选择。但应注意, 在测试生物样品时, 入射光通过显微物镜把能量集中在一个微区, 因此必须采用低功率的激光以避免样品的热和光化学反应。

收稿日期:2006-07-20

作者简介:许永建(1978-) , 男, 郑州大学物理工程学院研究生, 光学专业, 激光医学方向。

目前国内已有不少利用显微拉曼光谱检测肿瘤的报道。恶性肿瘤组织和正常组织的蛋白质、核酸、脂肪等成份分子结构不同, 显微拉曼光谱能从分子水平上反映物质化学组成和分子结构上的差异, 是诊断肿瘤的理想方法。赵元2〕黎〔等给出了24例乳腺肿瘤组织病理片的显微拉曼光谱, 发现乳腺增生和纤维腺瘤细胞与癌变肿瘤细胞在1525cm -1附近、1610cm -1附近的拉曼峰-峰比有显著差异。I 1610/I 1525

3〕

有可能作为乳腺肿瘤细胞分类的准则之一。于舸〔等研究了人体正常和癌变乳腺组织的显微拉曼光谱特性, 发现癌变组织中核酸相对含量增加、主链结构发生变化; 蛋白质结构

β-折叠以及β-回折4种构同时呈现a -螺旋、无规则卷曲、

象特征, 其分子间的氢键近乎断裂, 蛋白质百年的松散和无序, 色氨酸残基的吲哚环呈现“暴露式”; 脂类含量减少。其研究表明, 显微拉曼光谱可以为乳腺癌变的生化机理研究以及活体诊断提供有力的实验依据。

肿瘤患者的生化反应对疾病辅助诊断有一定意义, 尤其是利用血液或血清的光谱来辅助诊断疾病, 因为血清使血小板和血细胞的生存环境, 它们的代谢物总是排泄在血清中,

4〕

其主要光谱在血液或血清的光谱上都有所反映。姚淑霞〔等报道了激光功率对血清显微拉曼光谱的影响方面的研究, 激光功率和抗凝素对血清的光谱影响较大, 血清不加抗凝素且使用低功率激光可以得到重现性、信噪比都较好的谱图。

〔5〕

葛向红等指出:在血清中加入不同剂量的癌细胞时, 随着癌细胞个数的降低, 吸收谱和荧光谱强度呈增加趋势, 但增加到一定程度时又开始下降; 正常血清的谱线强度明显较强。

6〕

在肿瘤的单细胞研究方面, 闫循领〔等率先进行了探讨。他们得到了结肠癌病人细胞的显微拉曼光谱, 发现均有构象不灵敏的苯丙氨酸的单取代环的伸缩振动谱线1002cm -1, 谱线强而半高宽较小, 且不易改变, 可作为生物细胞拉曼谱线的内标。白细胞拉曼谱线弱少, 红细胞拉曼谱线强而丰富, 且有一个吡咯环的C -N 呼吸振动谱带, 窄而强的1919cm -1的特征峰, 宽而强的1577cm -1、1560cm -1、1548cm -1, 这是其他细胞不具有的。腺癌细胞的拉曼谱线相对较弱, 许多谱线消失, 生长在不同部位的癌变细胞的荧光强度分布不同。通过这些特征拉曼谱线的不同, 为癌症的诊

7〕

断和治疗提供了有力的实验依据。闫循领等〔还测定了人血单个红细胞在不同激发光源下的共振显微拉曼光谱。谱线表明, 对782cm -1激发光源共振较强, 呈现强度大而半高宽小的尖锐谱线; 而在514cm -1激发光源下, 该两条谱线较弱。

19〕

谱中的荧光背景比粉末海洛因的小〔。研究表明显微拉曼技术对检测分析走私毒品以及其他痕量物质是一种极为有20〕

力的手段。刘国志等〔认为显微拉曼光谱技术有助于对参赛人员服用违禁药物的监测和分析, 他们对合成冰毒的重要化学原料麻黄素和冒充麻黄素来合成冰毒的左旋咪唑进行了拉曼无损测试分析, 发现它们以及甲基安非他明的三种拉曼光谱有较大区别, 可作为鉴别的重要依据。

此外, 显微拉曼光谱技术还广泛应用于生物化学和药物化学、宝石的鉴定、伪币的鉴别、矿物夹杂物、环境污染、催化剂的成分鉴别、材料非均匀性、产品结构的在位和无损检测等方面。

总之, 由于共聚焦显微拉曼光谱技术在微量分析测定中独具分离效果好、灵敏度高、设备简单、易于操作等诸多优势, 因此它将具有很大的潜力, 积极探讨它的应用, 具有极大现实意义。从近年来的报导可以看出, 显微拉曼光谱技术已经在肿瘤检测、文物考古、公安法学等领域得到广泛应用。有理由相信, 显微拉曼光谱技术将在越来越多的科学研究领域发挥重要的作用。

