几种常用抑菌试验方法的评价及比较

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几种常用抑菌试验方法的评价及比较

刘如运（广东轻工职业技术学院

摘

广东广州510300）

要：用倾注法和涂布法制备含菌平板，对滤纸片法、平板打孔法、牛津杯法以及试管二倍梯度稀释法的抑菌评价方法进行了对比实验

抑菌效果

梯度稀释法

表明，梯度稀释法可进行定量抑菌试验。定性抑菌试验中以涂布法制备含菌平板，牛津杯法、平板打孔并进行火焰封底抑菌效果较好。

关键词：抑菌方法中图分类号：

目前，抗（抑）菌试验在新开发的防腐剂、抗菌剂、植物精油以及药物（中草药）等方面研究甚为活跃。测定抗（抑）菌活性的方法有很多种，常用的有抑菌环试验、最小抑制浓度测定试验等。抑菌环试验即琼脂扩散法，主要为定性实验，有滤纸片法、平板打孔法、牛津杯法等。最小抑制浓度测定试验，主要为定量实验，分为琼脂梯度稀释法（适用于不溶性抑菌物，可在试管或平板上进行）和营养肉

2］

。不同汤梯度稀释法（适用于可溶性抑菌物，可在试管中进行）［1，

法各做3个重复。完成后将培养皿放在37℃恒温培养箱，培养24h。培养24h后，观察含药纸片周围有无抑菌圈，以十字交叉法测定其抑菌直径（包括纸片直径），以毫米为单位记录。抑菌实验结果取平均值。

（2）滤纸片定量加药液法

滤纸片距培养皿边缘15mm。每个培养皿均匀放置5张滤纸片。用微量移液枪取10μL药液，分多次加到滤纸片上，要等药液被吸收干再继续加。用灭菌生理盐水作对照。每种药片倾注法、涂布法各做3个重复。完成后将培养皿放在37℃的恒温培养箱培养24h。观察，测量，记录。

4，7］

1.2.5平板打孔法［2，

的抑菌实验方法对实验结果有较大影响。因此，本实验以常用化学消毒剂（二氧化氯、过氧化氢、乙醇、氯化汞）进行不同抑菌试验方法的评价对比，以对实际抑菌研究提供一定的实验参考。

1.材料与方法1.1实验材料

1.1.1供试菌：本实验室保藏的普通大肠杆菌、金黄色葡萄球菌1.1.2培养基：营养肉汤培养基、双料营养肉汤培养基、营养琼脂培养基参考相关文献制备［1］。

1.1.3仪器及设备：高压灭菌锅、恒温培养箱、超净工作台、恒温水浴锅、干燥箱、可见分光光度计、移液枪等。枪头（10μL、200μL、1mL、5mL）、6mm滤纸片、牛津杯（内径6mm，外径8mm，高10mm）、培养皿（底部平整，规格一致）、培养基打孔器、棉签、牙签、镊子等包扎好，灭菌、烘干，备用。

1.1.4药品及试剂：生理盐水、1000mg/L二氧化氯、3%过氧化氢、75%乙醇（用95%工业酒精配制）、0.1%氯化汞。

1.2实验方法

1.2.1菌种活化：将4℃冰箱保存的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌转接至新鲜的营养琼脂斜面上，37℃培养18－24h。

1.2.2菌悬液的制备［3］：将斜面上的菌苔用10mL灭菌生理盐水分两次洗到装有玻璃珠的锥形瓶中，放到摇床上200r/min振荡10min，将菌悬液浓度调整为106CFU/mL。

1.2.3抑菌平板的制备

每个试管分装20mL融化的营养琼脂培养基，试管口多余培养基用纸巾擦掉，加橡胶塞，7支一捆包扎，121℃灭菌20min。灭菌稍冷却后置于50℃恒温水浴锅保温。

（1）倾注法制备平板：在超净工作台上，每个灭菌培养皿先加入1mL菌悬液，倒入20mL培养基，充分混匀，吹干冷凝水，待凝固。

（2）涂布法（棉签）制备平板：在超净工作台上，每个培养皿先倒入20mL培养基，吹干冷凝水，凝固后，再用灭菌棉签沾取菌液在平板表面涂布均匀，菌液不可过多，以平板上无液体流淌为宜

5，6］

1.2.4滤纸片法［4，

［1］

用灭菌打孔器在制备好的平板上垂直打出5个孔，5个孔分布要均匀，中间的为用生理盐水作对照，四周的为4种药液，距边15mm。用灭菌牙签将琼脂块挑出。采用孔底无处理和火焰封底进行对比。火焰封底为每个孔在酒精灯火焰下烤10s，进行封底，时间不可过长，以免过热融化培养基而产生过多冷凝水。在每个孔注入20μL药液。每种消毒剂倾注法、涂布法各做3个重复。37℃培养24h。观察，测量，记录。

9］

1.2.6牛津杯法［8，

将灭菌牛津杯用无菌镊子夹出，先置于酒精灯火焰上迅速过一下火，再垂直放置于培养基表面，轻轻按压，使杯底与培养基之间无缝隙。每个平板放置5个牛津杯。每个牛津杯注入200μL药液，中间的用生理盐水作对照。药液不可溢出来。每种消毒剂倾注法、涂布法各做3个重复。37℃培养24h。观察，测量，记录。

