虚拟实验报告

第一章 文献综述

1.1 丙酮酸脱氢酶概述

丙酮酸脱氢酶复合体（Pyruvate Dehydrogenase Complex）催化丙酮酸不可逆的氧化脱羧转化成乙酰辅酶A 。该复合体是糖酵解的关键限速酶，产物乙酰辅酶A 进入三羧酸循环和氧化磷酸化。丙酮酸脱氢酶复合体在细胞能量代谢调控中的作用至关重要(Skorokhodova et al., 2011)。

在原核生物中，丙酮酸脱氢酶复合体存在于细胞质中。在哺乳动物细胞中，丙酮酸脱氢酶复合体主要定位在线粒体上，整个复合体的各个组成酶都是由核基因编码的，在核糖体上表达，转运到线粒体中。高等植物细胞有两种不同的丙酮酸脱氢酶复合体形式，一种是线粒体丙酮酸脱氢酶复合体，另一种是定位在质体基质中的质体丙酮酸脱氢酶复合体。目前认为，线粒体丙酮酸脱氢酶复合体催化反应生成的乙酰辅酶A 进入三羧酸循环彻底氧化产生能量，而质体丙酮酸脱氢酶复合体催化反应生成的乙酰辅酶A 则进入脂肪酸合成途径(Bhavnani and Wallace, 1990)。

1.2 丙酮酸脱氢酶结构研究

原核细胞如大肠杆菌的丙酮酸脱氢酶复合体由丙酮酸脱氢酶(E1，EC 1.2.4.1)、二氢硫辛酸乙酰转移酶(E2，EC 2.3.1.12)、二氢硫辛酸脱氢酶(E3，EC 1.8.1.4)组成，这三个组成酶都结合了不同的辅助因子，其中E1结合了辅助因子焦磷酸硫胺素（thiamin diphosphate ，TPP ）和Mg2+；E2的赖氨酸残基上共价结合了硫辛酸(lipoic acid) ；E3紧密结合了FAD 分子。整个复合体由24个E2单体构成核心框架结构，24个E1单体和6个E3单体结合在E2核心框架上(Bosma et al., 1982)。

真核生物的丙酮酸脱氢酶复合体除了含有上述的E1、E2、E3外，还有调节它活性的丙酮酸脱氢酶激酶（Pyruvate Dehydrogenase Kinase ）、丙酮酸脱氢酶磷酸酶（Pyruvate Dehydrogenase Phosphatase）以及E3结合蛋白（E3 Binding Protein）。整个复合体核心框架结构由60个E2单体以及12个E3结合蛋白单体组成，在其周围结合有20－30个E1异型四聚体（22）、6－12个E3同型二聚体、1－2个丙酮酸脱氢酶激酶同型/异型

22四聚体的形式存在，和亚单位的分子量分二聚体以及2－3个丙酮酸脱氢酶磷酸酶异型二聚体(Kresze and Ronft, 1981)。 人丙酮酸脱氢酶复合体E1是以位点位于和别是41和36 kDa。根据人E1的X-射线晶体结构，辅助因子焦磷酸硫胺素和Mg2+的结合二个亚基之间的界面处的深沟内。

人丙酮酸脱氢酶复合体E2含有四个结构域：两个硫辛酸结构域(lipoyl domain)，每个硫辛酸结构域的一个赖氨酸残基上共价结合了一个辅助因子硫辛酸；一个亚基结合结构

域（subunit-binding domain ），与E1相结合；一个核心结构域（inner domain or core domain ），60个E2通过这个核心结构域结合在一起。硫辛酸结构域的赖氨酸残基侧链氨基和硫辛酸共价结合形成了一个长的“摇动的手臂”连接E1、E2和E3的活性中心，将底物和产物传送到不同的活性中心。E2的四个结构域之间由富含脯氨酸和丙氨酸的连接区域连接，连接区域的多肽链形成柔性的无规卷曲构象。人丙酮酸脱氢酶复合体中的E3结合蛋白是一种和E2类似的亚基，它由一个硫辛酸结构域、一个结合E3的亚基结合结构域以及一个核心结构域组成。目前，E2的整体三维结构还没有文献报导，只得到了它的部分结构域的三维结构，如使用X-射线散射和电子显微镜技术测定的核心结构域形成的多聚复合体的低分辨三维结构(Schulze et al., 1991)。

