细胞培养放大指南

培养更多细胞：细胞培养放大简易指南

John A. Ryan，Ph.D. 康宁公司 生命科学

900 Chelmsford St. Lowell，MA 01851

目录

简介 .................................................................................. 9

系统选择 ......................................................................... 10

选定最佳系统 .................................................................. 15

关键技巧 ......................................................................... 18 培养液问题 ................................................................. 18 液体处理问题 .............................................................. 20 悬浮培养问题 .............................................................. 20 贴壁细胞培养问题 ...................................................... 22

参考文献 ......................................................................... 23

简介

人类需要更多细胞…在进行以细胞为基础的试验和化验时，生命科学研究人员常常需要制造大量细胞以产生重组蛋白、抗体和病毒载体。当需要更大量的细胞时，研究人员必须从纷繁复杂的各种细胞培养器皿、系统和方法中进行甄选。康宁公司提供的本指南旨在帮助研究人员选择最符合其需求的器皿和方法以培养出更多细胞或生产出更

多细胞产品。本指南主要介绍适合生产至少1 x 109

个细胞（约1克）的基础系统。本指南并非针对需要生产更大量细胞的研究人员、或临床或工业级的生产而设计，但本指南提供的许多信息亦适用于这些场合。

本指南的目标之一是尽可能的简化放大过程，以提高成功率。另一个目标是尽量降低该放大过程的成本，为预算紧张的研究实验室节省资金。因此，本指南不包括中空纤维灌注系统、固定和流化床反应器、气动式和搅拌式生物反应器，以及其它在设备和自动化方面需要大量资金投入的系统。对于这些更加昂贵或复杂的放大系统和方法，参考文献部分为您提供了更多有用信息。

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图1：80多年来，生命科学研究人员一直在使用康宁产品进行细胞培养。

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系统选择

选择放大系统的第一步是查看康宁为研究实验室推荐了哪些系统（图2）。并根据您自身的特定需求和情况来评估各个系统。康宁提供了6个系统用于放大贴壁细胞：

◗ 具有较大表面积的培养瓶 ◗ 245mm方形培养皿 ◗ 滚瓶

◗ CellSTACK

多层细胞培养器 ◗ HYPERFlask 多层细胞培养瓶 ◗ E-Cube 生物反应器

针对细胞悬浮培养的放大，康宁提供如下产品：

◗ 一次性塑料旋转瓶和可重复使用型玻璃旋转瓶 ◗一次性锥形塑料摇瓶和可重复使用型锥形玻璃摇瓶

培养瓶

第一个细胞培养瓶于1923年由Alexis Carrel发明。培养瓶使用PYREX

玻璃制成，瓶身为圆形，平底，直颈或斜颈。它们被称作“D”瓶，“D”指它们的直径：D-3.5 培养瓶表示瓶的直径为3.5厘米。1947年，William Earle推出了呈六边形或矩形的“T”瓶。“T”指的是用于瓶内可用于细胞生长的总表面积：比如，T-25瓶的细胞生长面积即为25平方厘米。到20世纪60年代，直颈T瓶开始采用经处理的聚苯乙烯制模，从而增强了细胞的附着力。1974年，康宁开发出第一个聚苯乙烯斜颈T瓶，使研究人员能够更加方便地使用移液管来处理单层细胞。康宁提供5个型号的斜颈T瓶，其培养面积从25平方厘米到225平方厘米（表1）。这些培养瓶大多

可用于标准细胞培养表面或能够提高细胞附着力的康宁CellBIND

表面。康宁培养瓶的瓶盖有多种类型可供选择。为减少二氧化碳培养箱中的污染问题，我们强烈推荐使用透气盖。

优点

传统技术，方便使用

方便使用移液管，便于细胞的加液和采集。 可利用显微镜迅速判定细胞生长情况 减少培养液外溢及培养过程的污染 无需其它设备

缺点

培养量大时工作强度较高：培养 1 x 109

个细胞时需要44个 T-225 培养瓶 （图3）

占用培养箱空间较多

存管

摇瓶

图2：康宁提供的适用于贴壁细胞和悬浮细胞培养的放大系统。

图3：CorningT-225大培养瓶为

培养大量细胞提供了更加简单实用的方法。

图4：康宁245mm方形培养皿，可

提供500平方厘米的培养面积。

表1 Corning

培养瓶的预期细胞产量及推荐的培养液用量

康宁 平均 培养液 培养瓶

细胞产量*

用量 75 cm

7.5 x 10

15 - 22.5 mL 150 cm

1.5 x 1030- 45 mL 175 cm1.75 x 10

35 -52.5 mL 225 cm

2.25 x 10 45 - 67.5 mL

*假设100％铺满培养的平均产量为每平方厘米 1x10 个细胞。

培养皿

1877年，Richard Petri 在 Robert Koch的微生物学实验室任助手时发明了圆形玻璃培养皿。这种简单的Petri玻璃皿作为悬滴培养的无菌容器广泛应用于早期的细胞培养。20世纪60年代，由经过表面处理的聚苯乙烯制成的 Petri 培养皿开始应用于细胞培养。康宁的圆形细胞培养皿产品有4个型号，直径约从35毫米到150毫米（表2）。150毫米培养皿的培养面积约为148平方厘米。康宁还提供245平方毫米规格的培养皿，其培养面积达500平方厘米，适用于培养更大数量的细胞（图4）。

优点

可替代培养瓶，并且简单经济

可直接接触细胞表面，易于收集（采用刮取方式收集时尤为突出） 比培养瓶占用的培养箱空间小

可利用显微镜迅速判定细胞生长情况 无需其它设备

缺点

培养量大时工作量大：培养1 x 109

个细胞需20500平方厘米的培养皿 开放式设计使培养液外溢及污染事故几率增加

表2 康宁培养皿的预期细胞产量及推荐的培养液用量

康宁培养皿 培养面积

平均细胞产量

培养液用量 35 mm 8 cm

8.0 x 10

1.6 - 2.4 mL 60 mm 21 cm

2.1 x 10

4.2 - 6.3 mL 100 mm 55 cm

5.5 x 10

10 - 15 mL 150 mm

148 cm

1.48 x 10

30 - 45 mL 245 mm (平方)

