生物技术导论
食品生物技术:
生物技术在食品原料生产,加工和制造中应用的一门学科,包括食品发酵酿造等古老的生物技术加工过程,也包括应用现代生物技术来改良食品原料加工品质的基因,生产高质量农产品,制造食品添加剂,植物和动物细胞的培养以及食品加工和制造相关的其他生物技术,例子,酶工程和发酵工程
(一)基因工程的定义
7.基因工程(gene engineering)
运用限制性内切核酸酶、连接酶等酶类将不同DNA进行体外切割、连接构成重组DNA,再将重组DNA经生物介导或直接导入等转移方法引入受体细胞进行克隆、表达,从而改变生物遗传性以创造生物新种质,或通过大量扩增为人类提供有用产品等的技术。
8.食品基因工程
利用基因工程的技术和手段,在分子水平上定向重组遗传物质,以改良食品的品质和性状,提高食品的营养价值、贮藏价格性状以及感官性状的技术。
1.基因(gene)
DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列,是编码蛋白质或RNA分子的遗传信息的基本单位,是遗传物质最小功能单位。
2.基因组(genome)
一个生物体的全部基因序列。
3.基因工程(genetic engineering) (大题)
基因工程是指按照人们的意愿和设计方案,以分子生物学、分子遗传学、生物化学和微生物学等学科为理论基础,通过将一种生物细胞的基因分离出来或人工合成新的基因,在体外进行美妾和连接并插入载体分子构成遗传物质的新的组合,导入到自身细胞或另一种生物细胞中进行复制和表达等实验手段,有目的的实现动物、植物和微生物之间的DNA重组和转移。
? 4 基因工程的内容和步骤
基因工程的核心是重组DNA技术(recombinant DNA technique)又称为DNA克隆(DNA cloning)或基因克隆(gene cloning)等技术主要包括以下几个步骤:
(1)从复杂的生物体基因组中分离筛选并获得目的基因的DNA片段。
1.从DNA文库或cDNA文库中,采用探针杂交获得目的基因
2.采用化学合成法合成已知或新的基因片段
3.采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增出目的基因片段
(2)在体外将目的基因连接到能自我复制的并有选择标记的载体分子上获得重组DNA分子。
载体(vector)主要有:
质粒(plasmid)
噬菌体(phage)
病毒(virus)——多经过筛选和改造。
(3)将重组DNA分子转移到适当的受体或宿主细胞中,与之同步的增殖。
受体细胞有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等原核微生物,酵母菌、霉菌等真核微生物,以及动物、植物细胞。
(4)筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞克隆。
可采用
不同等法直接鉴定目的基因(探针杂交、核酸电泳等),或鉴定基因表达产物蛋白质(酶联免疫反应、蛋白质电泳等)。
1.三大理论基础
遗传物质是DNA
双螺旋结构及DNA半保留复制机理。
遗传信息是按DNA→RNA→蛋白质方向进行传递
2.三大技术基础
切割
连接
扩增
1、限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶通常简称为限制性内切酶,是一种核酸水解酶,主要是从细菌中分离得到的。这些酶能识别特定的核昔酸序列,但在细菌本身的DNA中,这些序列已经被体内的修饰系统所作用而无法被它们所识别,也就不被水解。也就是说,这些酶在细菌体内的作用是水解"入侵"的外源DNA而保护自身,所以称它们为限制性内切酶。目前在重组DNA技术中的限制性内切酶定义为:能识别DNA内部的特殊序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类核酸内切水解酶。
根据限制性内切酶的识别序列和切割位置的特性,把它们分为I型、II型和III型三类。其中I型和III型内切酶的识别位点和切割位点不一致,不产生特定的核苷酸片段,在基因工程技术中很少用到。
II型限制性内切酶有特定的识别位点和切割位点,其识别序列大约是4-8bp左右,约有一半的II型内切酶的切割位点是6个核苷酸,没有甲基化修饰酶功能。它的作用不需要ATP和S-腺苷甲硫氨酸 SAM作为辅助因子,一般仅需Mg2+。
