烟草愈伤组织诱导与植株再生

烟草愈伤组织诱导与植株再生

摘要：烟草( Nicotiana tabacum L. )又名草烟，为茄科烟草属的一年生草本植物，是重要的经济作物， 常被作为基因工程和分子生物学研究中重要的模式植物，具有药用、工业

[6]

用、保健和美容等多种价值。近年来有人从花烟草中提取出NaD1,具有抗肿瘤的功效。利用愈伤组织诱导与植株再生的细胞工程技术来培育烟草可以大大节约烟草的培育成本。本实验以烟草叶片为实验材料，分别在 黑暗、16h/d光周期条件下，用MS+BA 2mg/L + NAA 2mg/L培养基诱导烟草叶片形成愈伤组织。用MS+BA 2mg/L + NAA 0.5mg/L培养基全光照诱导分化。实验结果

关键词：烟草；愈伤组织；诱导分化；植株再生；光周期

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Callus induction and plant regeneration of Nicotiana tabacum L

Shi Meng-wei

(Biotechnology Class 1403)

Abstract: Nicotiana tabacum L, also named herbal tobacco, which is classified in Solanaceae

Nicotiana L plants, is an annual,as the important Model plant of Genetic engineering and Molecular biology. Tobacco possesses great value in medical, industrial, as well as in cosmetic area. In recent years, NaD1 which has the effect of anti-tumor has been extracted from Nicotiana alata. It is able to save the cost savings of cultivating tobacco by means of callus induction and plant regeneration. In this experiment, the leaves of tobacco are induced the formation of callus in culture medium MS+BA 2mg/L + NAA 2mg/L under the light conditions of completely dark and 16h/d photoperiod, then induced redifferentiation in culture medium MS+BA 2mg/L + NAA 2mg/L.

1 前言

植物组织培养是植物细胞工程中研究得比较早、也比较成熟的技术。进入新世纪以来，植物组织培养以植物生理学为基础发展起来。试管苗的快速繁殖、无病毒植物的培育等研究成果已经处在应用、推广阶段。离体的植物器官、组织或细胞，在培养了一段时间以后，会通过细胞分裂，形成愈伤组织。愈伤组织的细胞排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。由高度分化的植物器官、组织或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化，或者叫做去分化。脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官，这个过程叫做再分化。再分化形成的试管苗，移栽到地里，可以发育成完整的植物体。植物激素在调节细胞脱分化和再分化过程中起到主要作用。

烟草作为植物组织培养的“模式植物”之一,在植物组织培养中占据着重要的地位, 同时它还具有较高的经济价值，烟草所含的烟碱等生物碱是重要的医药与化工原料。烟草是研究细胞脱分化和再分化的理想材料。很多学者对烟草进行了不同层次和水平上的研究, 获得了大量的植物组织培养研究的资料。本试验通过对烟草叶片进行了愈伤组织的诱导和分化培养,来研究烟草愈伤组织的生长发育情况和分化情况，进而为烟草的培养改良提供一些基础性支持。

2 材料与方法

2.1 实验材料

烟草无菌苗，由华中农业大学生物实验教学中心提供 2.2 实验方法 2.2.1 培养基配置

MS分化培养基配方：

表1 MS分化培养基配方

母液 大量元素 微量元素 铁盐 肌醇 维生素 甘氨酸 BA NAA

1L培养基加入量

50ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 0.8ml/L 0.2ml/L

像1L容器中加入大约700ml蒸馏水，按照表中的顺序以及量，向蒸馏水中加入以上成分。加入10g白砂糖，在室温下搅拌溶解。溶解完成后利用0.5N的NaOH 和 0.5N 的 HCl 调整 PH 至5.8-6.0。调好Ph后加入7g琼脂粉，置于电磁炉上加热搅拌溶解，沸腾后停止加热。利用蒸馏水定容到1L，搅拌混匀。分装入50ml小三角瓶中，并做好标记，高压蒸汽灭菌，每瓶20ml左右。灭菌后的培养基置于无菌室保存备用。

MS诱导培养基配方：

表2 MS诱导培养基配方

母液 大量元素 微量元素 铁盐 肌醇 维生素 甘氨酸 BA NAA

1L培养基加入量

50ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 0.2ml/L 0.2ml/L

配制方法与分化培养基相同 2.2.2 烟草叶片愈伤组织诱导培养 2.2.2.1 烟草叶片接种

开始前30min。用75%乙醇将超净工作台擦洗干净， 将无菌操作所需要的用品用75%酒精擦洗后置于超净工作台上。烟草无菌苗等也置于工作台中。将不锈钢镊子、剪刀、解剖刀置于75%酒精中打开超净工作台紫外灯。穿好工作服， 在自来水管下将手洗净，然后用75%酒精将手消毒，再进入超净工作台开始接种操作。打开风机，关闭紫外灯，点燃酒精灯，将镊子、解剖刀在酒精灯下烤干。取一无菌培养皿，然后用解剖刀切取1-2片无菌苗叶片置于

