测定茶叶中咖啡因的含量

测定茶叶中咖啡因的含量

目的:建立HPLC 法快速测定茶叶中的咖啡因。方法:甲醇+水=70+30(v/v);Agilent-C18柱(4.6 mm×300 mm,5μm); 流速1.0 mL/min,柱温30℃, 检测波长286 nm,进样量10μL 。结果:咖啡因在10~125μg/mL时, 浓度与峰面积呈良好的线性关系(r=0.9996),加标回收率为98.40%~101.07%,最低检出限为1μg/mL,相对标准偏差RSD 为0.08%~1.32%。

咖啡因又名咖啡碱, 属甲基黄嘌呤化合物, 具有提神醒脑等刺激中枢神经的作用。茶叶中多种药用成分的分析曾是国内外研究的热门。对于茶叶中咖啡因含量测定的常用方法有:紫外分光光谱法

[ 2 - 3 ],高效液相色谱法[ 4 - 6 ]等。文献中用高效液相色谱法分析咖啡因时主要采用 C18色谱柱

[ 4 - 6 ],使用 C8色谱柱的高效液相色谱法分析茶叶中成分的研究尚未见报道。笔者用 Zorbax2 C8 色谱柱的高效液相色谱法 (HPLC)测定了茶叶中的咖啡因。

1 材料与方法

1 . 1 材料 绿茶 (市售) 。日本岛津高效液相色谱仪 (DGU24A脱气装置、 SPD2 10A紫外检测器、 LC2 10AD 泵、 SCL2 10A 系统控制器) , 甲醇、 DMF 和 THF 均为色谱纯, 无水柠檬酸为分析纯 (香港产品) ,其他试剂均为分析纯, 二次重蒸水。

1 . 2 色谱条件 色谱柱: Zorbax2C8 (4 . 6 mm × 250 . 0 mm,5 . 0μm) ;流动相: 0 . 04 mol /L柠檬酸水溶液 ∶ N,N2 二甲基甲酰胺 (DMF) ∶ 四氢呋喃 ( THF) = 90∶ 16∶ 4; 流速: 1 . 00 ml /min；

柱温: 60 ℃; 检测波长: 280 nm;进样量: 10μl 。

1 . 3 样品处理 将茶叶置于 80 ℃ 烘箱中烘干, 然后将茶叶磨碎, 准确称取一定量茶叶于 250 ml锥形瓶中, 加入 100 ml沸蒸馏水, 超声提取, 静置过夜, 取上清液定容于 500 ml容量瓶中, 用 0 . 45μm 有机相滤膜过滤, 即得样品溶液, 供 HPLC 分析。称取一定量的茶叶, 在 35～45 ℃ 水浴上用乙醇浸提 1h, 蒸发浓缩得粗咖啡因, 升华法纯化后作为标准品。

1 . 4 纯化咖啡因含量测定 称取升华所得咖啡因, 用流动相配成一定浓度的溶液进样分析, 并用归一化法计算咖啡因的纯度。

1 . 5 标准储备液的配制 准确称取升华的咖啡因 0 . 205 g,用流动相溶解并定容到 100 ml容量瓶中, 摇匀。准确移取上述溶液 5 . 00 ml,用流动相定容到 50 ml容量瓶中, 摇匀, 即得标准储备液 (200 . 0μg/ml)。

1 . 6 标准系列溶液的配制和样品的测定 精密吸取标准储备液 0、 1 . 00、 2 . 00、 3 . 00、 4 . 00、 5 . 00 ml,分别加入 10 ml容量瓶中, 用流动相定容至刻度, 摇匀, 即得浓度为 0、 20、 40、 60、80、 100μg/ ml 的标准系列溶液, 以 0 . 45μm 有机相滤膜过滤。按上述色谱条件进样 10μl, 以峰面积 A 为纵坐标, 标准品咖啡因的浓度为横坐标制标准曲线。

按上述色谱条件, 注入样品溶液 10μl, 测得峰面积, 按标准曲线计算即得样品中咖啡因含量。 2

结果与分析

2 . 1 提取时间的选择 考察了超声提取时间 5、 10、 15、 20、25 min 5个不同时间所提取咖啡因的含量, 得最佳超声提取时间为 15 min,故样品选用了超声 15 min提取咖啡因。 2 . 2 流动相的选择 分别以甲醇 ∶ 醋酸 = 40∶ 60, 甲醇 ∶ 水 =70∶ 30, 水∶ 磷酸∶ 乙

腈∶ DMF = 859∶ 1∶ 120∶ 20, 0 . 04 mol /L柠檬酸水溶液∶ N,N2 二甲基甲酰胺 (DMF) ∶ 四氢呋喃 ( THF) = 90∶ 16∶ 4 (体积比 ) 为流动相进行茶叶中成分分析, 得到以 0 . 04mol /L柠檬酸水溶液 ∶ N,N2 二甲基甲酰胺 (DMF) ∶ 四氢呋喃(THF) = 90∶ 16∶ 4为流动相效果最佳。因为该测定条件下咖啡因与茶叶中的其他物质色谱峰都能很好地分开, 互不干扰, 咖啡因的色谱峰的保留时间为 5 . 078 min。(责任编辑：论文

2 . 3 标准曲线的线性范围 在上述测定条件下, 在 20～100μg/ml的范围内, 咖啡因的浓度与色谱峰面积有很好的线性关系, 其线性回归方程为: y = 27 634x - 603 . 62,回归系数: r =0 . 999 9,标准曲线见图 1。

2 . 4 纯化咖啡因含量测定 在上述测定条件下得色谱图, 如图 2所示。用归一化法计算升华得咖啡因的纯度为97 . 41%。

2 . 5 精密度试验 按上述样品处理和测定对该方法进行精密度试验 , 咖啡因的5次测定结果依次为71. 4、 71. 3、 71. 0、责任编辑 李菲菲 责任校对 卢瑶 安徽农业科学, Journal of Anhui Agri . Sci . 2010, 38 (17) : 8942 - 8943? 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.http://www.cnki.net图 1 咖啡因标准曲线Fi g . 1 Standard curve of caffei ne图 2 纯化咖啡因色谱图Fig . 2 Chromatogram of subli ma ti ng caffe i ne图 3 样品色谱图Fig . 3 Chroma togram of s ample71 . 1、 71 . 2μg/ml,平均值为 71 . 2μg/ml。图 3为样品色谱图, 变异系数 (CV)为 0 . 23%。

2 . 6 方法的回收率试验 在样品中分别加入咖啡因 20、 30、40μg, 测定其回收率 (5次) , 结果见表 2。结果显示, 回收率在 98 . 9%～102 . 3%。

表 2 回收率测定结果

Table 2 Results of recovery rate ( n =5)项目Item 本底值∥ μgBackgroundvalue 加标量∥ μgAddedamount 回收率∥%RecoveryrateRSD1 35 . 6 20 98 . 9 2 . 12 35 . 6 30 100 . 1 1 . 73 35 . 6 40 102 . 3 1 . 53 结论该研究建立了以 0 . 04 mol /L柠檬酸水溶液∶ N,N2 二甲基甲酰胺 (DMF) ∶ 四氢呋喃 ( THF) = 90∶ 16∶ 4为流动相, Zorbax2C8 (4 . 6 mm × 250 . 0 mm, 5 . 0μm) 为色谱柱分析茶叶中咖啡因的高效液相色谱法。对方法的精密度、 稳定性、 重复性和回收率进行考察, 结果证明该法有良好的线性、 精密度和回收率。此法快速、 可靠、 简单, 适用于茶叶和茶饮料中咖啡因含量的测定。