基因组学在植物病理学中的应用

西北农业学报　2004, 13(4) :63～68

2A cta A gricu ltu rae Bo reali occiden talis Sin ica

基因组学在植物病理学中的应用

景　岚1, 2, 康振生1, 韩青梅1

Ξ

(1. 西北农林科技大学植保学院, 陕西杨凌　712100; 2. 内蒙古农业大学农学院, 呼和浩特　010019)

摘　要:基因组学研究开创了一个新的生物学世纪, 特别是在农业领域。随着遗传模式植物的利用, 农业上重要生物的序列测定以及生物信息学和功能基因组学的结合使用促进了农业领域基因组学的发展。笔者就利用基因组学研究方法在植物病理学学科中所取得的一些进展进行了综述。这些研究对深入了解植物-病原菌的互作关系, 最终提高植物对有害生物的抗性提供参考。

关键词:基因组学; 生物信息学; 功能基因组学; 植物病理学; 植物2病原菌

中图分类号:Q 754　　　　文献标识码:A 　　　　　文章编号:100421389(2004) 0420063206

Genom ics Appl ied i n Plan t Pa thology

J I N G L an

1, 2

, KAN G Zhen 2sheng Q (1. Co llege of P lant P ro tecti on , N o rthw est Sci 2T ech U Fo , Ch ina ;

2. Co llege of A gronom ongo A Ch ina )

Abstract have a new b i o logical era , and fo r agricu ltu re in p articu lar . A 2long w ith of p lan t m odels and p rogress in sequencing agricu ltu rally i m po rtan t o rgan 2. T h is is m , the com b inati on of b i o info rm atics and functi onal genom ics enhanced agricu ltu ral genom ics review covered som e of the recen t studies , w h ich u tilized genom ics app roaches to exam ine p lan t p atho logy , are likely to p ave the w ay tow ards better understanding of p lan t 2p athogen b i o logical net 2w o rk s , and even tually to lead to b reak th rough s in the p rom o ti on of p lan t resistance to agricu ltu ral p ests .

Key words :Genom ics ; B i o info rm atics ; P lan t p atho logy ; Functi onal 2genom ics ; P lan t p athogen

　　1986年美国科学家T hom as Roderick 提出

的基因组学(Genom ics ) 是指对一个生物体所有基因进行基因组作图(包括遗传图谱、物理图谱、转录本图谱) , 核苷酸序列分析, 基因定位和基因功能分析的一门科学[1]。在过去的十多年中, 基因组学的意义已发生了变化, 现在它更强调基因组的功能, 这样基因组学分成了两个分支, 一个是结构基因组学, 以构建生物的遗传图谱、物理图谱和转录本图谱及其全序列测序为主要目标; 一个是功能基因组学, 利用结构基因组学研究获得的大量数据与信息评价基因功能, 包括生化功能、细胞功能、发育功能、适应功能等, 其主要手段结合了

Ξ

高通量的大规模的实验方法、统计和计算机分析

技术[2]。

最初, 基因组学研究集中于人类和模式植物。人类基因组、拟南芥A robid op sis tha liana 、酿酒酵母S accha ro m y ces cerev isiae 、秀丽线虫Caenorhab 2d itis eleg ans 以及黑腹果蝇D rosop h ila

[3]

m elanog aster 的基因组序列测定已经完成。序列分析的重点已转向农业上的大量生物, 对于他们的解析将会大大促进农业领域基因组学的研究, 从而加强对相关农业生物学的理解。水稻基因组序列草图最近已经公布, 最终完成日期将在2004年[4], 豆科苜蓿属模式植物M ed icag o trun 2

收稿日期:2004204226　　修回日期

:2004208205

基金项目:陕西省农业分子生物学重点实验室基金资助项目

作者简介:景　岚(1971-) , 女, 内蒙古呼和浩特人, 讲师, 西北农林科技大学在读博士, 主要从事植物病理学教学与研究。

・64・西　北　农　业　学　报13卷

ca tu la 正在进行测序分析。另外, 几个重要的植物另外稻瘟病菌M ag nap orthe g risea g ram inea rum 。

的基因组学计划已由国际稻瘟病基因组协会与生

物医学研究所合作率先开始。其他的植物病原真菌数据库包括植物病原真菌和卵菌EST 数据库。植物病原细菌基因组计划的例子是美国基因组研究所(T IGR ) 对番茄细菌性斑点病病菌P seu 2

