玉米叶绿素含量测定方法研究
中国农学通报
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玉米叶绿素含量测定方法研究
李得孝"郭月霞"员海燕"张敏"龚小艳"穆芳
’西北农林科技大学农学院"陕西杨凌712100$
摘要!以玉米幼苗绿叶为试材"研究了#种叶绿素提取液的吸收光谱和提取效率及低温冷冻对叶绿素提取的影响"结果表明##种叶绿素提取液的吸收光谱基本相似"可以沿用85,3,法的计算公式进行叶绿素含量的测定$室温下"浸提法要优于研磨法"混合液浸提叶绿素比单独用丙酮或乙醇浸提要快"其中丙酮乙醇%水&配伍提取速度较快而稳定"是最佳的叶绿素提取方法’叶片冷冻后快速浸提确实能加速叶绿素提取速度"但叶绿素易受光热破坏"故应注意遮光(关键词!叶绿素$萃取$有机溶剂$玉米
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叶绿素含量是重要的植物生理性指标之一!长期以来"在国际上广泛采用Arnon法[1]测定叶绿素含量"但该法需要把植物材料研磨并经过滤或离心除渣"工作量大"且易受光氧化的破坏而引起误差"不适于对植物叶绿素的田间大样本测定和大量提取!Hiscox等[1]
醇混合液提取叶绿素存在协同效应"且两者在等摩尔混合时提取效果最好"而彭运生&刘恩[5]和刘绚霞&董振生等[6]研究认为丙酮乙醇1$混合液浸提叶绿素’2:效果较好!吴志旭"张雅燕[7]对丙酮萃取分光光度法测定植物体内叶绿素a的方法进行了改进"样品经过冷冻"50"丙酮快速提取并放置2h后进行测定"时间由
用二甲基亚砜#DMSO$直接浸提植物叶片叶绿素"省略了的Arnon法研磨和去渣的步骤"但需要在65!温度下浸提"叶绿素会受到一定程度的破坏"加之其叶绿素吸收光谱与Arnon法存在一定差异"沿用
8~20h缩短为1.5~2.5h!笔者在前人研究基础上进一
步探讨叶绿素含量测定各方法的优劣及快速测定的步骤"为玉米田间大样本叶绿素含量测定提供依据!
Arnon法公式必有误差"而且DMSO气味难闻"故未
被广泛使用%但叶绿素浸提法受到重视"陈福明&陈顺伟[2]和张宪政[3]分别对不同配比的丙酮&乙醇和水的混合液的浸提效果进行了研究"证明利用混合液进行叶绿素浸提的可行性!洪法水[4]等研究表明丙酮与乙
!材料与方法
"."试验材料与主要仪器!试剂玉米杂交种陕单902幼苗2~3叶期叶片(25ml刻度试管"SP-2100型
可见分光光度计%
丙酮&甲醇&乙醇均为分析纯%
基金项目!陕西省科技攻关项目G1-02$(西北农林科技大学2003年青年科技专项基金’2003K02-’080807$%第一作者简介!李得孝"男"1973年出生"青海西宁人"讲师"在职博士研究生"主要从事教学与玉米遗传育种工作%通讯作者!员海燕"女"1960年出生"陕西华阴人"教授"主要从事教学与玉米遗传育种工作%E-mail:[email protected]%收稿日期!2005-01-20"修回日期)2005-01-25%
ChineseAgriculturalScienceBulletinVol.21No.62005June
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!""#$%%&’"()*+,’-./01’-2)34")*3+""5$%%&3"()*+,3-./013-6)34")*37)8叶绿素提取液配制按体积比配制提取液!80%
丙酮"95%乙醇"丙酮乙醇1$"丙酮乙醇水5:4.5:#1:%4.丙酮甲醇1&"丙酮甲醇水5:4.5:1&’1&,%1:%4.
