RNA的提取和逆转录
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2.5 从293T细胞中提取总RNA
2.5.1 实验材料
2.5.2 实验仪器
2.5.3 实验方法
(1)细胞收集完毕后,用1ml TRI-Reagent 重悬细胞(不超过1×107 个细胞),并剧烈振荡以裂解细胞。 (2)将细胞裂解液冰浴5分钟。
(3)向细胞裂解液中加入0.2 ml 氯仿,剧烈振荡15秒。
(4)将细胞裂解液冰浴5分钟。
(5)将细胞裂解液在4 ℃,13000 rpm的条件下离心15分钟。
(6)将上层水相转移至新的1.5 ml无菌离心管中,加入0.5 ml异丙醇颠倒数次混匀,冰浴5分钟。
(7)将内容物在4 ℃,13000 rpm的条件下离心15分钟,RNA将形成沉淀。 (8)弃去上清液,用1 ml 75%乙醇(Ambion RNase-free water与无水乙醇现配制)清洗RNA。
(9)在4 ℃,13000 rpm的条件下离心10分钟。
(10)弃去上清液,将RNA置于无菌环境中室温干燥10分钟。 (11)用30 μl Ambion RNase-free water溶解RNA。
(12)测定RNA的浓度,并于1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。 (13)将RNA溶液置于-80 ℃的冰箱中贮存备用。
2.6 逆转录PCR
2.6.1 实验材料
2.6.2 实验仪器
2.6.3 实验方法
按下表于0.2 ml无菌PCR管中准备50 μl的逆转录体系:
(2)按下表中的程序进行逆转录反应:
(3)反应结束后,将cDNA 置于-20 ℃贮存。