冻干人凝血酶原复合物的生产工艺研究

・２８２・

表３ＰＥＧ回收率测定结果

（懈／ｍ１）

是一种强有机酸，一种常用的酸性沉淀剂，对Ｃｔｔ－ＡＴ沉淀有效，但三氯乙酸遇到ＰＥＧ和碘溶液及氯化钡溶液即产生不溶性砖红色沉淀，也无法进行测定。９５％乙醇一氯化钠饱

ｌ２３４５６

５．９２６．３９６．２２６．３０４．７５４．７６

２５．９ｌ２４．５７２５．２２２４．４９２４．７３２４．９２

３４．４３３４．５５３４．８７３４．３３３４．３２３３．２０

和溶液沉淀ｄ。．ＡＴ蛋白效果较好，且对ＰＥＧ残留量测定无影响，因此用９５％乙醇一氯化钠饱和溶液沉淀含有ｌ％自蛋白的ＰＥＧ标准曲线与不舍白蛋白标准曲线测定的ＯＤ值无差异，因此，作者认为经９５％乙醇一氯化钠饱和溶液沉淀后的样品是无蛋白且含ＰＥＧ的样品，故采用不含白蛋白的ＰＥＧ标准曲线来计算ＰＥＧ的含量。

观察纯化的ａｌ－ＡＴ样品中Ｔｗｅｅｎ８０和ＴＮＢＰ残留量对

表４不同浓度Ｓ／Ｄ对ａｔ－ＡＴ样品中ＰＥＧ残留量

的测定结果

（峙／血）

ＰＥＧ含量测定的影响在ａｔ－ＡＴ纯化过程中也具有十分重要的意义。Ｔｗｅｅｎ８０是一种非离子去污剂（表面活性剂），属于聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸类，化学性质较稳定，但ｈ雠ｎ８０量稍大时遇到碘，可能与其形成不溶性络合物而产生沉淀，影响ＰＥＧ的测定。此外，实验在加入氯化钡溶液和碘溶液后１５－－－－－４５ｍｉｎ稳定。＞４５ｒａｉｎ会产生沉淀，影响实验的准确性。关于＜中国药典＞中的ＰＥＧ残留量采用高氯酸作为蛋白沉淀剂可能是较为早期的方法，但我们近期

３讨论

蛋白沉淀剂对ａｔ－ＡＴ蛋白沉淀的影响是在测定ａ，－ＡＴ中ＰＥＧ残留量时发现的问题，因此，我们就几种常用的蛋

尚未查到国内外有关“ＰＥＧ残留量测定方法”的研究。

参考文献

［１］

国家药典委员会．中华人民共和国药典［ｓ】．第５版。北京：化学工业出版社，２００５，３２

万方数据白沉淀剂对口。－ＡＴ蛋白沉淀的效果进行了多次试验。

＜中国药典＞（２００５版）采用高氯酸（ＨＣｌ０４）作为蛋白沉淀剂，但是实验结果表明提高高氯酸的浓度或提高ｃｌＩ．ＡＴ的蛋白浓度，高氯酸均不能完全除去蛋白质，加入碘溶液后蛋白氧化产生砖红色沉淀，无法进行ＰＥＧ残留量的测定。高氯酸是一种强酸和强氧化剂，为何不能使ａ。．ＡＴ变性沉淀，原因不明，可能是由于ａ。．ＡＴ在酸性条件下沉淀不完全。