2

无菌培养皿中，并用锋利解剖刀将叶片切成5mm左右的小片，然后将其接种于准备好的培养基上，一般每瓶接种5小片。快速封好瓶口，用记号笔写上姓名和接种日期。

2.2.2.2 培养条件

接种后的烟草叶片，3瓶置于黑暗培养，3瓶光照培养，光周期12小时/天，培养温度为24℃，观察愈伤组织形成状态。 2.2.2.3 烟草叶片诱导观察

仔细观察接种叶片细胞的启动状况和愈伤组织诱导及不定芽诱导状态，统计愈伤组织诱导率；观察记载黑暗和光照条件下愈伤组织的差异，结合理论学习进行分析，并做好记录。 2.2.3 烟草叶片愈伤组织分化培养 2.2.3.1 烟草愈伤组织接种

开始前30min.用75%乙醇将超净工作台擦洗干净， 将无菌操作所需要的用品用75%酒精擦洗后置于超净工作台上。将不锈钢镊子、剪刀、解剖刀置于75%酒精中打开超净工作台紫外灯。穿好工作服， 在自来水管下将手洗净，然后用75%酒精将手消毒，再进入超净工作台开始接种操作。打开风机，关闭紫外灯，点燃酒精灯，将镊子在酒精灯下烤干。将之前诱导的愈伤组织按类型分别转入配置好的分化培养基上，一共接种6瓶，3瓶来自光照，3瓶来自黑暗，每瓶接种五个愈伤组织块。接种好后快速封好瓶口，用记号笔写上姓名和接种日期。

2.2.3.2 培养条件

接种后的烟草愈伤组织全部置于连续光照或16h/d光照，温度20－22℃条件下培养。培养 3-4 周。

2.2.3.3 愈伤组织分化情况观察

培养 3-4 周后，按照接种瓶数观察是否有污染；是否每瓶都有植株形成；再生植株状态等。调查芽分化的情况，统计愈伤组织分化率、每个愈伤组织形成的芽数，比较不同光照下形成的愈伤组织对芽分化的影响。并做好记录。

3 实验结果与分析

3.1 实验结果

3.1.1 光照与黑暗条件下形成愈伤组织的差异

本次实验中，诱导培养基中的烟草叶片分别在12h/d光照和黑暗情况下24℃培养了3周。所诱导的愈伤组织状态如图1所示。在对两组愈伤组织进行观察与统计后得到表3。实验中所有情况下，愈伤组织的诱导率都是100%，证明有光或无光对烟草叶片愈伤组织的诱导率无明显影响。在光照条件下，愈伤组织呈绿色且质地较硬，在无光条件下，愈伤组织大多为白色、质地较嫩，并有少部分出现褐化。证明虽然光照对烟草叶片愈伤组织的诱导率呜明显影响，但对愈伤组织的状态会造成影响。光照条件下形成的愈伤组织比无光照的愈伤组织有更多的绿色的积累，在质地上比无光照的愈伤组织更加紧致。

图1 14h/d光照与黑暗条件下诱导的烟草愈伤组织，上面三个是光照条件下的愈伤组织，

下面三个为黑暗条件下的愈伤组织

Fig.1 Results of callus induction of Nicotiana tabacum in 14h/d light or dark. The above

three is the callus in light. The following of three is the callus in dark.

表3 烟草叶片愈伤组织诱导情况统计表

Table.3 Statistical table of callus induction of tobacco leaves

每瓶接种数

培养条件愈伤组织诱导率

编号Number of

Culture Induction rate

Number vaccinations

condition of Callus

per bottle

愈伤组织状态State of Callus 污染率Pollution rate

L1 5 12h/d光照 100% 绿色、质地硬 0 L2 5 12h/d光照 100% 浅绿、质地硬 0 L3 5 12h/d光照 100% 浅绿、质地硬 0 D1 5 黑暗 100% 白嫩、疏松 0 D2 5 黑暗 100% 白嫩、疏松 0 D3 5 黑暗 100% 褐色、嫩、疏松 0 3.1.2 不同情况的烟草叶片愈伤组织再生植株的差异

不同条件下形成的两种愈伤组织共同在分化培养基（ MS + BA 2.0mg/L + NAA0.5mg/L），置于光周期 12h/d 光照，温度24℃培养四周后观察。再生植株状态如图2所示。两种愈伤组织在形态上无显著差异，仅L2种愈伤组织大部分未分化，并伴有褐化现象。所有的分化芽都伴有轻度的玻璃化现象。详细统计愈伤组织的分化芽数，本实验以4

片叶子为一个分化

芽进行统计，得到表4.首先对愈伤组织分化率做差异显著性分析，结果如表5，光照与黑暗条件下形成的两类愈伤组织的分化率之间没有显著差异。对愈伤组织分化芽数进行差异显著性分析。结果如表6，光照与黑暗条件下形成的两类愈伤组织的芽的分化数也没有显著差异，但F值已经比较接近了，可能是样本太少导致差异不显著。实验证明光照或黑暗条件下诱导的愈伤组织再生植株时的分化率并没有显著差异，芽分化数也没有显著差异。