d o m onas S y ring ae p v . to m a to 的测序以及最近完

病原菌基因组和序列表达标签(EST ) 的序列测定项目最近也已开始[5]。

基因组学已被广泛应用于农业相关课题的研究。在植物病理学研究领域集中于作物与有害生物基因组功能及互作关系方面。传统的生物遗传研究仅仅涉及“特定时期特定的基因”方法, 集中于了解对一个基因的影响。这种方式的研究促进了生物技术产业的突破以及制药和其他领域的发展。但是单个基因很少单独发挥作用; 实际上一个生物的每一方面都受到多基因遗传网络的影响。对于研究作物—病原菌(而不是某时对单一基因) 相互关系的基因组学, 它同时研究所有或大多基因, 提供大量的基因功能信息, 包括作物的一些重要特性如抗病性或耐病性等。

成的5. 8M b 基因组的青枯病菌R a lston ia solanacea rum 序列测定工作。其他病原菌条录包括南方根结线虫M eloid ogy ne incog n ita 12, 752EST s 和花生根结线虫M eloid ogy ne a rena ria 3334EST s 。丛枝菌根真菌G lo m us in tra rad ices 有2963EST s [5]。

序列表达标签(EST s ) 是研究植物基因表达的一个有效方法。EST s 提供了一个在植物中发, , 。EST s 也可以标记多基因家族中的单个成员[6]。尽管EST s 典型特点是序列较短且相对较低的丰度, 大多代表的仅是3’非翻译区(U TR ) , 使得功能注释比较困难, 但对于EST s 的研究仍是分子研究的一个里程碑。它提供m RNA 群体的轮廓并可以快速对大量已知在细胞群体中表达的基因进行克隆。那些从大量组织中得到的EST s 可以基因克隆、解释组织特异性基因和鉴定新的蛋白[7～12]。特别是, 通过聚类分析EST s 和基于序列重叠的m RNA s 分析找到有用的信息从而找到更长更准确的序列。一个特定基因的EST s 序列比对可以揭示出多态现象, 并且EST s 数据库可用于电子克隆(in silico clon ing ) 。

大规模的EST 工作不仅对组织、器官和细胞特异性、发育阶段特异性和各种处理(如热激、营养饥饿和植物生长调节剂) 应答的基因的发现上有重要意义。而且通过大规模的EST 工作也可以发现大量抗逆性相关基因[13]。

为了找到各种植物、微生物相互作用的有关基因, H inan it 等正在分析30个不同的M . trun 2

[

14]

ca tu la EST s 库。表达框架正在进行序列注释并划分为不同功能组, 得到了特异相互作用(根瘤菌—植物, 菌根菌—植物, 病原菌—植物) 序列的特征。例如, 把线虫M . incog n ita 与M . trunca tu 2

1　植物病理学相关数据源

与基因组小的植物比较, 其基因组序列复杂等原因, , b M ) (M b ) 大基因组展EST s 库。

一个EST 库是一套来源于一个特殊细胞群体的m RNA 专一传递的c DNA 序列(如一个特殊组织、器官、发育状态或环境条件) 。2002年10月22日EST 数据库收录有12, 997, 157个公共条目, 它仍在不断增加。农业上的一些植物以及在农业相关研究中所用的模式植物中重要的EST s 包括:大豆290, 224EST s ; 大麦240, 885EST s ; 拟南芥176, 915EST s ; 小麦257, 022EST s ; 苜蓿170, 500EST s ; 玉米180, 919EST s ; 番茄148, 373EST s ; 水稻110, 132EST s ; 甘蔗84, 712EST s 和马铃薯94, 420EST s 。在针叶树中, 火炬

松木P inus taed a 首先获得60, 226EST s , 被子植物中白杨(欧洲山杨P op u lus tre m u la ×美洲山杨

[5]

P op u lus tre m u loid es ) 获得20, 084EST s 。几个主要的基因组和植物病原菌EST 研究项目最近开始启动[5]。期望能促进病原菌基因组学研究及相关的农业研究。真菌基因预研究计划指导委员会与进行基因组学研究的生物医学研究所协作, 正在对提交的真菌进行基因序列测定, 包括一些重要的植物病原菌如玉米黑粉病菌U sti 2