500 cm 5.0 x 10 100 - 150 mL

*假设100％铺满培养的平均产量为每平方厘米 1x105 个细胞。

滚瓶

旋转式细胞培养的概念由George Gey (1933) 提出，他在约翰霍普金斯大学将其用于培养较大数量的贴壁细胞。他的工作主要在玻璃滚管中进行。到20世纪50年代后期，大号玻璃滚瓶已经普遍应用于培养大量细胞，特别是用于病毒疫苗生产(Whittle and Kruse；1973；Mather；1998b)。康宁提供4个型号的一次性聚苯乙烯滚瓶，培养面积从490平方厘米到1750平方厘米（图5和表3）。这些滚瓶表面有标准细胞培养表面及能够提高细胞附着

力的康宁CellBIND表面。康宁还提供可重复使用的PYREX

玻璃制滚瓶，具有优异的光学透明度和机械强度。康宁可重复使用型 PYREX玻璃滚瓶能够承受反复的干、湿灭菌，培养面积约为670至1330平方厘米。

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图5 康宁塑料滚瓶的培养面积为490至1750平方厘米。

图6：10层细胞培养器培养面积为

6360平方厘米，节省空间和工作量

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优点

避免在培养液中形成梯度，梯度会对细胞生长造成负面影响 良好的透气性

用于培养大量的贴壁细胞时更加经济：使用与培养瓶相同的培养技术但工作量更小 可利用大多数倒置显微镜判定细胞生长情况

缺点

较之培养瓶和培养皿，占用的培养箱空间更大

生产大量细胞时所需工作量为中度：培养1 x 109

个细胞需12，850平方厘米的滚瓶 预计需花费至少1500美元来购置用于处理12个瓶的设备。

由于不断的旋转瓶子可能导致细胞附着方面的问题，当使用低血清或无血清培养液时，

该问题尤为突出。但采用康宁CellBIND

表面能够解决这些问题。

表3 康宁聚苯乙烯滚瓶的预期细胞产量及推荐的培养液用量

康宁滚瓶

平均细胞产量

培养液用量 490 cm2

滚瓶

4.9x107

100-150 mL 850 cm2

滚瓶

8.5x107

170- 255 mL 1700 cm2

滚瓶

1.7x108

340- 510mL 1750 cm2

滚瓶

1.75x108

350- 525 mL

*假设100％铺满培养的平均产量为每平方厘米 1x105 个细胞。

康宁CellSTACK 多层细胞培养器

康宁CellSTACK多层细胞培养器为在类似培养瓶等的条件下生产大量贴壁细胞提供了节省空间和工作量的解决方案（图6）。CellSTACK多层细胞培养器有四个型号可供研究实验室使用。单层1-STACK培养器的培养面积为636平方厘米，2层2-STACK培养器的培养面积为1272平方厘米，5层5-STACK培养器的培养面积为3180平方厘米，10层10-STACK培养器的培养面积为6360平方厘米（表4）。第五个型号也是最大的40层细胞培养

器,它的培养面积达25440平方厘米，可轻易培养超过2.5 x 109

个细胞。但是，由于其体积较大，需要特殊的操作设备，因此不推荐研究实验室使用。CellSTACK细胞培养器可用

于标准细胞培养表面或能够提高细胞附着力的康宁CellBIND

表面。CellSTACK细胞培养器有2个直径为26mm的注液口，能直接通到培养器底部，使无菌注液以及移取培养液及细胞更加方便灵活。对于较大尺寸的CellSTACK多层细胞培养器，可选择附带1/8" 或 3/8"直径软管的注液盖进行培养液、溶剂或细胞的直接无菌转移，并且推荐采用蠕动泵压或重力供给的方式转移无菌液体，以确保安全（图7）。

较大尺寸的CellSTACK培养器需要些许实践方可熟练操作。为帮助研究人员熟悉CellSTACK培养器的操作程序，请访问康宁公司网站上的技术指导视频www.corning.com/lifesciences，该视频对如何正确使用CellSTACK培养器进行了示范。

优点

较之培养皿、培养瓶和滚瓶，生产细胞所耗费的工作量更少：培养1x109

个细胞仅需2个CellSTACK 10层细胞培养器

通过增加更多层或更多培养器，使扩大培养更容易 较之培养瓶和滚瓶，占用的培养箱空间更小；并可堆叠 无需其它设备

缺点

注液后，大型CellSTACK多层细胞培养器变得很重，加大了操作难度，并且需要坚固的支架

图7：可选的注液盖可使培养液无

菌地注入或导出康宁CellSTACK多层细胞培养器

图8：10层康宁HYPERFlask多层细胞培养瓶已成功用于细胞增殖（包括贴壁细胞和悬浮细胞），蛋白及病毒生产以及转染。

对于较大型的CellSTACK

培养器，由于培养液用量较大使移液较困难，因此不如培养瓶、培养皿和滚瓶易于操作

由于10层CellSTACK培养器较高，因此使用显微镜查看细胞生长情况较为困难。但是，通过在相同条件下并行实施1层伴随培养可检测细胞生长

表4 推荐的康宁CellSTACK多层细胞培养器培养液用量

培养器

培养面积培养液用量

1-Stack 平均细胞产量*

636 cm2

6.36 x 107130 - 190 mL 2-Stack 1, 272 cm2

1.27 x 108

260 - 380 mL 5-Stack 3, 180 cm2

3.18 x 108

650 - 900 mL 10-Stack 6, 360 cm2

6.36 x 108

1, 300 - 1, 900 mL 40-Stack 25, 440 cm2

2.54 x 109

5, 200 - 7, 200 mL

*假设100％铺满培养的平均产量为每平方厘米 1x105 个细胞。

康宁HYPERFlask 多层细胞培养瓶

康宁HYPERFlask多层培养瓶使用一个可渗透的聚苯乙烯薄膜来提供细胞和培养液与周

围大气环境之间的气体交换。这样，较之具有相同覆盖空间的传统培养瓶(175 cm2

)，细胞生长表面面积大大增加。HYPERFlask多层细胞培养瓶的设计使之能够完全装满培养液并用固体瓶盖密封（图8）。由于采用了超薄薄膜实现气体交换，因此无需将瓶盖开缝或使用透气盖。每个HYPERFlask多层细胞培养器的总培养面积为1720平方厘米，相当于一个标准T175培养瓶培养面积的10倍。