图2 不同愈伤组织再生植株状态

Fig.2 The status of Plant Regeneration from different callus

注：上面三个是12h/d光照条件下形成的愈伤组织的再生植株，下面三个是黑暗条件下形

成的愈伤组织的再生植株

Note: The above three were regenerated plants form the callus under 12h/d light irradiation, and the following three were regenerated plants from the callus under dark

conditions

表4 烟草叶片愈伤组织再生植株情况统计表 Table.4 Statistical table of regeneration plants

组织来源

分化率每个愈伤组织分化芽数

编号Sources

Differentiation differentiation

Number of

rate number per callus

callus D1 D2 D3 L1 L2 L3

暗 暗 暗 光 光 光

60% 100% 80% 100% 20% 100%

4 4 5.75 3.2 5 3.8

分化芽状态 污染率

正常、玻璃化 正常、玻璃化 正常、玻璃化 正常、玻璃化 褐化、玻璃化 正常、玻璃化 0 0 0 0 0 0

表5 两种类型愈伤组织分化率的差异显著性分析

Table.5 Analysis on the difference of differentiation rate of two types of callus

方差来源

平方和 自由度 1 4 5

均方和 F值 显著性 N

因素A 0.00666667 误差 0.50666667 总和 0.51333333 0.006666667 0.05263158 0.12666667

注：给出α=0.1，查表得到分位数F0.9（1,4）= 4.54。0.0523158

化率差异不显著。

Note: Given α=0.1, F0.9（1,4）= 55.8 in Quantile table.0.0523158

callus under light and darkness was not significant

表6 两种类型愈伤组织芽分化数的差异显著性分析

Table.6 Analysis on the difference of number of bud differentiation of two types of callus

方差来源 因素A 误差 总和

平方和 5.51041667 6.38833333 11.89875

自由度 1 4 5

均方和 F值 显著性 N

5.510416667 3.45030003 1.597083333

注：给出α=0.1，查表得到分位数F0.9（1,4）= 4.54。3.45030003

芽分化数差异不显著。

Note: Given α=0.1, F0.9（1,4）= 4.54 in Quantile table.3.45030003

differentiation of callus under light and darkness was not significant

4 讨论

本实验中，光照只对形成愈伤组织的状态产生影响，对愈伤组织的诱导率、愈伤组

织再生植株时分化率和芽分化数都无显著影响，但这也可能是由于实验样本不足，导致显著性分析的误差较大。除了光照以外，还有其他因素会对愈伤组织的诱导和分化产生影响。 4.1 激素水平

植物全能性的发挥，除细胞本身的内在原因之外，培养时的光、温度及植物激素的应用也是十分重要的因素。其中，植物激素的调节起着十分决定性的作用。植物激素是植物细胞生长最适宜的调节物质。培养基内细胞分裂素和生长素的浓度和比值制约着芽和根的分化[8]

。生长素常用来诱导愈伤组织的形成和根的分化; 细胞分裂素的主要生理作用是促进细胞分裂、诱导芽的形成、促进芽的生长。因为有研究表明， 6-BA 对芽器官形成有强烈的促进作用，但附加 2． 0 mg/L 的 NAA 后，则抵消部分 6-BA 对芽形成的促进作用而有利于愈伤组织的形成。通过植物激素对培养材料的调节，使我们能更好地控制植物器官的分化方向。

4.2 外植体类型

许多研究表明，外植体的选择对愈伤组织的诱导有很大的影响。总的来说，含有大量分生组织的植物器官是理想的外植体材料。烟草幼嫩叶片含有大量活跃分裂的细胞，很适合愈伤的诱导。自然环境中的植物，一般带有微生物，从而使其具有所谓的内生菌。因而在大多数情况下，应尽量使用温室或者人工气候室控制培养的植物材料作为外植体来源，以减少培养过程中微生物感染的概率。同时，应尽量选取生长旺盛的生长部位作为起始培养的外植

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体。

4.3 再生植株的玻璃化

在本次实验中，每个再生植株中都存在有不同程度的玻璃化。试管苗玻璃化”是指在进行植物组织培养中，试管苗生长异常。叶、芽嫩梢呈透明或半透明的水浸状，芽苗矮小肿胀失绿。叶片皱缩成纵向卷伸，脆弱易碎。玻璃化是植物组织培养中特有的现象,它是影响不定芽生根和试管植株移栽成活的主要因素之一。各种内外因素,如材料种类,培养基成分和培养条件等都会影响玻璃芽的发生,但引起不同植物的玻璃化的主导因素各不相同。大多数人认为,试管苗玻璃化是内部失调的外在表现,也有人认为是形态结构上的玻璃化导致了功能上的障碍. 为了减少试管苗的玻璃化，一种方法是适当提高 6 － BA 浓度，但不定芽产生数量较少; 另一种方法是在6 －BA 浓度较低的情况下，先诱导产生较多的不定芽，然后在不含激素的培养基中及时进行继代增殖培养，这样可以降低不定芽出现玻璃化的概率。综上，为了得到更多的不定芽，比较适宜的激素组合为 1． 5 mg/L 6 －BA + 0． 1 mg/L NAA，但须要在不定芽形成早期及时进行增殖培养

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参考文献

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