7)9试验步骤2004年12月初"将陕单902玉米种子播种在温室苗床上"幼苗生长至2~3叶期剪取叶片"并剪成2mm碎条"分一半装入塑料袋在冰箱中冷冻"另一半在室温(12!)下立即用研磨法(80%丙酮"95%乙醇)和直接浸提法(提取叶绿素’每种设36种提取液)
个重复"每重复取样200mg左右’研磨法用滤纸过滤(洗涤"定容25ml"立即在645nm和663nm波长下测定吸光值’浸提在黑暗中进行"并不时摇动"约14h后定容"测定吸光值’放置4h后再测定一次吸光值’
冷冻叶片取出也按如上方法称量(研磨或浸提"但浸提改在50"水浴中进行"浸提2h后叶片发白"取出冷却后定容"测定溶液吸光值’
将6种叶绿素浸提液分别在400~700nm波段扫描吸收光谱’叶绿素含量用Arnon法的修正公式[1]!
叶绿素a=(12.71A663-2.59A645)#!$1000
叶绿素b=(22.88A645-4.67A663)%!&1000
"
叶绿素总含量’(8.04A663+20.29A645)()
"
1000
!结果与分析
8)7叶绿素提取液的吸收光谱比较从叶绿素溶液的吸收光谱可以看出"6种吸收光谱基本相似"在波长433nm和664~665nm处都有明显的吸收峰"在570nm
处有一间断跳跃"其它不明显的峰谷所对应的波长也基本相同!550nm(谷)峰)谷)(5834nm((604nm(’故混合液浸提法可以套用
Arnon法的计算公式’
8)9室温下叶绿素提取方法比较表1显示"用80%
丙酮研磨或浸提效果都优于95%乙醇’单独用丙酮
或乙醇浸提速度不及混合液提取法"表明丙酮与乙醇#甲醇&存在协同萃取效应’混合液浸提法由于在黑暗中浸提"有效避免了叶绿素的光分解"所以测定值高于研磨法’从室温浸提的两次测定结果看出"含甲醇的混合提取液浸提速度虽快"但叶绿素测定值不
高"可能是叶绿素在其中的稳定性差"容易降解所致)而含乙醇的混合浸提液浸提速度略次于含甲醇浸提液"但叶绿素测定值高"两次测定值差异小"说明浸提更完全"稳定性更好’同时可以看到叶绿素a含量变幅大于叶绿素b"影响叶绿素提取效率的关键是叶绿素a的提取速度及其稳定性保持’
8)9叶片冷冻后:;!快速浸提效果比较叶片冷冻
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后快速浸提(见表1)!以95%乙醇浸提效果最好!80%丙酮浸提效果最差!丙酮中加入乙醇或甲醇后稳定性增加明显!但含乙醇的浸提液稳定性更好$快速浸提法效果不及研磨法的原因是快速浸提过程中未设暗处理!光%温双重作用致使叶绿素含量下降明显$研磨法在冷冻前后的测定值差异较大!主要原因是样品鲜重测定是在冷冻前后分别进行的!在冻融的过程中样品水分散失!从而导致同样重量的叶片叶绿素含量提高$
叶片冷冻后快速浸提确实能加速叶绿素提取速度!但叶绿素受光热影响的降解随之增加!故应加置遮光设施以减少叶绿素的光分解$另外!为了增加不同测定方法之间的可比性!样品在冷冻前应称量分装好$
参考文献
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!小结
6种玉米叶片叶绿素提取液的吸收光谱基本相
似!故可以沿用Arnon法的计算公式进行叶绿素含量的测定$
室温下!混合液浸提法要优于研磨法$浸提法中混合液提取叶绿素!速度快于单独用丙酮或乙醇提取!即丙酮与乙醇&甲醇’存在协萃作用!该结论与洪法水等的结论相似$丙酮乙醇&水’配伍虽然提取速度不及含甲醇的提取液!但其叶绿素提取量多!叶绿素稳定性好!加之甲醇有毒!故室温下宜采用含乙醇的丙酮溶液提取叶绿素$
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提高研究速度和效率!促进科学技术!尤其是农学类科学技术的发展!有利于早日解决中国的"三农#问题$
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