优点

10个连通的聚苯乙烯薄膜培养表面实现了培养液内的直接气体交换 无需其它设备

细胞产量是具有相同覆盖空间的175 cm2

培养瓶的10倍，既提高了生产力，又降低了处理时间，节省了培养箱的空间

较之培养瓶、滚瓶、培养皿和CellSTACK多层细胞培养器，占用的培养箱空间更小

缺点

由于每个培养器需要约565毫升培养液，移液较为困难，因此高密度HYPERFlask多层细胞培养瓶不如培养瓶、培养皿和滚瓶易于操作

HYPERFlask多层细胞培养瓶的10层中，只有4层能够用显微镜检查法直接观察

带有CellCube

模块的康宁E-Cube系统

E-Cube 系统是一个小巧简单的灌注生物反应器系统，使用康宁获得专利的平行板10层CellCube模块，细胞培养面积为8500平方厘米。CellCube模块拥有一个经组织培养处理过的、用于细胞附着的聚苯乙烯培养表面，该表面将接受培养液的持续灌注以便提高细胞生产力。康宁开发的CellCube模块是集成到生物反应器系统中的一个平行板培养器，用于群体培养、生长以及基质附着细胞的过程控制。该系统最适合生产用于基因治疗方面的大量细胞、重组蛋白、病毒疫苗及病毒载体(Kotani，et al.；1994)。与中空纤维生物反应器不同，细胞可从E-Cube系统中收集。

E-Cube 系统包含一个充氧器、培养液储存器、多个端口以及全部所需的管子和配件，并使用一次性的10层CellCube 模块。它需要一个蠕动泵（图9）并且适合大多数二氧化碳培养箱。10层CellCube模块的推荐培养液用量为1700-2550毫升。

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图9：康宁 E-Cube 系统是一个简

单易用的灌注式生物反应器，带有一个培养面积为8500cm2的平行板培养器。

图10：康宁可重复使用型玻璃悬浮

培养瓶产品有各种型号可供选择，图中展示的是250毫升和1升的悬浮培养瓶。

图11 使用即用型一次性康宁旋转

器可避免在使用可重复使用型玻璃悬浮瓶时常见的清洁和消毒问题。

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为帮助研究人员熟悉E-Cube系统的操作，康宁公司网站提供一个说明手册www.corning.com/lifesciences，对这些产品的设置和使用方法进行了阐述。

优点

较之培养皿、培养瓶和滚瓶，生产细胞所耗费的工作量更少：一个10层CellCube

模

块可生产约 1 x 109

个细胞。 不断灌注培养液提高了细胞产量

通过切换到拥有21250平方厘米培养面积的25层CellCube 模块，可轻易实现放大培养 较之培养瓶和滚瓶，占用的培养箱空间更小

缺点

与培养瓶、滚瓶和CellSTACK

培养器相比，不能直接通过显微镜观测细胞生长，需要使用更多专业技能。 需要数千美元的初期投资 用户需自备蠕动泵

悬浮培养瓶

1956年，W. Cherry 和 R.N. Hull 用一个悬浮磁力搅拌器在圆底培养瓶的悬浮液中培养细胞。1957年，W.F.McLimans及其同事开发出了现代的玻璃悬浮培养瓶并于1958年将其成功放大为20升发酵桶。对于可在悬浮液中生长的细胞系，使用悬浮培养瓶可以简单经济地培养大量细胞。使用这种悬浮培养瓶，许多悬浮适应性细胞系的密度能够达

到每毫升1至 2 x 106

个细胞甚至更高(Mather；1998b，Iyer etal.；1999)。康宁可重复使用型玻璃悬浮培养瓶的溶剂容量从125毫升到36升，带有倾斜或垂直侧臂，瓶盖设计多样（图10和表5）。一次性聚苯乙烯旋转瓶的溶剂容量有125毫升、500毫升、1升和3升（图11）。这种一次性悬浮培养瓶为一次性，无需清洁、装配及消毒。

优点

小巧、经济 收集方便

在培养相同数量的细胞条件下，比使用培养皿、培养瓶、滚瓶或多层培养器所需的工作量大大减少 更易于放大培养

缺点

仅适用于悬浮适应性细胞的培养（除非使用微载体） 培养液的供给较为困难

需要一个磁力搅拌器，而搅拌器亦需占用更多培养箱空间 需要大量人力对玻璃旋转培养瓶进行排污、清洁、重装和清洁

表5 康宁悬浮培养瓶的预期细胞产量及推荐的培养液用量

康宁悬浮培养瓶 平均细胞产量

培养液用量 125 mL 悬浮培养瓶

1.25 x 108

100 - 125 mL 250 mL 悬浮培养瓶†

2.5 x 108

125 - 250 mL 500 mL 悬浮培养瓶 5.0 x 108

250 - 500 mL 1L 悬浮培养瓶 1.0 x 109

0.5 - 1L 3L 悬浮培养瓶

3.0 x 109

1.5 - 3L 6L 悬浮培养瓶†

6.0 x 109

3.0 - 6.0L 15L 悬浮培养瓶†

1.5 x 1010

7.5 - 15L 36L 悬浮培养瓶†

3.6 x 1010

18 - 36L

*假设最大培养液用量的平均产量为每毫升 1x106 个细胞。 仅适用于玻璃培养瓶。

图12：PYREX 玻璃三角瓶和摇

瓶具有各种型号和封闭类型。

图13：康宁3升塑料冯巴赫瓶带有

大透气盖，能够促进气体交换，提高细胞产量。

三角摇瓶

W. R. Earle 于1954年使用三角瓶在悬浮液中培养L929细胞。今天它们已广泛应用在振荡器具上，用于在悬浮液中培养细菌、真菌和动植物细胞。三角瓶特别适用于培养对氧气要求较高的昆虫细胞系。康宁的一次性塑料三角瓶和可重复使用型玻璃三角瓶产品具有各种型号（50毫升至6升）、品种以及瓶盖设计（图12、13和表6）可供选择。塑料三角瓶配有阻板，可加强混合效果，透气瓶盖设计更促进了气体交换。