和真核生物不同，大肠杆菌E1是同一单体形成的非对称二聚体，E1单体由886个氨基酸残基组成。焦磷酸硫胺素和Mg2+结合在二个亚基之间的界面处，E1的 N－末端结构域（1－55氨基酸残基）三维结构无法在X-射线晶体衍射中得到，将E1的N －末端16－25、26－35、36－45氨基酸残基分别去除的突变体没有活性，而去除46－55氨基酸残基的突变体仍保持活性；同时，对E1的7－15氨基酸残基进行的点突变研究也证明E1的N-末端结构域对于整个大肠杆菌丙酮酸脱氢酶复合体的活性以及E1和E2之间的结合非常重要。随后的核磁共振研究发现N －末端结构域和E2的亚基结合结构域而不是硫辛酸结构域结合。利用三维结构预测软件对这55个氨基酸序列进行预测，结果显示它可能含有2个-螺旋，与E2的亚基结合结构域的-螺旋相互结合(Arjunan et al., 2002)。

由于人E1的β亚基有辅助因子焦磷酸硫胺素和Mg2+的结合位点，人E1的β亚基的结构就是我感兴趣的。

第二章 序列的获得和载体构建

在设计之前，要先明确所要使用的表达载体，我想表达的是人丙酮酸脱氢酶的E1的β亚基，然后通过一系列纯化后，进行核磁共振解析其蛋白质三维结构(Lessard and Perham, 1994)。

我考虑使用pET32a 表达载体，进行原核表达，因为该载体上有HisTag 标签，可以用Ni 离子亲和层析柱纯化，该载体还含有Amp 抗性基因，另外，其Nco Ⅰ之前存在肠激酶切点EK ，在Ni 柱纯化完成后可以进行酶切，将杂蛋白切掉，只保留目的蛋白，然后用分子筛层析进行最后的分离，纯化效果应该不错。

选择酶切位点Nco Ⅰ和Xho Ⅰ，设计引物时目的蛋白质序列在Nco Ⅰ开始插入，在Xho Ⅰ后添加终止密码子TAA ，目的蛋白质会从TrxTag 中的ATG 开始表达，直到TAA 结束。

2.1 序列获得和引物设计（PP5设计引物）

首先，从ncbi 上下载了人丙酮酸脱氢酶的E1的β亚基序列，

再以FASTA 格式下载下来

PP5中打开文件

由于这是人丙酮酸脱氢酶E1组成酶的β亚基，因此在实际的基因组中，两端仍然有序列，为了扩增出整段基因，在这段基因的两端加了连续的A （其他碱基也可以）, 便于后续对引物编辑，如添加酶切位点，加A 或T 减小GC 含量，添加保护碱基等。

添加的6个A

添加的6个A

检测片段内的酶切位点，在Enzyme 中选择所需查找的Nco Ⅰ和Xho Ⅰ切点，然后检测。

结果表明片段内没有所要添加的酶切位点，因此可以在引物上添加。

点击Primer 图标设计引物

选择上游引物S ，这是还未做任何编辑修改，可能会出现Dimer （二聚体）、False Priming （错配）或者Cross Dimer （上下游引物之间二聚体）等情况，另外GC 含量可能不太合适。不过，通过Edit Primers功能可以修改引物，来尽量避免这些情况。

这是Edit Primers界面。

通过编辑，在前面在所人为加的10个A 的位置上，添加Nco Ⅰ切点。

再来进行下游引物的设计，选择A ，然后将引物移到最右边

加上Xho Ⅰ切点和TAA 终止子。

这样，上下游引物的Tm 值之差为2℃左右，上下游引物的GC 含量也都在正常范围内。但是错配依然没有办法避免，因为要扩增整段基因，引物位置不能做大范围变动，单纯增加引物长度也无法避免错配，因此，初步结果就是这样。