本试验试图用三氯乙酸（Ｃ２ＨＱ３０２）沉淀ａｔ－ＡＴ，该酸

［３］

［２】选择性变性沉淀／／［Ｍ］．李校翌，袁辉．药物蛋白质分离纯化

技术．北京：化学工业出版社．２００５，４７－－４８

中国生物制品标准化委员会．中国生物制品规程［ｓ］．北京：化学工业出版社，２０００，６７１—６７２［４］

国家药典委员会．中华人民共和国药典［ｓ］．第５版，北京：化学工业出版社，２００５，３２—３３

（９．００７－０５－３１收稿，２００８－０１－０２修回）

本文编辑：夏玲闻欣

・实验研究・

冻干人凝血酶原复合物的生产工艺研究

魏舒

时凯刘国荣

汤敏（中泰药业有限公司，河南驻马店４６３０００）

对比两种生产工艺和两

摘要：目的冻干人凝血酶原复合物的生产工艺和病毒灭活工艺的研究。方法种不同类型的灭活方法对制品质量的影响。结果

采用以血浆为原料生产的制品，４种凝血因子活性均保持较

高水平；制品经过Ｓ／Ｄ病毒灭活，４种凝血因子活性回收率分别在７８％以上；制品经过（１００±０．５）ｏｃ灭活，４种凝血因子活性基本没有降低。结论采用以血浆为原料生产人凝血酶原复合物优于其他方法；为保证制品安全．同时采用ｓ／Ｄ灭活和（１００±０．５）℃灭活３０ｒａｉｎ对制品是必须的且对制品的活性基本没有影响。

关键词：冻干人凝血酶原复合物；Ｓ／Ｄ灭活；ＤＥＡＥ中图分类号：Ｒ４７５．１

１１３９２

文献识别码：Ａ

ＣｏｍｐｌｅｘＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ，

Ｓｅｐｈａｄｅｘ

Ａ－５０；干热灭活

文章编号：１００４－５４９Ｘ（２００８）０４－０２８２－０３

低下所致出血（¨。目前国内生产人凝血酶原复合物（ＰＣＣ）的工艺主要有两种‘引，一种以血浆为起始原料，另一种以血浆分离过程中产生的组分Ｉ＋Ⅲ为起始原料；采用的病毒灭活方法一般为Ｓ／Ｄ法，为确保制品的病毒安全，还须引入另一种不同原理的病毒灭活方法，即（１００±０．５）℃灭活

人凝血酶原复合物（Ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ

ＰＣＣ）是从健康人血浆中分离制备的一种主要含维生素Ｋ依赖性的凝血因子ＦＩＩ、ＦⅦ、ＦⅨ、ＦＸ的血浆蛋白制品，临床上广泛应用于治疗乙型血友病和因肝疾患引起的凝血功能异常以及由维生素Ｋ缺乏而继发的ＦⅡ、ＦⅦ、ＦＩＸ、ＦＸ

３０ｍｉｎ的病毒灭活方法。我们对两种生产工艺和两种病毒灭活方法进行了研究，现将结果报告如下。１材料与方法

Ｉ．１材料ＧＱＬ－１４２离心机（成都发动机公司）、不锈钢反应罐（上海九凌）、ＨＬＴＲＯＮ超滤器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司）、血浆（山东省阳谷单采血浆站）、组分Ｉ＋Ⅲ沉淀（本公司血液制品车问）、ＤＥＡＥ

ｓｅｐｈａｄｅｘ

Ａ０５０（进口分装，Ａｍｅｒｓｈａｍ

Ｐｈａｒｍａｄａ

Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＰＥＣ，６０００（药用，南京威尔化工有限公

司）、ＴＮＢＰ（分析纯，天津市化学试剂三厂）、Ｔｗｅｅｎ－８０（药用，上海大众药业有限公司）。１．２两种工艺的生产流程，见图１。

①ＦＩ＋Ⅲ沉淀②原料血浆融化合并离心

＋．

ＰＥｃ６０（）（）去除Ｆ‘

１．１Ｆ————————————■；

，。

圭堡塑堡土塑．冷疽淀用于Ｆｖ制备

●

上清ＤＥＡＥ

Ｓｅｂｉａｄ“Ｉ一５０处理

◆

万方数据

ｓ，Ｄ灭活（０．３％ＴＮＢＰ／Ｉ％Ｔ０１：ｅｎ．８０），（２４±ｏ．５）ｑＣ６ｈ

ＤＥＡＥ

ｓ叩ｂ墓ｘＡ．５０处理

图１从ＦＩ＋Ⅲ沉淀和原料血浆中提取

ＰＣＣ的生产工艺流程

１．３病毒灭活方法１）Ｓ／Ｄ病毒灭活法：制品澄清过滤后，调整滤液ｐＨ值和蛋白含量，加入已配制好的Ｓ／Ｄ灭活剂，使ＴＮＢＰ和Ｔｗｅｅｎ－８０的最终浓度分别为Ｏ．３％和１％，搅拌３０ｒａｉｎ，置于水浴中，待其温度升至２４。Ｃ时计时，保持（２４±Ｏ．５）℃６ｈ。２）干热病毒灭活法：冻干后制品放入（１００±Ｏ．５）℃水浴中３０ｍｉｎ。