(3)限制性内切酶的识别特点
①严格性
②碱基数
③对称性
④局限性
载体(vector):携带外源基因进入受体细胞的运载工具。
基因工程载体的特性:
(1)能在宿主细胞内进行独立和稳定的DNA自我复制。在插入外源基因后,仍然保持着稳定的复制状态和遗传特性。
(2)易于从宿主细胞中分离,并进行纯化。
(3)DNA序列中有适当的限制性内切酶位点,最好是单一酶切位点,并位于DNA复制的非必需区内,可以在这些位点上插入外源DNA,但不影响载体自身DNA的复制。
(4)具有能够观察到的表型特征,在插入外源DNA后,这些特征可以作为重组DNA选择的标志。
基因工程载体的选择,要根据携带的目的DNA片段的大小以及将来要进入的宿主的不同而确定。
按照导入的受体生物,一般可将基因工程载体分为大肠杆菌(原核细胞)载体、酵母载体、植物载体、动物载体等
质粒(plasmid):指是存在于细菌染色体外的小型环状的DNA分子,长为2-20kb。质粒本身是具有复制功能的遗传结构能在宿主细胞中独立的进行复制,并在细胞分裂的时候保持恒定的传给子代细胞。现在用到的基因工程质粒都是人工改造的。
质粒拷贝数(plasmid
copy number):一种质粒在一个细胞中存在的数目。
(2)质粒的分类
根据复制控制类型:一般可将大肠杆菌质粒分为严紧型复制控制质粒和松弛型复制控制质粒。
(2)λ噬菌体载体
λ噬菌体颗粒由头与尾两部分组成。头部装载了其整个基因组λDNA。
噬菌体颗粒的外壳是蛋白质,内部是核酸。该核酸最常见的构型是线状双链DNA,此外,还有环状双链DNA、线状单链DNA、环状单链DNA等。
λ噬菌体载体的分类:根据插入方式,一般可将λ噬菌体载体分为插入型载体和置换型载体。
插入型载体(insertion vector):指在基因组的非必要基因区内有一种或不止一种限制酶的单一酶切位点可供外源DNA插入,而不缺失其本身任何片段的λ噬菌体载体。
置换型(取代型)载体(replacement vector):指在基因组的非必要基因区内两个或两个以上的限制酶切位点间的DNA区段可被插入的外源DNA片段所置换的λ噬菌体载体。
由于大肠杆菌质粒本身也有一个复制点,所有这类质粒既可在大肠杆菌又可在酵母中复制和存在,故称为穿梭质粒(载体)。
多四聚酶链式反应(PCR)技术基本原理
在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下,利用DNA聚合酶催化合成反应,体外扩增特异DNA片段。
在进行PCR扩增时,通常需要设计合成一对与目的DNA片段两侧翼序列分别互补的寡核苷酸引物。其中一引物与目的区段上游一条模板链的序列相互补,而另一引物与目的区段下游另一条模板链的序列相互补。
将热变性后分开的两条模板链与摩尔数大大过量的两个引物共同温育复性产生的模板-引物杂交体作为作用底物,利用耐热的Taq DNA聚合酶催化延伸合成反应。在第一轮扩增完毕后,将反应混合物再加热使新构成的双链DNA变性,然后再度温育使模板链与引物复性,进入第二轮特异性合成。由于耐热的Taq DNA聚合酶在热变性步骤中不失活,可直接进入第二轮特异性合成而不需要另外补加DNA聚合酶等。
PCR的每个循环包括3步
(1)变性(denaturation)。通过加热至一定温度使双链DNA两链间的氢键断裂,DNA双链离解形成两条DNA单链。
(2)复性(退火,annealling)。当反应体系温度突然降低时,由于模板DNA分子的结构比引物DNA分子复杂得多,而且在反应体系中引物的量大大多于模板,因此引物和与其互补的模板配对形成局部杂交双链,而变性后离解形成的两条模板DNA单链之间互补配对的机会则较少。
(3)延伸(extension)。在4种脱氧核糖核苷三磷酸底物、Mg2+等存在的条件下,Taq DNA聚合酶以模板-引物杂交体分别为模板和引物催化DNA链沿5’→3’方
向合成延伸。每个循环的扩增产物作为下一循环的模板。
(1)质粒的生物学特性
一般为双链的共价闭合环状DNA(ccc DNA),
(3)质粒克隆载体的条件
①分子结构中具有多个单一限制酶切位点,具有易被检测的选择标记基因,且切点位于选择标记基因上。
②能插入、运载一定大小的外源基因。
③在携带外源基因前后在宿主细胞内均能自主复制。
④在与外源基因构建重组质粒后具有转化功能。