上游引物5' ATACCATGGCCCTGCAGCTGTGATC 3'

下游引物5' CTCGAGTTAGGCTGCGTGACCCGC 3'

2.2 PCR产物与表达载体的连接（Geneious 4.8.5软件设计）

首先找到pET32a 表达载体上的酶切位点Nco Ⅰ和Xho Ⅰ，然后将PCR 虚拟产物连接进去。

把酶切位点之间的序列替换成PCR 产物的序列即可。注意，图中显示的序列是与PCR 虚拟产物反向互补的，因此在插入PCR 虚拟产物时，要先把其改成反向互补的。用PP5可以很方便的得到一个序列的反向互补序列，或者把载体反向互补过来。

将得到的PCR 虚拟产物序列重新粘贴入PP5，这时，他会提醒，有4个选项分别是，按照原状、反向的、互补的和反向互补的，选择反向互补就可以得到和Geneious 软件中序列平行的序列，便于插入。

得到的序列为

CTCGAGTTAGGCTGCGTGACCCGCCCACCCGCCCACCGGGTGAGGGGCCGCGGGGCCGGGCTGAGGTGGCGTGTGGG TGGCCGTGCCCCTCTGCCTGGAGCCGCCTCAAATCAACTTTATTGACAGTAGGCGGTGACCGACAGGCGGGGTGCAC GCTGGGCACACGTGCCTGGTCGGTGTTACTTGAAGCGTGGGGACTAGAGTCAGACCCTGAGGAGCATGATCTCTGGA AGCTGGAGAGACCTTAAGAGTTTAGGCCAACCTGTTGTGGGTGCTGGAATCCTTTGGGCACCAAGAGTGCTTGCACA CGCTCTACTGATGGGGAACTTAACACTTCATGAGTGAGTCTAGTCTTCCCTGGACAGTGCTGTCTGTTGATTCCTTA TAATGCACATCATAGCTTTCATTGATTGCATTAAGCACCTACTGTGAGCCAAGCATTGAGATATGTGCTGTATAGCT CATTCTCACAGTACCCCACTTGGGTAATTAGTGTTATTATTATCTCCATTTTGAAGACGGTTAAACTGAAGCAGAAA TTGATTAAATGAGCCGATATTTTAATTTAGGACTGTCTTGACTCTAAAGCATGGTCTTTTTCCCACTGCCTTCCTAA AGCAGAAGTGGATTCCTGCTTGGGGGAAGGTTACAACAACTTTAGAGAAGGGCGGCCCTATGGATGTAGCAGGACAA GCCGCAGACGAAACTCCTCAGACACCGAGTTAAAGAAGGAAGGGGTTTATTCGGCCAGGGGCATGGGCAAGACTCTT GTCTCAAGAGCCGAGCTCCCCGAATGGGCAATTCCTGTCCCTTTTAAGGGCTCACAGCTCTAAGGAGGTGTGCGTGA GAGGGTCATGATTGATTTGAGCAAGCAGGGGGTATGTGACTAGGGGCTGCAAGCACCGGTAATTAGACTGGAACAGG ATAGGGATTTTCACAGTGCTTTTCTATACAATGTCTGTAATCTATAGTTAACATAACCGATTAGGTCGGGGTCGATC TTTACCAGGCCCAGGGTGTGGCACCAGGCTGTCTGTTTGTGGATTTCATTTCCTGCCTTTTAGTTTTTACTTTTTCT TTCTTTGGAGGCAGAAATTGGGCATAAGACAATATGAGGGGTGGTCTCCTCCCTTATGGGGAGGTGCCAAACACTTG GCCATAGGGACAACCTCTGGAAGCTCATTAGTCTTAATTTGGCCCTTGGGGGTCAGATGGGACAATTGAGCACCCAG TCTCCACCCATCCCCAAGACCATTCCAAAATTCCCTTCTATGGATCACAGCTGCAGGGCCATGGTAT 插入后的结果见下图，