优点

小巧、经济

取样及收集方便

配有阻板的三角瓶比悬浮培养瓶具有更佳的气体交换效果

较之培养皿、培养瓶、滚瓶和多层细胞培养器，所需的工作量更小 可在3升培养瓶中将培养液的用量轻易放大到1升

缺点

仅适用于悬浮适应性细胞 需要振荡设备

表6 康宁摇瓶的预期细胞产量及推荐的培养液用量

康宁摇瓶

平均细胞产量*

培养液用量 50 mL三角瓶† 2.0 x 107

15 - 20 mL 125 mL三角瓶 5.0 x 107

37.5 - 50 mL 250 mL三角瓶 1.0 x 108

75 - 100 mL 500 mL 三角瓶 2.0 x 108

150 - 200 mL 1L 三角瓶 4.0 x 108

300 - 400 mL 2L三角瓶 8.0 x 108

600 - 800 mL 3L三角瓶

1.2 x 109

1.0 - 1.2L 4L 三角瓶†

1.6 x 109

1.2 - 1.6L 6L 三角瓶†

2.4 x 109

2.0 - 2.4L

*假设最大培养液用量的平均产量为每毫升 1x106 个细胞。 仅适用于玻璃培养瓶。

选择最佳系统

要从以上系统中选择出最符合您需求的系统，关键是要彻底了解和评估以下5个方面： 贴壁要求

期望的细胞或产品产量 设备和空间要求

工作量需求及可行性

技术投入和操作的专业性（易用性）

在您充分评估和理解了以上5个方面后，即可轻松选定最符合您需求的系统。

培养液系统和细胞贴壁需求的匹配

第一步也是最重要的一步便是确定您所需培养细胞的其贴壁需求。一些细胞系是贴壁型的，也就是说，它们只有附着到适当的基底（如培养瓶或滚瓶）上才能生长。许多其它细胞系，既能够附着在基底上，又能够漂浮在悬浮液中；又可叫驯化细胞。

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图14 贴壁细胞还可在悬浮培养瓶

中的微载体珠上生长。

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通常，在细胞条件允许的情况下，采用悬浮培养来培养大量动物细胞要比使用贴壁培养更容易。当使用悬浮培养时，一些用于生产遗传工程蛋白的细胞系的产量也更高。如果细胞为贴壁型细胞，也可使它们适应悬浮培养。但是，即使能够使细胞适应悬浮培养，与采用贴壁培养相比，产品的特性以及产量可能会有所不同 (Iyer et al.；1999)。在实施适应性操作后，也可能需要对培养物进行筛选，以便选出具有较高生产力者或选出期望的细胞特性。

对于短期计划来说，使贴壁型细胞适应悬浮培养的意义也许不大。但对于较长期的或持续进行中的计划来说，使贴壁型细胞适应悬浮培养则具有较大意义。

在悬浮培养系统中培养细胞的优点有： 取样容易，换液较难

培养大量细胞最经济的方法 工作强度低

与静态单层系统相比，气体交换更加良好

在单层培养中，细胞呈二维生长；而在悬浮培养系统中，细胞呈三维生长，因此需要的空间更少

悬浮培养贴壁细胞的另一个方法是在改良的悬浮培养瓶中使用微载体（图14）。微载体是很小的(100 - 300 µm)无菌玻璃或聚合物微珠，细胞附着在其上生长，而微珠由于叶片的转动而保持悬浮状态。微载体并不适用于所有类型的细胞，它们有其特殊问题和需求。这一问题不在本指南的讨论范畴内；请参阅参考文献 (McLimans；1979，Freshney；2000) 获取更多有关微载体使用方面的信息。

使细胞附着在诸如培养瓶和培养皿之类的基底上进行培养也具有一些优点，多数细胞系的培养都采用这种方法。

在悬浮培养系统中培养细胞的优点有： 供给容易，传代培养较难 容易观察培养状态

避免了搅拌或振荡过程对细胞造成的物理压力，可使产量提高

细胞或产品的期望产量与培养系统的匹配

下一步是计算该计划所需的细胞数量。一般来说，贴壁细胞培养通常每平方厘米可生产

至少 1 x 105个细胞，而悬浮培养每毫升可生产1 x 106

个细胞以上（表8）。根据细胞系和培养条件的不同，实际细胞产量可能是这个数量的几倍。通过优化细胞生产的各个方面，生

物制药公司已实现的细胞密度达每毫升1 x 107

个以上(Wurm；2004)。

表8 生产 1 x 109

个（约为1克）哺乳动物细胞的预计系统需求*

专业技术 培养器

培养器 设备 人力 产品 (均为一次性料制品) 需求

需求 成本† 成本 成本 225 cm2

培养瓶 基础 44 $302 无 高 245 mm 培养皿 基础

20 $330 无 高 850 cm2

滚瓶 基础+

12 $87 $1500+ 高 CellSTACK

-10 多层细胞培养器 中等

2 $390 无 中 1720 cm2

HYPERFlask培养瓶 中等 6 $450 无 中 3L 三角振荡培养瓶 基础+ 1 $48 $1, 000+ 低 1L 悬浮培养瓶 基础+ 1 $124 $1, 000+ 低 E-Cube多层细胞培养系统 高

1

$296

$3, 000+

低

* 以上需求基于：假设贴壁培养的生产量为每平方厘米1 x 105个，悬浮培养的生产量为每毫升1 x 106个。根据细胞系和培养条件的不同，实际细胞产量可能是远超这个数量。 †容器成本为近似值，根据美国2008标价。

当生产以细胞为基础的产品时，需要进行几次预备试验，以确定在预期培养条件下的产品产量。蛋白的产量通常为10 mg/L ，但优化处理会使细胞产量大大提高(Wurm；2004)。根据这些产量，就可计算出所需的细胞总量。可以通过增加培养器数量或增加生产批次的方法来获得更大的细胞产量。对于许多研究实验室来说，就长远来看，小批量多次生产更佳简单易行。花一定时间优化培养液和操作条件也能显著提高细胞和产品产量，对于悬浮培养尤为如此。