大麦赤霉病菌F usa rium lag o m ay d is 和小麦、

4期　　　　　　　　　　　　景　岚等:基因组学在植物病理学中的应用　　　　　　　　　　　　　　・65・

la 特异互作的几组EST s 库抽取出来, 进行分析。

其中可能含有与线虫早期侵染所激活的信号转导过程有关的转录因子和蛋白激酶基因序列[5]。

2　植物病理学相关的功能基因组学

随着多种生物基因组测序工作的不断完成和序列信息的积累, 基因组学研究的重点已由结构基因组学向功能基因组学转移。功能基因组学研究中的核心问题包括基因组的多样性与进化规律, 基因组的表达及其调控, 模式生物体基因的研究, 它是结构基因组学的延伸与拓展。功能基因组学研究不仅要阐明基因组内每个基因的作用或功能, 还要研究基因的调节及表达谱, 进而从整个基因组及其全套蛋白质产物的结构、功能、机理的高度去了解生命活动的全貌。

转录组学和蛋白质组学是在基因组水平上对基因表达定量、实时的研究, 进而明确组成有机体的大量基因的产物和功能。列) 物杂交, , 即可确定样品的表达情况以及突变和多态性的存在[15]。微阵列包括基因芯片(Gene Ch i p ) 技术可以准确描述不同组织在不同发展阶段或不同环境条件下m RNA 的表达水平[16]。蛋白质组学是从综合和整体的角度在分子水平把握生命现象。正向的蛋白质组学研究途径可以将蛋白的双向电泳结合大规模的质谱分析从而明确所表达的蛋白[17], 而逆向蛋白质组学可以通过酵母双杂交系统整体勾画出蛋白间的相互作用[18～20]。2. 1　基因表达的调节

的阻遏物, 可由SA R 的获得去阻遏[20]。通过对R . solonacea rum 的几个株系抗性有关的拟南芥R R S 1等位基因的鉴定和分析明确了在病菌诱导的信号途径中W R KY DNA 结合蛋白的参与。在R R S 1-R 中W R KY 基元的鉴定表明C 末端W R KY 基元的激活可能激活一个信号链, 或直接

激活有关的防御基因, 从而引起植物抗性反应[23]。

2. 2　植物对病原菌的反应

植物有效地抵抗病原菌依赖于对病原菌的识别以及防御机制的启动。尽管许多植物的R 基因已被鉴定、克隆, 但与抗性有关的信号转导过程, 寄生物与其亲和植物间的相互作用、建立和维持寄生性方面的机制知之甚少。传统的, 病原菌与植物互作方面的研究集中于一个或几个因子, 这样然而从相对P seud o m onas ae p v . to m a to 侵染拟南芥后, 导致了转录本组的整体改变, 得到13, 000个特有的EST s 。在非亲和病原菌接种24h 后可以观察到从初级的、组成型的代谢到防御反应相关代谢的大量的、短暂的基因表达的变化。EST s 差异性表达包括那些代谢酶、细胞组成蛋白、信号转导蛋白和控制基因表达的有关蛋白及胁迫反应的编码序列。基因表达的变化可以反应出植物代谢的重要变化, 其中有一些过去未发现的与植物防御反应有关的序列[24]。L uo 等利用EST s 技术研究了经白粉病菌诱导后的小麦基因表达, 通过差减杂交筛选出几个与抗性有关的基因[25]。2. 3　病菌毒性

高通量基因表达框架研究最大的优点是可以进一步了解基因所调控的一系列功能, 在基因表达过程中不同范畴的转录本在不同的时间发挥着调节作用。这就可以鉴定出顺式调节元件。已经发现了几个系统获得抗性反应(SA R ) 基因与

PR 21共同表达; 它们共同的启动子含有W R KY

基因组学方法使得了解病菌毒性机制成为可能。Kekarainen 等利用体外基因组转座作用变异机制对马铃薯A 病毒相关的基因组位点进行功能筛选。有关病毒增殖的300多个关键位点被鉴定。并且发现许多与病毒功能有关的新的位点[26]。还有, Gu ttm an 等鉴定了由 型分泌装置产生的效应子蛋白, 该蛋白可能在细菌毒性上发挥中心作用。在拟南芥中这方面的研究基于已知

