凡纳滨对虾肌肉组织cDNA全长文库的构建
南方农业学报2011，42（1）：86-89JournalofSouthernAgriculture
南方农业学报
凡纳滨对虾肌肉组织cDNA全长文库的构建
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熊建华1，高永华1，，马宁1，盛小伟1，，陈晓汉1*
（1广西水产研究所遗传育种与健康养殖重点实验室，南宁530021；2桂林理工大学化学与生物工程学院，广西桂林541000）
摘要：【目的】为了在短期内获得大量凡纳滨对虾肌肉组织的功能基因表达信息，为深入了解功能基因在凡纳滨对虾肌肉组织中的表达提供分子生物学依据。【方法】通过构建凡纳滨对虾肌肉组织的全长cDNA文库，并进行EST测序分析。【结果】文库质量分析表明，初始文库库容约8.50×106CFU，重组率在95%左右，插入片断大小为0.5～4.0kb，多数在1.0kb以上。随机测序72条cDNA，可得到有功能注释的37条全长cDNA和18条编码未知蛋白的基因序列。通过GeneOntology功能分类可将有功能注释的37个基因分为蛋白质合成、细胞骨架、细胞信号传导、代谢、转运、能量、转录、抗病及防御、生殖发育和未知功能基因等10类，其中蛋白质合成类基因最多(27.03%)，与细胞骨架(13.51%)、细胞信号传导(13.51%)及代谢类基因(13.51%)共占67.56%。【结论】构建凡纳滨对虾肌肉组织的全长cDNA文库，可实现短期内获得大量凡纳滨对虾肌肉组织的功能基因表达信息。
关键词：凡纳滨对虾；肌肉组织；cDNA全长文库；生长性状中图分类号：S945.1
文献标识码：A
文章编号：2095-1191（2011）01-0086-04
ConstructionofthefulllengthcDNAlibraryfrommusculartissueofLitopenaeusvannamei
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XIONGJian-hua1，GAOYong-hua1，，MANing1，SHENGXiao-wei1，，CHENXiao-han1*
（1KeyLaboratoryofAquaticGeneticBreedingandHealthCultivation，GuangxiFisheryResearchInstitute，Nanning530021，
China;2CollegeofChemistryandBioengineering，GuilinUniversityofTechnology，Guilin，Guangxi541000，China）Abstract：【Objective】ThestudieshadbeenundertakeninordertounderstandthebiologicalbasisofexpressionoffunctionalgenesinmusculartissueofLitopenaeusvannamei.【Method】ThefulllengthcDNAlibraryfrommusculartissueofLitopenaeusvannmeiwasconstructedandexpressedSequenceTags(ESTs)weresequenced.【Result】Theconstructedli-brarywas8.50×106CFUincapacitywith95%recombinantcoefficient.ThePCRresultsshowedthattheinsertsrangedfrom0.5to4.0kbandmostofthemwerelargerthan1.0kb.72cloneswererandomlyselectedandsequencedforfulllength.Ofwhich，37cDNAsequenceswereidentifiedwithknownfunctions，and18cDNAsequencesremainedasuniden-tified.Usinggeneontologyfunctionclassification，37cDNAsequenceswithknownfunctionwereclassifiedintogroupsofproteinsynthesis，cytoskeleton，signaltransduction，metabolism，transporter，energy，transcriptionfactors，responsetodisease/defense，reproductiondevelopmentandunknownfunction，respectively.Theproteinsynthesis-relatedgeneswerethehighestinnumber(27.03%)，followedbycytoskeleton(13.51%)，signaltransduction(13.51%)，andmetabolism(13.51%)，whichcollectivelyaccountedfor67.56%ofthetotalidentifiedgenes.【Conclusion】TheinformationinconstructedfulllengthcDNAlibraryofLitopenaeusvannmeimusculartissuecanbeusedinfurtherstudiesrelatedtotheexpressionandfunctionofgenesinLitopenaeusvannmei.
Keywords:Litopenaeusvannmei;musculartissue;cDNAlibrary;growthtraits
0引言
【研究意义】凡纳滨对虾(Litopenaeusvannmei)又称南美白对虾，原产于中南美洲，具有对水环境抗逆能力强、营养要求低、生长速度快、虾体含肉量高、对盐度适应范围广、离水存活时间长和抗病力
强等优点，与斑节对虾、日本对虾成为目前世界养殖产量最高的三大虾种。但目前我国的凡纳滨对虾种质严重退化，存在杂合度降低、遗传力减弱、抗逆性差、性状退化等问题，且病害频发，严重制约了凡纳滨对虾养殖的健康发展，因此加强凡纳滨对
收稿日期：2010-10-23基金项目：国家科技支撑计划项目(2008BADB9B03)；国家虾产业技术体系岗位科学家经费项目(nycytx-46)；广西直属公益性科研
院所基本科研项目(2060302GXIF-2008-02)；广西自然科学基金项目(桂科自0991106)
作者简介：熊建华(1976-)，男，湖北鄂州人，博士，助理研究员，主要从事分子遗传学研究工作。*为通信作者，E-mail：chenxhan@gmail.