评估设备和空间需求

接下来是确定实验室中可用的培养箱空间以及设备数量。一些培养系统比其它系统更加小巧，例如悬浮培养瓶。也许可以借用其它实验室的培养箱空间，特别是当您的实验室附近有大型步入式温室可用时。一些培养系统还需更多设备，如泵、搅拌器、振荡器或滚筒装置。如果没有这些设备而又无法借用，应确定预算中是否包含购买这些设备的费用？

评估劳动力需求及可用性

然后是确定实施培养工作的人员。包括人员是否具备工作所需的必要的细胞培养技能？他们是否有时间充分了解该计划？

评估系统运行所需的技术和技能投入

系统是否简单易用？这通常取决于工作执行人员的经验和技能水平。那么，相关人员是否具备正确使用培养系统所必要的技能？

最后决策

通过对表8和表9（第10页）中总结出的每个培养系统的优缺点以及上文列出的几个重要方面进行综合考虑，您便可以选择出最符合您需求的系统。应切记： 1. 批量

在生产细胞时，分成若干个小批次要比一个大批次更加简单可行。

2. 实用性

单个培养器的容量越大，污染问题或培养失败所造成的损失越大，但越大的培养器设置、维护和收集细胞所需的工作量越小。

3. 简单性

培养过程和细胞培养系统应尽量简单化，这样会提高初始成功机率(Griffiths；1990)。

4. 监控

应经常监控培养状态以确保细胞健康并实现期望产量。如果能够使用显微镜直接观测培

养器中的细胞，则监控会更加容易（例如：培养皿、培养瓶、滚瓶及小型CellSTACK培养器）

5. 优化

如果时间允许，可优化对培养影响最大的各个基础方面——培养液、血清、播种密度及供给进度。从长远来看，这样做获益良多。

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表9 用于研究实验室放大培养的各康宁系统对照表

康宁培养器类型 225 cm 培养瓶 245 mm 方形培养皿

2

850 cm 滚瓶

CellSTACK 10层细胞培养器 HYPERFlask 多层细胞培养瓶

2

表面积

2(cm) 225 500 850

推荐培养液用量 优点

(mL) 45-68 ◗ 使用及收集方便

100-150 170-255

◗

◗◗◗

使用及收集方便，方便刮取 节省培养箱空间 使用及收集方便 非常经济

缺点 ◗◗◗◗◗◗◗◗◗

工作量很大 需占用大量空间 工作量很大

容易溢出和污染(可配置防溢系统) 工作量大

需占用较大空间 需滚瓶配套设备 不易观察细胞

液体处理和细胞收集较困难-需专业技能 使用显微镜仅可看到10层中的4层 培养液用量大，处理较难

6, 360

1, 720

1, 300-1, 900 ◗

◗◗

560-565 ◗

◗◗17, 00-2, 550 ◗

◗◗

500-1, 000 ◗

◗◗◗

500 – 1, 000 ◗

◗◗

带有10层

CellCube模块的E-Cube系统 1L悬浮培养瓶

8, 500

NA

3L三角培养瓶 NA

节省劳动力 放大容易

节省培养箱空间

结构非常紧凑，10层 ◗ 节省培养箱空间 ◗ 细胞产量是具有相同覆盖空间的175

2

cm培养瓶的10倍

灌注式生物反应器，细胞产量更高 ◗ 工作量降低 ◗ 放大容易

非常经济、小巧 ◗ 使用、取样和收集方便 ◗ 工作量降低 ◗ 放大容易

使用、取样和收集方便 ◗ 非常经济、小巧 ◗ 工作量降低

需运用更多专业知识，无法观察细胞 需用泵

仅适用于悬浮适应性细胞 需清洁和高压灭菌

需磁力搅拌器和更多培养箱空间 仅适用于悬浮生长细胞 需使用振荡器

关键技巧

下述信息将帮助您优化培养过程并提高成功机率。

培养液问题

使用最佳培养液

虽然伊格尔氏基本成分培养液(E-MEM) 是应用最广泛的培养液之一，但由于它是非常简单的最基础配方，因此通常不是使细胞生长或生产最大化的最佳培养液。例如，它不含诸如脯氨酸之类CHO细胞生长所需的非必需氨基酸。使用更丰富的培养液会得到更好的培养结果，并且需要补充的血清量可能更小，这类培养液包括M199、F12、 F12K、RPMI 1640、达尔伯克改良型伊格尔培养液(D-MEM) 及一些加强的 MEM配方(即Alpha MEM)等。当进行放大培养时，简单的并行培养液和血清优化实验可在耗费最小的工作量和花费最低的情况下获得很大收益(Mather；1998a)。

使哺乳动物或昆虫细胞适应无血清培养液配方也是很有益的，特别是当细胞产品需要从培养液中收集而后进行净化时。但是对于一些细胞系来说，这种转换可能需要耗费相当多的时间和精力。因此，有许多公司生产和供应针对特定细胞系培养而定制的无血清培养液。虽然这比标准培养液更加昂贵，但当培养这些细胞系时，它可以帮助您节省大量时间和精力。另外，从替换胎牛血清上节省的资金足以支付这笔额外费用。这些培养液的供应和使用信息可在互联网上查询或直接联络培养液供应公司。放大培养的工作量越大，优化培养液和培养条件的意义就越大。

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控制培养PH值

培养pH不当时，在细胞生长和贴壁方面会产生许多问题。对于培养液用量较大的培养器，由于在初始设置或随后培养液变更时，pH到达平衡所需时间会更长，这些问题尤为显著。如果pH控制不良而研究人员未提供培养液的碳酸氢盐缓冲系统所需的正确的二氧化碳水平，则问题会进一步恶化。低水平碳酸氢钠缓冲的培养液，例如用汉克氏盐 (0.35 g/L 碳酸氢钠)缓冲的伊格尔氏基本成分培养液(MEM)，设计用于未提高二氧化碳水平的培养箱或步入式温室中的密封（气密）培养器。由于该缓冲系统不需要二氧化碳培养箱，因此常常用于应用滚瓶或CellSTACK多层细胞培养器的大规模生产。