黄色部分为插入的外源片段。目的片段表达到Xho Ⅰ之前的终止子结束。

2.3 蛋白质表达

蛋白质表达是从Start 开始到End 终止，通过PP5将核酸序列转化成蛋白质序列，

蛋白质表达预测结果

2.4 蛋白质序列基本属性预测

可以采用网站Expasy 提供的ProtParam 工具，见下图

然后输入蛋白质氨基酸序列，

然后模拟蛋白质性质。接着，就会得到基本信息

如等电点、氨基酸数、分子质量和各种氨基酸所占的含量等数据，都会被预测出来，方便以后对蛋白质含量和性质等的研究。

第三章 E.coil 丙酮酸脱氢酶系E1 beta亚基的原核表达与纯化

获得的目标序列经过T-A 克隆，双酶切，连接反应连入表达载体pET 32a。将pET 32a转化入表达菌株BL21（DE3），进行融合表达。利用肠激酶将标签和目的蛋白切开从而获得目的蛋白1-55结构域。

6×His-Tag 亲和层析以及凝胶过滤等手段是纯化蛋白质手段。利用pET 32a在5’端带有的6×His-Tag 对细胞裂解液进行初步的纯化，获得带有Trx 标签和His-Tag 的目的蛋白，经过重组牛肠激酶切割后，再进行一次6×His-Ni 柱纯化，收集未结合部分。最后通过凝胶过滤纯化脱盐获得目的蛋白。

3.1 实验材料与试剂

3.1.1 菌株与载体

菌株DH5α，BL21（DE3）系本实验室保存；载体pET-32a 系本实验室保存。pMD18-T

载体够自TaKaRa 公司；pET-22b —E1、pET-22b —1-lipol 重组质粒系本实验室保存。 3.1.2 主要试剂

T-A 连接试剂盒，限制性内切酶Nco I、Xho I，普通Taq 酶

胶回收试剂盒，dNTP ，考马斯亮蓝染液，β-巯基乙醇，TEMED ，甲叉双丙烯酰胺； IPTG ，SDS ；

酵母提取物，胰蛋白胨； 小量质粒提取试剂盒；

丙烯酰胺、硼酸、甘氨酸、琼脂；

T4连接酶； 高保真Taq 酶；

牛重组肠激酶、引物合成；

鸡卵清溶菌酶，PMSF ，苯甲脒，氨苄青霉素； 透析袋；

层析柱材Ni Sepharose 6 Fast Flow，Superdex 75； 同位素15N 、13C ；

咪唑，无机盐试剂等其他常规试剂。

3.1.3 主要仪器

PCR 仪；台式高速冷冻离心机；可见分光光度记；电泳设备；台式小型离心机；可见

光凝胶投射仪；紫外分光光度计；分析天平、精密天平、pH 计；恒温摇床、培养箱；超声波细胞粉碎仪；超纯水仪；水浴锅；超净工作台；核磁共振仪

3.2实验步骤

3.2.1 小量质粒抽提（PUEX 试剂盒法） 见附录B

3.2.2 PCR扩增目的片段 1. 引物设计（如第二章）

2. 质粒模板预先按照浓度用ddH2O 稀释200-300倍，按下表加入试剂，并小心混匀。模板为实验一中提取的质粒DNA 。

PCR 体系

PCR 体系 ddH 2O 10×PCR buffer Mg （25mM ） dNTP （2.5mM ） Primer E1（10μM ） Primer E2（10μM ） 模板E1—pET-22b 重组质粒

高保真Taq 酶

表3-1

2+

体积（50μl ） 31.5μl 5μl 4μl 1μl 2μl 2μl 1μl 1U

3. 设置PCR 程序:

PCR 条件

预变性 变性

退火 延伸 补平

E1 beta体系 94℃ 4min 94℃ 1min 57℃ 1min 72℃ 30s 72℃ 7min

保存

30个循环 表3-2

16℃

4. 运行PCR 程序

5. PCR结束后，立即置于冰上，取5μl 用2%琼脂糖凝胶电泳检测。 3.2.3 胶回收目的DNA 片段（天恩泽试剂盒法） 见附录C

3.2.4 胶回收目的片段的T-A 克隆

1. 在微量离心管中配制下列DNA 溶液，全量为5μl 。

胶回收条件

pMD18-T Vector 胶回收产物

表3-3

1 μl 4 μl

2. 加入5 μl 的 Solution I。 3. 16℃反应60min 。

3.2.5 CaCl2法大肠杆菌感受态的制备及转化（DH5α，BL21（DE3））

1. 从LB 平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落，接种于3-5ml LB液体培养基中，37℃下振荡培养12小时左右，直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中，37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。

2. 将培养液转入1.5ml 离心管中，冰上放置30分钟，然后于4℃下4000 rpm离心3min 。 3. 弃去上清，用预冷的0.1M 的CaCl2溶液250μl 轻轻悬浮细胞，4℃下8000 rpm离心1min 。4. 弃去上清，用预冷的0.1M 的CaCl2溶液250μl 轻轻悬浮细胞，冰上放置30分钟后，4℃下8000 rpm离心1min 。

5. 弃去上清，加入50μl 预冷的0.1M 的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，即成感受态细胞悬液。

6. 将3.2.4获得T-A 连接产物与50μl DH5α感受态细胞混匀，冰上静置30min 。 7. 将上一步的感受态细胞于42℃热激90s ，然后迅速放于冰上冷却。 8. 在感受态细胞中加入200μl LB液体培养基，37℃ 200rpm 复苏45min 。

9. 将复苏过的细胞悬液直接涂布到含有Amp 抗性的LB 平板，37℃培养过夜。 3.2.6 挑取阳性克隆PCR 检测

1. 挑取阳性克隆，转移到另一LB 平板上后接种至4ml LB液体培养基。 2. 提取阳性克隆质粒，如步骤3.2.1。

3. 将获得的质粒用相应引物进行PCR 检测，如步骤3.2.2。 4. 保存所有PCR 有阳性反应的剩余质粒，进行下一步操作。 3.2.7 获得pET-32a 载体（如步骤3.2.1） 3.2.8 载体与目的片段的双酶切 1. 按如下体系加入各种试剂：

双酶切条件

ddH 2O 1%BSA 10×Buffer K

Nco I Xho I 质粒

目的片段（100μl ）

22μl 10μl 10μl 4μl 4μl 50μl

37℃反应2h 表3-4

pET-32a 载体（50μl ）

16μl 5μl 5μl 2μl 2μl 20μl

2. 酶切后的DNA 样品用1%琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收目的片段，如步骤3.2.3。 3.2.9 目的片段与载体pET-32a 的粘端连接 1. 按如下体系加入各种试剂：

连接体系

T4 连接酶

1U

10×Buffer 2μl 目的片段（PSBD 、1-55） 15μl

pET-32a 载体 3μl

室温（约20℃）放置过夜

表3-5

2. 将连接产物转入50μl DH5α感受态细胞，进行转化，如步骤3.2.5。

3.2.10 提取重组质粒转化BL21（DE3）（如步骤3.2.1, 3.2.5） 3.2.11 重组质粒的检测

1. 挑选阳性克隆提取质粒（如步骤3.2.1），以相应的引物进行PCR 检测（如步骤3.2.2）。 2. 对PCR 有阳性反应的质粒进行单双酶切检测，按一下体系加入各种试剂:

检测体系

ddH 2O 1%BSA

10×Buffer K

Nco I Xho I 质粒

单酶切（25μl ） 双酶切（25μl ） 对照（25μl ）

9μl 2.5μl 2.5μl - 1μl 10μl 37℃反应2h 表3-6

8μl 2.5μl 2.5μl 1μl 1μl 10μl

15μl - - - - 10μl

4. 反应结束后，取5μl 样品用2%琼脂糖凝胶电泳检测。 5. 取酶切阳性质粒测序，校对读码框。 3.2.12 目的蛋白的诱导表达

1. 取3.2.11中的阳性克隆，接于40ml LB液体培养基，37℃ 250rpm振荡培养过夜。 2. 5000rpm离心5min 收集菌体，用适量M9极限液体培养基（15N ，13C 标记）重悬菌体。 3. 将菌液加入1L M9液体培养基，将OD600调至0.1左右。