⑤分子质量小,易于操作,一般为松弛型复制控制。
⑥容易控制,安全可靠。
现已通过DNA重组技术构建了许多质粒克隆载体供基因工程应用,例如,pBR322、pUC系列等。
2.PCR的操作体系和反应条件(简答)
(1)模板。待测的核苷酸(DNA或RNA)分子;双链DNA可直接用于反应,而RNA则需要用反转录酶反转录成为cDNA,然后用作聚合酶反应的模板。
(2)DNA聚合酶。最初采用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段或T4 DNA聚合酶催化。由于每轮反应需要三个温度点,因此采用耐热TaqDNA聚合酶。
(3)一对引物。根据已知DNA序列,由人工合成的与所要求扩增的DNA两端临近序列互补的寡核苷酸片段,即左右端引物。
(4)四种三磷酸脱氧核苷(即dNTP),是合成DNA所需的原料。
(5)适当的缓冲液体系。
(6)反应条件。94℃变性30s;55℃复性30s;70~72℃延伸30~60s。一共进行30轮左右的循环。
基因的制备方法主要分为两大类:
一类是基因化学合成法,一类是基因生物制备法。一般又可将基因生物制备法分为基因组文库法、cDNA文库法和PCR法等。
外源基因:插入到载体内的非自身的DNA片段。
目的基因:又称为靶基因,是根据基因工程的目的和设计所需要的某些DNA分子片段,它含有一种或几种遗传信息的全套密码。)
基因重组(gene recombination):利用限制性内切酶和其他一些酶类,切割和修饰载体DNA和目的基因,并将两者连接起来。
目的基因和载体的连接分为黏性末端连接、平末端连接、人工接头连接和同聚物加尾连接
。
(一)黏性末端连接
1.同一限制酶切位点连接
转基因食品的安全性:
转基因食品是指用转基因生物制造、生产的食品、食品原料及食品添加物等,简称GMF。
转基因食品不仅为解决人类的食物短缺提供了有效的办法,还可以增加食品的种类、改进食品的营养成分、延长货架期、增加作物的抗虫害能力、耐严寒、抗高温、耐盐碱、抗倒伏、抗除草剂的能力等等,具有潜在的巨大的经济效益和社会效益。
只能说转基因食品是否安全是值得我们思考的,转基因食品存在
一些安全隐患,比如说,发生基因漂变,危害的影响有没有滞后性?还有会不会形成生物污染而影响物种多样性?等等,因为转基因的食物通常是由基因工程或其他的改变自然生长的微分子工程来诱导出来的。然而其中有的没有考虑到新插入生物体的基因和原来有的物质有没有反应,或者说在诱导的过程中有没有把生物体本身有利的基因消除掉。前者可能会产生有毒的物质,后者则会降低生物产品的营养价值。
转化(transformation):将重组质粒导入受体细胞,使受体菌遗传性状发生改变的方法。
转染(transfection):将携带外源基因的病毒感染受体细胞的方法。
根据受体生物,一般可将重组体导入受体细胞的方法主要分为大肠杆菌转化法、酵母转化法、植物细胞转化法和动物细胞转化法。
根据受体生物,一般可将重组体导入受体细胞的方法主要分为大肠杆菌转化法、酵母转化法、植物细胞转化法和动物细胞转化法
发酵:借助微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体本身,或其初级代谢产物、次级代谢产物的过程。
发酵工程:(大题)
也称微生物工程。利用微生物生长速度快、生长条件简单以及代谢过程特殊等特点,在合适条件下,通过现代化工程技术手段,最大限度地发挥微生物的某种特定功能,以生产出人类所需的产品。
固体发酵与液体(深层)发酵相比,具有以下优点
1.固体发酵单位体积的酶产量往往高于液体发酵几倍,甚至几十倍,特别适合真菌酶类和一些次级代谢产物及大型真菌的生产。
2.操作简单,适应性强,原料来源广,价格低廉,可以利用多种其他发酵工艺无法利用的粮食加工下脚料或废料进行生产。
3.固体发酵仅需空气自然对流或小量通风即可,能耗低。
4.固体发酵的产物提取一般步骤少,降低生产成本。有些产物,如饲料或饲料添加剂,不需要分离步骤,全部发酵物质可以作为产品。
5.发酵工艺全过程无废水或很少,可以减少环境污染。
1.液体表面发酵法
又称液体浅盘发酵法或静置培养法,是将已灭菌的液体培养基,接入微生物菌种后,装入可密闭的发酵箱内盘架上的浅盘中,薄薄一层,液层厚约1~2cm,然后向盘架间通入无菌空气,通过浅盘内培养基的表面供给氧气,并维持一定的温度进行发酵。