的P . sy ring ae 基因组序列和保守的氨基酸组成和效应子元件结合了生物信息学预测和作为体内标记的HR 功能测试。重要的是, 通过生物信息学所预测的两个效应子的产生显示对 型分泌装置

转录因子中心结合位点[21]。另外, 在受到大量病原菌包括细菌、真菌、卵菌和病毒侵染时诱导出的基因表现高度保守的类W R KY 启动子基元, 这表明其他的类W R KY 因子可能也与病菌侵染作用有关[22]。

W R KY 转录因子可能是PR 21调节子共同

的依赖[27], 这证实了生物信息学和功能基因组学的结合对病原菌进行研究的学科间综合应用的优势。

2. 4　遗传途径的改变

微阵列研究已经揭示出不同防御反应信号途径的交汇从而形成一个调控植物-病原物相互作

[28]

用的网络系统。Schenk 等用非亲和病原真菌甘蓝链格孢A lterna ria brassicicola 或各种防御反应有关的信号分子如水杨酸(SA ) 、甲基茉莉酮酸酯(M J ) 或乙烯处理拟南芥来研究其互作机制。通过对一个普遍认为与防御有关的基因群体的2375EST s 的研究, 发现了植物对每一个处理(病原菌、SA 、M J 和乙烯) 所表达的差异性基因以及受到SA 、M J 和乙烯处理后大量表达的基因。类似的, SA , M J 或乙烯信号途径受阻碍的拟南芥突变株中, 几个转录因子减少。相比较, 在SA 信号途径有缺陷的拟南芥突变株中几个转录因子的表达降低, 而在M J 增强[22]。微阵列分析鉴定了由生物和非生物胁迫下拟南芥的5个转录因子[22]。另外, 热、盐、干旱、冷胁迫诱导基因在拟南芥受到非亲和病原细菌P . sy ring ae p v . to m a to 侵染时, 特别是在侵染后24h 受到高效调节。这些发现与先前

[29]

D u rran t 等利用c DNA A FL P s 的RNA 指纹技术所得到的结果一致。D u rran t 等用烟草细胞表达番茄Cf 29(番茄抗叶霉菌C lad osp orium f u l 2vum 的有关基因) 证实真菌引发子存在时或受到生理胁迫时诱导A CR E (快速诱发A vr 9 Cf 29) 基因的表达。

另外, Chen 等[22]的研究表明植物对不同病原菌的反应具有相同的特点。他们发现拟南芥的一些转录因子在对细菌(P . sy ring ae ) 、真菌(灰霉病菌B otry tis cinerea ) 和病毒(花椰菜花叶病毒Cau liflow er m o saic viru s ) 的反应上优先被激活。2. 5　蛋白的互作

[30]

Fang 等使用反向蛋白组学验证蛋白与蛋

发现N PR 1不仅与bZ IP 转录因子互作, 而且与丝-苏氨酸受体蛋白激酶, GT P 结合蛋白以及寄主防御反应蛋白互作, 这表明这些蛋白在N PR 1介导的信号途径中发挥作用。

另外, 多组蛋白与水稻同源物P ir 4 5 6互作[30]。这些EFR 家族成员在保守的ER EB P 区域具有相当大的同源性并与番茄对P . sy ring ae 抗性有关的P to 激酶互作[31]。

2. 6　用以研究植物-病原菌互作的模式植物　　研究基因功能最有效的一个方法是观察基因敲除或过量表达后在细胞和整体水平上产生的表型变化, 这就需要选择一个有效的模式基因组。拟南芥是用于植物基因组研究的一个最佳模式植物, 它遍布世界各地, 在绿色植物中基因组最小(140M b ) 。经过美国、欧洲等国科学家的共同努力, 2000, ]。

, 但大量的植物病理学的研究使用了拟南芥。对拟南芥的长约1. 9M b 基因组的分析显示, 约14%的基因与抗病性

具有潜在的关系[32]。对植物抗病基因的研究表明尽管具NB S (N ucleo tide B inding Site ) 结构特性的基因未必都是抗病基因, 但NB S 却是一类常见的抗病基因结构特征。从拟南芥一半的基因组(约67M b ) 的测序分析中检测到120个具NB S 结构特征的基因[33], 因而约1%的拟南芥基因含有