但是，大多数其它的碳酸氢盐缓冲培养液具有较高水平的碳酸氢盐并需要开口的培养器（带有松动或透气瓶盖的培养皿、培养板或培养瓶）并放置在潮湿的、能将二氧化碳浓度保持在5％至7％的培养箱中。表10列出了一些常用细胞培养液中的碳酸氢盐含量。通常，碳酸氢钠含量越高，要达到最佳缓冲能力所需的二氧化碳水平越高。在市场上还可买到不使用碳酸氢盐缓冲系统来保持pH水平的培养液配方；当没有二氧化碳培养箱时，可用它们控制pH值。

上述碳酸氢盐缓冲系统通常用一种广泛使用的有机缓冲剂HEPES（N-羟乙基-N'-哌嗪乙磺酸）作为补充。使用这种缓冲剂时，如果培养液暴露在荧光下将会产生其它问题（见下文）。

表10 常用哺乳动物细胞培养液中的碳酸氢盐水平

培养液

伊格尔氏液本成分培养液 (MEM) +伊格尔氏盐 伊格尔氏液本成分培养液+ 汉克氏盐 培养液199+伊格尔氏盐 培养液 199 + 汉克氏盐 Alpha MEM 培养液

达尔伯克改良型伊格尔培养液 (DMEM) DMEM/F12 Ham’s F12

MCDB 131 培养液 McCoy’s 5A RPMI 1640

CMRL 1066 培养液 Leibovitz’s L-15 培养液

碳酸氢钠 水平 (g/L)

2.2 0.35 2.2 0.35 2.2 3.7 1.2 - 2.438 1.176 1.176 2.2 2.0 2.2 无

是否需要

2

额外CO 是 否 是 否 是 是 是 是 是 是 是 是 否

避免培养液暴露在荧光下

对于放大生长中产生的问题或培养完全失败的情形，人们在查找原因时，常常会忽略荧光对于培养液（有细胞或无细胞）的不利影响这一因素。应在黑暗环境中储存培养液和培养细胞，远离会与培养液中的光敏性成分（核黄素、色氨酸及HEPES）发生反应的荧光（步入式温室或冷藏室），这点十分重要。这些反应会生成对细胞有直接毒害作用的过氧化氢和自由基。这个已经证实的影响因素在查找细胞生长方面问题的原因时常常被忽略(Wang；1976，Wang and Nixon；1978)。由于培养液储存不当导致的毒害作用增长较慢，因此这一问题很难被发现。除直接的细胞毒性外，其它由光诱发的损害问题包括基因损伤（突变率及染色体畸变增加）。

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图15：康宁旋转培养瓶采用无菌

转移盖使转移大量细胞或培养液时的灌注或移液过程更加安全。

图16：康宁500毫升一次性离心管

是处理大量细胞悬液的理想工具

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预热培养液

在初次将细胞播种到培养器中时，特别是当使用大型培养器、滚瓶或 CellSTACK

多层细胞培养器时，均应预热培养液。培养液到达培养温度所花费的时间越长，细胞贴壁所需的时间就越长。贴壁过缓可能导致生长不均或生长不良，特别是当使用滚瓶时。参见下文中的帮助细胞迅速贴壁（第14页），了解更多有关细胞贴壁问题。

正确换液

为使细胞生长达到最优，应在必要时更换培养液。遗憾的是，没有一种换液方法能够适用于所有细胞类型。尽管由于培养大量细胞需要大量培养液，换液频率太高会花费很多时间、资金和精力，但如果通过缩减培养液的方法来节省资金则会适得其反，还不如过度换液能获得良好的细胞。可在较小的培养器中进行简单的实验来比较不同的换液方案，如每三天将全部培养液更换一次或每二天更换一半培养液。下面这种方法值得一试：用葡萄糖监测仪器检测葡萄糖水平，当葡萄糖水平下降到某一点时再更换培养液。对于用于生产产品的细胞，有时可以在细胞汇合后采用无血清培养液换液而不影响产量。

液体处理问题

采用良好的无菌技术

培养中的污染，特别是支原体污染可能是导致放大培养出现问题或失败的最常见的一个因素(Lincoln and Gabridge；1998)。许多较大规模的培养系统需要无菌转移大量无菌培养液和溶液，而这方面的技术困难使培养污染问题更加严重。最大的移液管仅能移送100毫升。因此常常采用灌注方法，但这种方法清洁性较差，会提高污染的机率。在无菌环境下用泵抽取培养液，再通过带有无菌接头导管组或注液钟，是一种较好的灌注方法。这些导管组可连接到培养液袋以便使培养液通过蠕动泵或重力作用迅速注入培养器。康宁生产了多种液体转移附件，包括用于康宁CellSTACK培养器和旋转培养瓶的导管组（图15）。

虽然细胞培养污染问题不属于本文讨论的范畴，但您可以访问康宁的生命科学网站，查看详细的相关技术手册《了解和管理细胞培养污染》。这本23页的手册论述了污染造成的培养损失问题及其原因，并探讨了如何通过谨慎的培养管理来避免这些损失的方法。

低速离心

离心分离常常用于将细胞从培养液中分离出来或用于离解溶液。该过程应尽量迅速并且轻柔，以便在不损伤细胞的前提下，形成一个容易再次悬浮的柔软细胞球。通常，旋转细胞在50-100 x g 或RCF（相对离心力）下悬浮5分钟即足以沉积大多数细胞而不会伤害它们。除了应用广泛的15和50毫升塑料离心管外，康宁还供应250毫升和500毫升一次性V底离心瓶（商品号Nos. 430776 和 431123）用于大量培养液的离心分离（图16）。

悬浮培养问题

降低剪力损伤

由于动物细胞缺乏细胞壁的保护，在旋转太快或振荡太激烈时产生的剪切力很容易对它们造成损伤。一些细胞系，特别是在无菌培养液中生长的细胞系对剪切力非常敏感，30-50RPM的混合速度差就可导致其生长方面的严重问题。

对于许多细胞系来说，振荡常常比搅拌要轻柔得多，在试图对这些细胞进行悬浮适应操作时是一个较好的方法。使用振荡培养瓶时，康宁推荐回旋振荡器的振荡速率为75-150RPM，培养液用量为培养瓶额定容量的30-40％（3升培养瓶为1升培养液）。对于康宁旋转瓶，建议起始速度为50-150RPM。如果使用配有挡板的旋转培养瓶和振荡培养瓶，所需的混合速率可大大降低。