优点:无须搅拌,动力消耗省。
缺点:控制杂菌污染较难,所需场地较大,劳动强度大,生产效率低。
2.液体深层通气发酵法
将微生物接入装有无菌液体培养基的封闭发酵罐中进行培养或发酵的技术。
优点:①容易按
照生产菌种对代谢营养物以及不同生理时期的通风、搅拌、温度和培养基pH值等的要求,选择最佳培养条件。
②产品纯度高,质量也较稳定,还具有机械化程度高、劳动强度小、设备利用率高等优点。
缺点:易染菌、无菌操作要求高、设备投资大
一、食品发酵工业对微生物菌种的一般要求
1.菌种能在廉价原料制成的培养基上迅速生长和繁殖,并且生成所需的代谢产物产量要高。
2.菌种可以在要求不高,易于控制的培养条件下(糖浓度、温度、pH值、溶解氧和渗透压等)迅速生长和发酵。
3.菌株生长速度和产物生成速度应较快,发酵周期较短。
4.根据代谢控制的要求,选择单产高的营养缺陷型突变菌株、调节突变菌株或野生菌株。
5.选择一些不易被噬菌体感染的菌株。
6.生产菌种纯度高,不易变异退化,以保证发酵生产和产品质量的稳定性。
7.菌体不能是病源菌,不产生任何有害的生物活性物质(包括激素和毒素等),以保证安全。
(二)菌种保藏原理
根据微生物生理、生化特点人工创造条件,使微生物的代谢处于不活泼,生长繁殖受抑制的休眠状态。这些人工造成的环境主要是低温、干燥和缺氧三者,在此种条件下,使菌株很少发生突变,以达到保持纯种的目的。
(三)菌种保藏方法
1.冷冻保藏
普通冷冻保藏技术(-5~-20℃)、超低温冷冻保藏技术(-60~-80℃)和液氮(-196℃)冷冻保藏技术
2.冻干保藏
3.传代保藏
将菌种定期在新鲜琼脂培养基上传代,然后在一定温度下生长和保存的传代保藏方法。
4.矿物油中浸没保藏
将琼脂斜面或液体培养物浸入矿物油中于室温下保藏。
5.干燥-载体保藏
干孢子形成真菌和链霉菌时可通过吸附于干燥惰性固相载体如白土、硅胶或陶瓷表面获得较长时间的保藏。
(四)菌种保藏注意事项
1.菌种在保藏前所处的状态
一般以稍低于生长最适温度培养至孢子成熟的菌种进行保存,效果较好。
2.菌种保藏所用的基质
斜面低温保藏所用的培养基,碳源比例应少些。
3.操作过程对细胞结构的损害
二、培养基的配制原则
(一)根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基
(二)合适的碳氮比
(一)消毒和灭菌
消毒:指杀灭引起感染的微生物。在治疗学与卫生学中消毒指的是杀灭病原微生物;在工业微生物中消毒指的是除去会引起污染的微生物。
灭菌:指杀死一切微生物(包括繁殖体和芽孢等),不分病原和非病原微生物。
消毒一般多指化学因素处理,灭菌一般多指物
理因素处理。消毒的结果并不一定是无菌状态,灭菌的结果则是无菌状态。
实质等同性
? 概念:如果某种新食品或食品成分与已经存在的某一食品或成分在实质上相同,那么在安全性方面,前者可以与后者等同处理(即新食品与传统食品同样安全)。
? 根据实质等同性概念可将基因工程食品归为以下三类:
①与现有食品及食品成分具有完全实质等同性
②与现有食品及成分具有实质等同性,但存在某些特定差异
③与现有食品及成分无实质等同性的食品
农业转基因生物及其产品的食用安全性问题概括起来主要有以下几点:
? 过敏原
? 毒性物质
? 抗生素抗性标记基因
? 目前细胞全能性定义:
每个植物活细胞都具有该物种的新陈代谢、应激性和自体复制等生命基本属性,在合适的离体培养条件下,可以展现这些特征属性。
三、发酵工艺及方法
(一)固体发酵法
利用固体基质,如麸皮、米糠、秸秆等为主要原料,再根据需要添加其他谷糠、豆饼、无机盐等,加水拌成含水量适度的半固态物料作为培养基,供微生物的生长繁殖和产生代谢产物。
(二)液体发酵法
利用液态培养基,进行微生物的生长繁殖和形成人们所需要的代谢产物。根据通气(供氧)或不通气及通气方法的不同,又分为液体表面发酵法、液体深层通气发酵法、液体厌氧发酵法三种。
细胞培养一般步骤:
首先,要取材和除菌。用一定的化学试剂对材料进行严格的表面清洗、消毒。有时还要借助某些特定的酶,对材料进行预处理,以期得到分散生长的细胞。
其次,根据各类细胞的特点,配制细胞培养基,对培养基进行灭菌或除菌。采用无菌操作技术,将生物材料接种于培养基中。
最后,将接种后的培养基放入培养室或培养箱中,提供各类细胞生长所需的最佳培养条件。当细胞达到一定生物量时应及时收获或传代。