对占水稻基因组5%的BA C 末端测NB S 保守区。

序分析表明在水稻基因组中大约有750～1500个编码NB S 保守区的基因[34]。

确定拟南芥作为作物研究的模式植物作用有多大, 特别是解释植物与有害生物互作的快速进化、高度变化机制方面是非常重要的。虽然已经确立共线性理论, 但是它在植物抗逆性中的应用还在萌芽阶段。对抗病基因而言, 宏线性的利用是有限的, 这主要是因为抗病基因的宏线性较差。例如在拟南芥抗性植株中, 抗性基因R PM 1两端有两个假设基因GT P 和M 4, 但在拟南芥的敏感株中缺R PM I 基因同源区; 在芸薹中有6个相似于拟南芥的R PM 1位点, 但仅有两个位点含有一个拷贝的R PM l [14]。

已在水稻中鉴定出许多R 基因同源序列, 而一些同源序列在拟南芥中较丰富却在水稻中较缺

白之间的互作。通过研究接种稻瘟病菌M . g risea 孢子7天的水稻幼苗的c DNA 库在酵母中表达的蛋白与水稻中各种与抗性和防御信号转导途径有关的蛋白的互作, 其中包括与拟南芥防御反应中一个关键的调控因子N PR 1同源的水稻蛋白,

乏。如在氨基末端编码T I R (To ll 2杀菌素1受体) 基元的具有核苷酸结合位点的富亮氨酸重复区(NB 2L RR s ) 蛋白。其他的, 特别是那些控制病害抗性的信号转导链在水稻中是很丰富的, 这样就影响了与拟南芥直系同源物的比对[35]。另外, 在玉米中, 对病原菌抗性反应有关的蛋白与拟南芥中含有的蛋白截然不同且没有直系同源物[36]。

因此, 包括对病菌感病、抗病的相关遗传复合体的研究在种间进行时会更加复杂。专一性的研究作物、病原菌组合是非常必要的, 这样可以不依赖于利用模式植物通过比较生物学的方法获得的结果来确定作物的抗(感) 病性。

朝着改进计算工具及实验技术方向前进, 进而获得更准确的数据和分析结论。基因组学的研究也存在一些内在的困难, 包括大量变量数据并且缺乏标准。另外, 将数据转化为可用知识的计算工具还不成熟。

利用基因组学研究所获得的知识是非常重要的, 生物信息学方法由于数据破译问题还存在有不足。所发生的时间、空间的事件被大大地忽视了, 如植物对病原菌的反应、植物对微生物的细胞特异性反应的大量数据还未获得。另外, 植物与微生物接触面模式的相似性不一定能代表生物事件的一致性。因此基因组学数据明显不能提供传统的“特定时期特定基因”研究方法所获得的结果。

虽然基因组学研究方法还存在不足, 但仍会促进对候选基因的选择从而对单个基因进行深入研究。, , 这样能够-病原菌生物学关系的全面了解。

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3　基因组学在植物病理学领域的应

用前景

　　基因组学和后基因组学研究期望能提供植物生物过程一个全面的了解, 特别是在病原菌和植物互作方面。另外后基因组学也可以并且应该用于植物病理学研究。值的资源[]测存在的抗原或用抗原检测抗体蛋白的蛋白组学研究[39], 针对检测生物系统代谢过程的代谢组学研究[40]也应该结合进来。

为了增强植物抗性, 综合的基因组学研究可以加强对最适合调控的候选基因的选择, 而且可以预测更为准确的调控结果, 更深入地理解植物作为“寄主”的遗传途径。类似的, 作为复杂的有机体, 对病原菌生物学的深入了解更显示出其在农业上的重要性, 因此任何有关基因组学的研究都能够促进新防治方法的产生。例如可以针对特异病原菌的基因遗传方式发明一个新的除草剂或杀菌剂。传统的研发过程包括喷洒各种化学药剂处理杂草和病菌, 期望从中找到一种能杀死病菌而对作物无害的药剂。一旦发现了合适的药剂, 还要开展大强度的遗传、生理及生化方面的研究来鉴定杂草或真菌何种蛋白受到了影响。这种传统方法费时、昂贵且成功率小。通过针对杂草或病菌特异基因及其遗传方式的研究方法将会大大加快对环境无害的除草剂和杀菌剂的发明。

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