某些类型的细胞例如昆虫细胞需要较高的含氧量，因此采用高速混合及使用透气瓶或持续通风会十分有益。建议您依据以往经验确定最佳搅拌或混合条件。开始时选择最低速率似乎可使细胞从培养瓶顶部到底部均匀分布。但是，为充分通风可能有必要采用较高的

速度，可向培养液中添加羧甲基纤维素 (1- 2%)、BSA (100 µg/mL) 或聚醚Pluronic F-68 (0.1%)以提高培养液的粘度，从而降低高速率导致的剪切损伤(Mather，1998b)。 当使用低血清或无血清培养液时，这点尤为重要。

避免细胞聚合和粘附

一些细胞系在悬浮液中生长时趋于聚集成大的细胞团。这些大细胞团容易沉淀到培养瓶底部并可能粘附在侧壁上，导致细胞活性和生长量较低。使用无钙培养液 (Joklik’s MEM；S-MEM)会降低细胞聚合，因为这些二价阳离子对细胞结合非常重要 (McLimans；1979)。在灭菌前使用硅化溶液涂抹玻璃悬浮培养瓶的表面会减少培养瓶表面的细胞聚合形

成。市场上可买到的适用于细胞培养的硅化溶液有Sigmacote、AquaSil和 Siliclad等。应谨慎遵循这些产品的使用和安全说明以避免培养毒性。

采用适当的接种密度

悬浮培养细胞时，采用正确的初始接种密度十分重要。通常，宁可添加过多的细胞也

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不要过少。起始的接种密度为每毫升1x10至5x10个细胞；如要使细胞适应无血清情况，较高的浓度更好。使用旋转培养瓶和振荡培养瓶时，另一个方法便是开始时使用的培养液用量为正常量的一半。这将所需细胞数量降低了50％，从而达到最佳接种密度。在细胞活跃生长后（24-48小时后），可添加更多培养液以达到培养器的最终工作量。

避免过热培养

放置在磁力搅拌器或振荡器电动机上方的培养瓶中的培养液可能会变得过热，这是由于电动机将过多的热量传递到了培养瓶。在步入式温室中这可能只影响到放置在电动机正上方的培养瓶，但在小的培养箱中，它可能会造成整个培养箱过热。可事先检查该问题：将一个装满水的相同的培养瓶放在培养箱中，至少监测48小时温度变化。有时，可将培养瓶离开搅拌器表面向上移动几毫米，使空气能够在其下方流动，通过这种方法可以减少从搅拌器到培养瓶的热量传递。还要确保在潮湿的二氧化碳培养箱中使用的搅拌器或振荡器能够耐受腐蚀性空气。将振荡器放置在培养箱中通常会产生振荡，可能会阻碍细胞附着到同一个或并置的培养箱的培养器中。

使细胞保持良好状态

每日检查细胞数量和活性(Ac-n et al.；1979)。通过稀释或收集将哺乳动物培养中的悬

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浮细胞密度保持在低于或等于1 x 10个/mL，直至做出培养生长曲线，以确定所使用系统支

6

持的最大密度。细胞群体密度较高时(2 x 10 个/mL 及以上)常常难以保持良好的健康状态并可能会突然崩溃。应当在细胞活性仍然较高（90％以上）时就分流培养液或收集。必要时调整pH值，如培养液呈酸性（黄色），可添加无菌碳酸氢盐溶液来提高pH值。如培养液呈碱性（紫色），可充入5％二氧化碳。在悬浮培养中，如果通风充分，一些昆虫细胞系通

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常会达到1 x 10个/mL以上的密度。

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图16：康宁CellBIND表面能促进

细胞贴壁，特别是促进在低血清或无血清环境下的贴壁。

图17：如图所示的紫色结晶：比起旋转速度较慢的培养瓶（右瓶），瓶旋转太快（左瓶）会导致细胞贴壁和生长不良。

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定期更换培养液会对保持悬浮培养良好的活性和生长率十分有益，特别是当密度较高时。可用这种方法为培养液换液：抽取50％-100％的细胞悬液，在离心瓶中将细胞向下旋转，丢弃旧培养液并使细胞团在等量的新培养液中重新悬浮，之后再添加回培养液中。康宁供应的250毫升和500毫升一次性塑料离心瓶 (康宁商品号 Nos. 430776 和 431123)，可使离心大量培养液更加容易（图15）。

贴壁细胞培养问题

采用适当的接种密度

培养贴壁型细胞时，采用正确的初始接种密度也是十分重要的。通常，添加过多的细胞要好于添加太少的细胞；接种密度总是可以随后降低的。起始接种密度为每平方厘米1 x 104至2 x 104

个细胞；如使用难以培养的细胞或要使细胞适应无血清情况，则最好采用更高的浓度 (Behie et al.；2004)。

帮助细胞迅速贴壁

细胞贴壁问题常常是个严重问题，特别是当在低血清或无血清培养液中培养细胞时。预热用于初始细胞播种的培养液并对较大的培养器实施预充气以使培养液很快达到适合的pH值，将有助于使细胞迅速贴壁。强烈建议在播种前对较大的培养器实施预充气，并应采用经过过滤的的医用级5％二氧化碳/95％空气混合物。

针对在传统细胞培养器表面发生的细胞贴壁问题，康宁推荐您尝试使用获得专利的康

宁CellBIND表面，其可用于培养瓶、滚瓶和CellSTACK

培养器（图16）。该表面是通过创新的微波等离子过程处理。微波等离子过程通过将大大高于传统的等离子或电晕放电用量的氧气混合到细胞培养表面来促进细胞贴壁，使其更具亲水性（可附着性）并提高表面的稳定性。

康宁还在康宁生命科学网站上提供一个详细的技术手册《识别和纠正常见细胞生长问题指南》供您参考。该指南共14页，论述了常见的或不太常见的细胞生长和贴壁问题，例如难以识别和解决的培养箱问题。