其它谱线, 高波数段(大于1350cm -1) 在514cm -1激发光源下谱线强度大而清晰; 低波数段(小于1350cm -1) , 对应782cm -1激发光源的拉曼谱线强而明显。这些实验结果, 可以为研究单个红细胞的结构、功能及进一步研究病变细胞的变异提供有力的实验基础。

8〕

此外, 刘刚〔等则采用显微拉曼光谱仪研究了低温冰箱冷冻保存时间对人体甲状腺组织、子宫肌瘤组织的拉曼光谱的影响。组织用磷酸缓冲生理液浸泡, 于-4℃保存(未冻) 10h , 测试其显微拉曼光谱; 测后将组织样品浸入磷酸缓冲生理液, 置于低温冰箱-30℃保存。分别于冷冻几天、十几天和六十天后, 取出解冻测试拉曼光谱。结果表明, 冷冻保存10天内对组织的拉曼光谱没有明显的影响。该结果对拉曼光谱研究人体组织具有指导意义。2. 2　国外进展

9〕

在皮肤癌研究方面,Choi 〔等采用共聚焦显微拉曼光谱研究了10例基底细胞癌切片, 结果发现, 共聚焦狭缝调节器能够使干扰拉曼信号的组织自身荧光剧减, 这点在Pham V. Huong 的论文中也曾提及。直接观察正常组织和基底细胞癌(BBC ) 组织的光谱差异是可行的, 这表明共聚焦显微拉曼光谱技术提供了一种诊断皮肤病的新颖方法。

10〕

在单细胞检测方面,Chan 〔等介绍的单细胞显微拉曼光谱方法可以区分人体不确定的淋巴细胞和发生转移的Jurkat 与Raji 淋巴细胞。这种单细胞拉曼光谱提供了一种高重复性的细胞类型的生物分子指纹特征分析方法。其特征峰主要是不同种类的DNA 和蛋白质的贡献, 分正常的和发生转移的淋巴细胞有98. 3%的灵敏度, 有2。

11〕

K rishna 〔FT -红外拉曼结合技术在混合型细胞中随机鉴别出一种细胞类型。他们发现MCF7和H L60间的光谱差异比MCF7和Mes -sa 细胞间的差别显著得多, 这说明细胞不同区域其拉曼信号存在不同, 他们又进行了样品光谱物质主要成分分析检验, 对混合型细胞中的单细胞类型的分析结果给出了合理的解释。

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3　共聚焦显微拉曼光谱在文物考古方面的

应用

12〕

　　在文物考古方面,Vandenabeele 等〔用显微拉曼研究了26种天然有机粘合剂和颜料的光谱, 将其作为指纹识别未知粘合剂和油漆的数据资料, 该资料在对中世纪彩色稿本中的

13〕

粘合剂和颜料的鉴别中得到了验证。S ilvia 等〔对16世纪的波斯彩色稿本的颜料进行了显微拉曼光谱测定。Alessan 2

14〕

dra 等〔用显微拉曼对绘画材料进行了实时实地的鉴定研

15〕

究。杨群等〔应用显微拉曼光谱技术对云南楚雄万家坝出土的古青铜矛进行了分析, 确定矛身表面腐蚀产物和矛尖表面的黑色坚硬物质的主要成分, 并由腐蚀产物的成分推测青铜矛所经历的环境特征。

4　共聚焦显微拉曼光谱在公安与法学样品

无损分析方面的应用

　　近年来, 国际上用该技术对炸药、射击后手上的痕量物质、笔迹及手指上粘带的微量毒品进行了分析研究, 国内也

〔16〕

有相关报道。Lewis 等报道了显微拉曼光谱对爆炸物和枪

17〕

击残留物的分析研究; 路帆等〔指出, 显微拉曼技术是公安机关办理涉枪案件中对射击人提供有射击行为的一个极好的鉴定方法, 他们在室温环境下得到了射击残留物的纤维拉

18〕

曼光谱图。赵金涛等〔利用显微拉曼技术对八种常见毒品做了测试和分析, 发现取代支链上甲基的数目和位置对拉曼谱线均有明显的影响, 在激发光514. 5nm 下, 几种常见的毒品都具有不同程度的荧光, 采取合适的测试条件, 对减小拉曼谱的荧光有明显的作用。他们还对手指触摸过海洛因后所沾有的极其微量残留物进行了分析, 发现痕迹海洛因拉曼