10］

1.2.7试管二倍梯度稀释法［6，

18×180试管若干，对应两种菌四种消毒剂分别从1开始编号，各加入5mL去离子水，第一支试管为空。121℃灭菌20min，冷却。将药液进行二倍梯度稀释，每次取出充分摇匀的稀释液5mL到下一个稀释度，最后一支稀释度试管取出5mL药液弃去。每个试管加入5mL双料培养基，接入0.5mL菌液，再摇匀。对照为5mL水加5mL双料培养基，阴性对照（即空白对照）补加0.5mL生理盐水，阳性对照补加0.5mL菌液。37℃培养24h，观察试管中液体浑浊情况。液体澄清的为无菌生长，浑浊的为有菌生长。以第几号试管以下不再发生明显浑浊现象，这一试管的药液浓度为该药对细菌的最小抑菌浓度（MIC）并测定所有试管液体的600nm处吸光度值。将消毒剂的浓度高于MIC（包括MIC）的各试管分取出1mL，转接至营养琼脂平板上，继续培养24h，观察有无菌落长出。以仍无菌生长的添加量为该消毒剂的最低杀菌浓度（MBC）。

2.结果与讨论

滤纸片法试验表明，平板涂布法抑菌圈大于倾注法，可能因为药物在培养基表面扩散要比渗透到培养基内容易得多。滤纸片定量加药液结果更易重复，浸泡法滤纸片所吸收的药液量不好控制（结果见表1）。平板打孔试验中，孔底经过火焰封底处理要好于未处理的平板，这是因为药液会在未处理的孔底缝隙流走而导致抑菌效果变差，涂布

。

（1）滤纸片药液浸泡法

在超净工作台上将灭菌滤纸片用无菌镊子放入到含药液的灭菌培养皿中浸泡。用无菌镊子以无菌操作夹取含药纸片，将多余药液在内培养皿边上擦掉，贴在含菌平板培养基表面，轻轻按压，使药片与培养基密切接触。滤纸片距培养皿边缘15mm。每个培养皿均匀放置5张药片，用泡过灭菌生理盐水滤纸片做对照。每种药片倾注法、涂布

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法的抑菌圈也要大于倾注法（结果见表2）。牛津杯法也是涂布法要好于倾注法（见表3）。试管二倍梯度稀释法试验结果表明最小抑菌浓度的菌悬液吸光度值基本上在0.1以上，说明含菌量在107CFU/mL以上，而最小杀菌浓度的菌悬液吸光度值低于0.03，说明没有微生物生长或生长得很少（见表4）。

从这几种琼脂扩散法实验结果来看，几种方法抑菌强弱顺序并不一致，所以几种抑菌方法同时使用时结果就可能不一致，从而造成结果难以判断。从表4也可看出，氯化汞和过氧化氢抑菌作用较强，氯化汞作用较缓和，过氧化氢较迅速，如氯化汞和过氧化氢抑制金黄色葡萄球菌的即MIC分别0.00001%和0.0015%，而最小杀菌浓度分别为0.001%和0.0029%。所以梯度稀释法试验更为准确、直观，为普遍使用的抑菌方法。

表1

消毒剂浓度二氧化氯1mg/mL过氧化氢3%乙醇75%氯化汞0.1%对照

加药方法定量浸泡定量浸泡定量浸泡定量浸泡定量浸泡

滤纸片法抑菌圈试验结果

大肠杆菌倾注法6.726.5510.349.076.456.111.619.9766

涂布法6.637.9221.8714.346.766.8314.1913.1766

金黄色葡萄球菌倾注法6.526.0719.1412.076.126.1116.4915.3366表4

消毒剂及浓度1000mg/L二氧化氯3%过氧化氢75%乙醇0.1%氯化汞3.结论

不同的抑菌试验方法对抑菌效果的评价有明显影响。从产生的抑菌圈大小来看，试管二倍梯度稀释法更为直观、可靠，可进行定量抑菌分析。琼脂扩散定性抑菌试验中牛津杯法较好，平板打孔法其次并进行火焰封底效果更好，滤纸片法结果一般。从含菌平板制备方式来看，涂布法比倾注法效果好。

参考文献：

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涂布法6.616.9733.6832.246.646.7319.7819.166

消毒剂及其浓度1mg/mL二氧化氯3%过氧化氢75%乙醇0.1%氯化汞对照消毒剂浓度二氧化氯1mg/mL过氧化氢3%乙醇75%氯化汞0.1%对照

表2孔底处理方法未处理火焰封底未处理火焰封底未处理火焰封底未处理火焰封底未处理火焰封底

表3

平板打孔法抑菌圈试验结果

大肠杆菌倾注法6.537.0213.6515.896.026.0316.1816.5666

涂布法6.587.1319.1424.256.456.1216.2120.2166

金黄色葡萄球菌倾注法6.627.2421.123.316.026.0119.1625.2966

涂布法26.126.2236.538.016.516.6422.5632.5766

牛津杯法抑菌圈试验结果大肠杆菌

金黄色葡萄球菌倾注法17.5530.678.0521.38

涂布法18.3939.19.1530.438

倾注法15.1221.898.0318.238

涂布法19.2230.179.3120.158

试管二倍梯度稀释法抑菌试验结果

金黄色葡萄球菌

MBC62.5mg/L0.0234%18.75%0.0016%

吸光度值＜0.03＜0.03＜0.03＜0.03

MIC3.9062mg/L0.0015%4.6875%0.00001%

吸光度值0.1210.1110.1230.480

MBC62.5mg/L0.0029%37.5%0.001%

吸光度值＜0.03＜0.03＜0.03＜0.03

大肠杆菌

MIC7.8125mg/L0.0059%4.6875%0.0001%

吸光度值0.0750.4400.3070.499

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