慢速旋转滚瓶

培养液在培养瓶表面频繁移动，即使速度较慢，也会使细胞的贴壁和生长难度大于其在静止培养器如培养瓶和培养皿中的情况（图17）。滚瓶培养的推荐起始速度为每分钟转数 (rpm) 0.5-1.0。但是，如果细胞贴壁（或保持贴壁状态）困难，应使用更低速度 (0.1 至 0.4 RPM)直至细胞贴壁(Clark et al.；1990)。

与静止培养系统相比，培养液的频繁移动还会导致细胞环境压力更大。因此，任何降低细胞贴壁能力的技术相关问题都被放大并清晰呈现出来。使用预热的培养液，并采用二氧化碳对培养瓶进行预充气，可使注射细胞时pH值的变化达到最小，从而使细胞贴壁更容易。

康宁还在康宁生命科学网站上提供一个详细的技术手册《滚瓶的选择和使用指南》。该指南共9页，描述了所有康宁玻璃和塑料滚瓶的特征并针对滚瓶培养可能发生的细胞生长和贴壁问题提供了解决建议。

保持细胞的良好状态

保持最佳的细胞培养液比率对于获得良好的细胞生长结果非常重要。开始时，每平方厘米的培养器生长表面面积可使用0.2-0.3毫升培养液（即，如培养瓶的生长表面面积为25平方厘米，则使用5-7.5毫升培养液）。使用更多的培养液可以降低换液需求，但由于培养液深度增加而环境为静止，也会减慢氧气向细胞的扩散。（另见第11页的“正确换液”）有时为培养液充气也会提高细胞产量和活性。因为需要的培养器数量多，其不适用于培养皿、培养瓶和滚瓶，但可用于 CellSTACK培养器。

在细胞聚合之前对细胞进行传代培养也很重要，这样可使它们保持活跃生长和健康。另外，上皮样细胞汇合时常常会形成很强的细胞与细胞连接，使它们在传代培养时更难以从基底移除。

轻柔收集细胞

在传代培养或收集时，不要过度离解细胞。在离解剂中暴露时间过长会降低细胞活性，使其难以再次贴壁。在试图同时对许多培养器进行收集时常常发生这个问题。最好每次仅收集几个培养器，而不是试图一次收集许多个。如果使用无血清培养液，确保离解剂已被灭活或已通过低速离心分离移除。使收集的细胞保持冷却状态直至准备好在新培养器中再接种。这会使其保持活性并减少细胞聚集。有各种离解酶和离解剂；对不同搭配组合进行试验，会提高收集效率和细胞活性(Freshney；2000)。

参考文献

1. Ac-n，R.T.，Barstad，P.A. 和 Zwerner，R.K. (1979).《细胞培养的增殖和放大》，W.B.

Jakoby 和 I. H. Pastan 编著，酶学方法，第58卷17章211-221页，学术出版社，纽约

2. Behie，L.A.，Kallos，M.S.和Sen，A. (2004).《在生物反应器中培养神经干细胞的生物过

程》，《生物过程学报》 3：27-42。

3. Clark，S.A.，Griffiths，J.B. 和 Morris，C.B. (1990). 《动物细胞培养》中的《大型杂交瘤细

胞培养》，y J.W. Pollard 和 J.M. Walker 编著，分子生物学方法，第5卷52章631-645页，Humana Press出版社，克利夫顿，新泽西州。

4. Freshney，R.I. (2000).《动物细胞培养：基础技术手册》－第四版。Wiley-Liss，Inc. 纽约. 5. Gey，G.O. (1933).《大组织培养的改良技术》Am. J. Cancer 17：752-756。

6. Griffiths，J.B. (1990). 《动物细胞培养》中的《贴壁依赖型动物细胞的悬浮培养放大》，y J.W.

Pollard 和 J.M. Walker 编著，分子生物学方法，第5卷12章49-63页，Humana Press出版社，克利夫顿，新泽西州。

7. Iyer，P，Ostrove，J.M. 和 Vacante，D. (1999).《腺病毒培养之生产工艺比较》。细胞技术

学， 30：169-172。

8. Kotani，et al.(1994). 《用于基因治疗的逆转录病毒载体的转导及生产改良方法》。人类基因治

疗，5：19-29。

9. Lincoln，C.K. 和 Gabridge，M.G. (1998).《细胞培养污染：原因、后果、预防及消除细胞培

养》， J.P. Mather 和 D. Barnes 编著，细胞生物学方法，第57卷4章49-65页，学术出版社，圣地亚哥，加拿大

10. Mather，J.P. (1998a). 《动物细胞培养法》中的《做出明智选择：培养液、血清剂无血清培养

液》。J.P. Mather 和 D. Barnes 编著，细胞生物学方法，第57卷2章19-30页，学术出版社，圣地亚哥，加拿大

11. Mather，J.P. (1998a). 《动物细胞培养法》中的《实验室细胞培养放大》 (0.5-50 升)。J.P.

Mather 和 D. Barnes 编著，细胞生物学方法，第57卷12章219-227页，学术出版社，圣地亚哥，加拿大

12. McLimans，W.F. (1979). 《细胞培养》中的《哺乳动物细胞大量培养》。W.B. Jakoby和 I.H.

Pastan编著，酶学方法，第58卷16章194-211页，学术出版社，纽约

23

13. Smith，R.E. (1979).《酶学方法：细胞培养》中的《劳氏肉瘤病毒的大规模培养》，W.B.

Jakoby和 I.H. Pastan编著，第58卷33章，学术出版社，纽约

14. Wang，R.J. (1976) 《室内荧光对组织培养培养液变质的影响》。In Vitro 12：19-22.

15. Wang，R.J. 和Nixon，B.T. (1978).《识别光化产物过氧化氢对经“日光”荧光灯照射的组织

培养培养液中的人类细胞的毒性》. In Vitro 14：715-722.

16. Whittle，W.L.和 Kruse，Jr.，P.F. (1973).《复制滚瓶组织培养：方法和应用》.P.F. Kruse，Jr.

和 Patterson，Jr.编著，第327-331页，学术出版社，纽约

17. Wurm，F.M. (2004).《重组蛋白疗法在培养的哺乳动物细胞中的生产》，Nat. Biotech. 22：

1393-1398。

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