１．４

ＦＩＩ、ＦＷ、ＦＩＸ、ＦＸ４种凝血因子的活性测定按文献

【１］方法。

２结果

２．１不同生产工艺对人凝血酶原复合物活性的影响从血浆中直接提取ＰＣＣ的工艺，其凝血因子的活性保存明显高于以ＦＩ＋Ⅲ为原料的工艺，而且从血浆直接制备ＰＣＣ，批间差异小，重复性好，收率稳定，４种凝血因子活性均保持较高水平，而从ＦＩ＋Ⅲ中制备的ＰＣＣ，批问差异大，收率较低，重复性差，连续３批次４种凝血因子活性差异较大。见表ｌ。

・２８３・

表１

３批次ＰＣＣ中４种凝血因子活性比较（ＩＵ／ｍ１）

种工艺生产的ＰＣＣ制品其ＦＩＸ比活性有显著差异：以血浆

为原料生产的ＰＣＣ制品ＦⅨ比活较高，其ＦｌＸ比活性均达

到了‘中国药典）【，１和＜欧洲药典）【４］的要求，并且各批间差别不大；而以ＦＩ＋Ⅲ为原料生产的ＰＣＣ制品ＦⅨ比活较低，并且各批间差别较大见表２。

Ｄ灭活后，Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ｘ因子效价回收率在７８％以上，经过（１００４－０．５）℃灭活３０ｍｉｎ后，Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ｘ因子效价基本表２两种工艺连续３批ＰＣＣＦＩＸ比活性比较

两种病毒灭活方法对ＰＣＣ活性的影响

（ＩＵ／ｍ１）

表４两种病毒灭活方法病毒灭活结果

２．２两种不同工艺制备的制品其ＦＩＸ比活性的比较两２．３两种病毒灭活方法对ＰＣＣ活性的影响制品经过Ｓ／没有降低。见表３。

２．４两种病毒灭活方法的病毒灭活验证我们对两种病毒灭活工艺分别时行了病毒灭活验证，结果显示：两种病毒灭活工艺均能使指示病毒的滴度降低４个ｌｏｇ以上，且经细

胞培养盲传３代，均未出现细胞病变。验证结果见表４。表３

３

讨论

两种病毒灭活方法，灭活相应的指示病毒均在４个ｌｏｇ以上，且经细胞培养盲传３代。均未出现细胞病变。同时采用ＰＣＣ在２０００年版＜中国生物制品规程＞中被收录于试

Ｓ／Ｄ灭活和（１００±０．５）℃灭活３０ｍｉｎ对制品中的凝血因行规程中，２００５年版＜中国药典＞重新将其收录。新药典取子活性基本没有影响。

消了原规程中用于标示凝血因子效价的ＰＥ效价，以ＦⅨ活性作为该制品的标示量，Ｆ参考文献

ＩＩ、ＦＶｇ、ＦＸ３种因子活性也分别标示，基本与＜欧洲药典＞相一致。

【ｌ】骆成榆，巫善明，陈良．凝血酶原复合物在病毒性肝炎中的

采用直接以血浆为原料与以组分Ｉ＋Ⅲ沉淀为原料相临床应用［Ｊ】．上海预防医学杂志，１９９７，９（４）：１６５—１６７比，减少了乙醇对凝血因子的破坏，生产出的制品收率较［２】刘隽湘．输血疗法与血液制剂［Ｍ】．北京：人民卫生出版社，