4. 37℃ 250rpm振荡培养至OD600=0.6-0.8，转入20℃培养30min ，加入10mM IPTG诱导过夜。

5. 收集20μl 菌液作为样品I 。 3.2.13 菌体的破碎

1. 8000rpm离心5min 收集菌体，弃掉上清。用25ml 裂解缓冲液重悬清洗细胞。 2. 8000rpm离心5min 收集菌体，弃掉上清。-20℃冷冻30min 至过夜。

3. 用25ml 裂解缓冲液重悬菌体，加入1×溶菌酶和1×PMSF ，冰上反应15min 。然后加入适量DNase 与RNase ，冰上反应30min 。

4. 超声破碎菌体：功率120W ，工作4s ，停止4s ，共进行15min 直至菌体菌液开始清亮。

5. 10000rpm，4℃离心20min ，弃掉沉淀，收集上清。取20μl 上清液作为样品II 。 3.2.14 Ni柱亲和层析

1. 取一个干净的6ml 亲和管柱，加入3ml Ni Sepharose 6 Fast Flow柱材，静置片刻至柱材沉淀。

2. 用5倍柱体积（30ml ）ddH2O 清洗柱材。

3. 转用5倍柱体积（30ml ）Binding Buffer平衡Ni 柱。 4. 将3.2.13的上清液加入5mM 咪唑上样。

5. 用5倍柱体积（30ml ）Binding Buffer洗脱杂质蛋白。

6. 停止层析，在柱面上小心地加入2ml Elution Buffer，静置5min 。

7. 用5倍柱体积（30ml ）Elution Buffer洗脱目的蛋白，收集前10ml 洗脱液。取20μl 为样品III 。

8. 继续用5倍柱体积（30ml ）ddH2O 清洗柱材后，保存Ni 柱。 3.2.15 透析与肠激酶酶切

1. 将透析袋用水清洗干净，将上述洗脱液加入1×苯甲脒后，转移至透析袋中，两端封口（戴手套操作）。

2. 准备2L 肠激酶的反应缓冲液作为透析液，分两个1L 烧杯装，于4℃预冷。

3. 将透析袋放入透析液中，4℃透析5h 后转入另一份透析液，4℃透析过夜。透析过程中，用搅拌子不断搅拌。

4. 将透析液转移至50ml 离心管中，5000rpm 4℃离心5min 除去沉淀。

5. 测定透析液的OD280以初步确定蛋白质的含量，按照500mg/U的比例加入肠激酶，25℃酶切24h 。取20μl 作为样品IV 。 3.2.16 Ni柱亲和层析除去融合标签

1. 步骤如3.2.14，改收集所有步骤5的洗脱液，浓缩成5ml 。取20μl 作为样品V 。 2. 作为对照可以收集Elution Buffer作为参考。取20μl 作为样品VI 。 3.2.17 凝胶过滤

参考文献

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Anaerobic synthesis of succinic acid by Escherichia coli strains with activated NAD+ reducing pyruvate dehydrogenase complex. Prikladnaia biokhimiia i mikrobiologiia 47, 415-423. Bhavnani, B.R., and Wallace, D.G. (1990). Ontogeny of pyruvate dehydrogenase complex and key enzymes involved in glycolysis and tricarboxylic acid cycle in rabbit fetal lung, heart, and liver. Biochemistry and cell biology = Biochimie et biologie cellulaire 68, 1210-1217. Bosma, H.J., de Graaf-Hess, A.C., de Kok, A., Veeger, C., Visser, A.J., and Voordouw, G. (1982). Pyruvate dehydrogenase complex from Azotobacter vinelandii: structure, function, and inter-enzyme catalysis. Annals of the New York Academy of Sciences 378, 265-286. Kresze, G.B., and Ronft, H. (1981). Pyruvate dehydrogenase complex from baker's yeast. 2. Molecular structure, dissociation, and implications for the origin of mitochondria. European journal of biochemistry / FEBS 119, 581-587.

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