高，其中ＦＩＸ活性的收率超过了３００ＩＵ／Ｌ血浆，另外３种凝１９９６．２２０—－２２Ｉ

血因子的活性也保持较高，而且采用该生产工艺生产制品［３］国家药典委员会．中国药典．２００５，【Ｍ］．北京：化学工业出版

的质量较为稳定，ＦⅡ、ＦⅦ、ＦⅨ、ＦＸ４种凝血因子的活性杜，２００５，１９３—１９４

基本稳定，批问差异也非常小。使患者使用时更安全有效。［４］欧洲药典委员会．欧洲药典．（第４．６版）［Ｍ】．２００４，４０３３－－

柏３４

制品的纯度提高，还能有效的去除与血栓（溶血）副作用有［５】余蓉，刘文芳，赵青蓉，等．改良凝胶吸附法制备的凝血酶原

关的杂蛋白成分（ＡＴ一Ⅲ、Ｆｎ、Ｐｉｇ、ＰＫＡ、Ｒ：Ａｇ、抗－Ａ、抗－Ｂ凝复合物［Ｊ］．中国输血杂志，１９９７，１０（２）：６３—６６

集素），这样能大大降低致血栓的潜在威胁哺】。

‘（２００７—０８－２８收稿，１２－３１修回）

由于Ｓ／Ｄ法仅对脂包膜病毒有效，而对非脂包膜病毒本文编辑：刘晓明

无效；（１００±０．５）℃３０ｍｌｎ能有效的灭活非脂包膜病毒，这两种病毒灭活方法结合使用能有效灭活制品中的病毒。这

・实验研究・万方数据

．

白细胞过滤器去除血液中肿瘤细胞及对红细胞的影响

刘江月。

陈京霞２张雪莉’王占聚４

（１．潍坊医学院病理生理学教研室，山东潍坊２６１０４２，２．急诊教研室３．组织胚胎学教研室４．内科教研室）摘要：目的研究自细胞过滤器清除血液回收机瀑洗后血液中残存肿瘤细胞的效果，并观察过滤后红细胞的数量、形态及其脆性的改变。方法选择繁殖能力强，不易受损的细胞系肠肿瘤细胞（ＬＯＶＯ）和胃肿瘤细胞（ＳＣ，Ｃ）进行体外培养，待细胞消化后制成单一细胞悬液；采集非肿瘤患者术野血液，经过滤、离心、漂洗收集浓缩红细胞。将细胞悬液中的肿瘤细胞计数后混入浓缩的红细胞中，混匀。再用血液回收机过滤、离心、漂洗，将漂洗后得到的浓缩红细胞用白细胞过滤器过滤，观察过滤对血样中肿瘤细胞的影响并与未经过滤处理的对照组进行比较，同时测定红细胞数、红细胞平均体积（ＭＣＶ）、红细胞体积分布宽度变异（ＲＤＷ）及红细胞渗透脆性，观察过滤对红细胞的影响。结果过滤后的血样中未发现肿瘤细胞，而对照组血样中可见到肿瘤细胞。培养１４天后观察，经白细胞过滤器过滤后的血样未见肿瘤细胞生长，而对照组血样中有大量肿瘤细胞生长。过滤后的ＲＢＣ、ＭＣＶ、ＲＤＷ和红细胞渗透脆性与对照组相比差异无显著性（Ｐ＞Ｏ．０５）。结论应用自体血液回收机配合白细胞过滤器，可有效去除血液中的肿瘤细胞，且对红细胞数量、形态及细胞膜无明显影响。

关键词：白细胞过滤；肿瘤；红细胞中图分类号：Ｒ４５７．１

Ｒ３１８．６

文献标识码ＩＡ文章编号：１００４－５４９Ｘ（２００８）０４－０２８４－０２

白细胞过滤器去除白细胞输血的技术在国外已普遍应果报道如下。。用¨Ｊ。在我国近年来也取得很大进展，受到了临床医务人ｌ材料与方法

员的重视【２】。目前，白细胞过滤器以其去除白细胞效率高，操作简便，价格合理且无不良反应而成为最有效的去除白１．１器材ＲＦ・Ⅱ－２００型去白细胞过滤器（南京赛尔金生细胞的方法，在预防输血不良反应的产生及输血相关病毒物医学有限公司）；ＢＷ－８１００Ａ型自体血液回收机（天津万的传染方面已取得了较为满意的效果ｐ—Ｊ。但应用白细胞东医疗器械有限公司）；ＯＬＹＭＰＵＳ显微镜（日本奥林巴斯过滤器去除血液中肿瘤细胞国内报道很少。我们研究白细公司）；ＳＦ－３０００型血细胞计数仪（Ｓｙｓｍｅｘ）。胞过滤器清除血液回收机漂洗后血液中残存肿瘤细胞的效１．２细胞系及培养

肠肿瘤细胞（ＬＯＶＯ）和胃肿瘤细胞

果并观察过滤后红细胞的数量、形态及其脆性的改变。结

（ＳＧＣ）由上海第二医科大学提供。将肿瘤细胞接种于ＲＰ－