com。
熊建华等：凡纳滨对虾肌肉组织cDNA全长文库的构建
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虾基础生物学方面的研究迫在眉睫。【前人研究进展】cDNA文库的构建和EST测序分析是研究动物基因转录组学和筛选差异表达功能基因的有效手段。目前，已有大西洋三文鱼（Salmosalar）（Adzhubeietal.，2007）、cDNA的长距离PCR(LD-PCR)，然后合成双链cDNA。1.4cDNA的纯化与回收
参照试剂盒说明，取50.0μL双链cDNA，加入2.0μL蛋白酶K，45℃保育20min消化残存的Taq酶。纯化斑马鱼（Brachydaniorerio）（Loetal.，2003）、大西洋比目鱼（Hippoglossus）（Douglasetal.，2007）、虹鳟（Salmogairdnerii）（Govorounetal.，2006）、鲤（CyprinuscarpioL.）（SavanandSakai，2002）、刺参（Stichopusjaponicus）（徐赛涛等，2007）和栉孔扇贝（Chlamysfarreri）（王崇明等，2006）等多种水生生物cDNA文库的相关研究报道。在对虾方面，王艺磊等（2003）构建了日本对虾精巢和卵巢全长cDNA文库；张晓军等（2005）以中国对虾血液、眼柄、卵巢、雌虾头胸部、雄虾头胸部和三倍体对虾头胸部组织为材料，构建了6个高质量cDNA文库；刘萍等（2008）运用SMART技术构建罗氏沼虾促雄腺cDNA文库，并在筛选的114个阳性重组克隆中随机挑取24个克隆测序，得到12条EST序列(4个cDNA功能基因、4个rRNA、4个新基因)。【本研究切入点】构建cDNA文库是研究生物功能基因组的基础，而构建全长cDNA文库能够使人们通过一次阳性筛选，就能获得基因的全长序列，从而缩短了获取基因的全长信息所需时间（Zhaoetal.，2009）。【拟解决的关键问题】采用SMART技术建立凡纳滨对虾肌肉组织的cDNA全长文库，并进行EST测序分析，以期在短期内获得大量凡纳滨对虾肌肉组织的功能基因表达信息，为深入了解功能基因在凡纳滨对虾肌肉组织中的表达提供分子生物学依据，为从分子水平理解和调控凡纳滨对虾的生长和代谢奠定基础。
1材料与方法
1.1试验材料
凡纳滨对虾（选择一个生长性状分离的对虾家系）由广西水产研究所南美白对虾良种场提供，试验前于水族箱中暂养7d(盐度28‰、水温28℃、增氧机增氧)，使其适应室内养殖环境。Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，CreatorSmartcDNALibraryConstructionKit购自宝生物工程(大连)有限公司，mRNAIsolationSystemIV试剂盒购自美国Promega公司，cDNA纯化柱购自Pharmacia公司，其他常规试剂及耗材均为国产或进口分析纯。
1.2总RNA提取及mRNA纯化
取凡纳滨对虾肌肉组织，液氮迅速冷冻后，采用Trizol试剂提取总RNA，提取的总RNA于紫外分光光度计上测定纯度和浓度，并用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳/EB染色检测总RNA的质量。总RNA于-80℃保存备用或按照mRNAIsolationSystemIV试剂盒说明纯化mRNA。
1.3LD-PCR法合成双链cDNA
取1.0～3.0μL纯化的mRNA按CreatorSmartcDNALibraryConstructionKit说明操作，进行第一链合成及
回收cDNA，50℃下SfiI酶切2h产生粘性末端。将酶切产物过cDNA纯化柱，每管过柱收集物取3.0μL，用1%琼脂糖凝胶电泳检测，收集含有cDNA的前3管。将双链cDNA用切胶回收的方式除去短片段，回收试剂盒进行凝胶回收。
1.5cDNA与载体pDNR-LIB连接及产物的电转化
将cDNA定向连至pDNR-LIB(克隆位点：基因5'端为SfiIA、基因3'端为SfiIB)载体上，在10.0μL体系中，即cDNA1.0μL、500ng/mLpDNR-LIB1.0μL、10×LigationBuffer1.0μL、T4DNA连接酶1.0μL、去离子水6.0μL，16℃连接过夜。连接产物用电穿孔法转入大肠杆菌JM109感受态细胞中，然后用氯霉素培养基选择培养。1.6文库质量评价
取1.0μL上述原始文库，用LB培养基进行10-3～10-6稀释后，涂布于含30μg/mL氯霉素的LB培养基上，进行文库滴度测定。随机挑选菌落，采用M13通用测序引物，通过菌落PCR方法，估测文库的重组率，并通过电泳分析cDNA插入片段的分布范围，鉴定文库插入片段长度。PCR程序为：94℃预变性3min；94℃30s，54℃1min，68℃3min，进行30个循环；72℃延伸10min。1.7DNA测序和序列分析
随机选取经过菌落PCR鉴定确认含有重组质粒的菌落，经过夜培养后送至北京华大基因研究中心测序，测序结果通过BLAST进行核苷酸同源性分析；并通过GeneRunner软件预测开放阅读框及BLASTp程序进行蛋白质相似性搜索。
2结果与分析
2.1
总RNA的提取
提取的总RNA用紫外分光光度计进行检测，其浓度为0.8μg/μL，发现OD260/OD280和OD260/OD230的比值均>1.90，分别为1.92和1.94，表明蛋白和DNA的污染少，RNA质量较好。1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA显示出28.0S、18.0S和5.8S3条条带(图1-A)，且各条带特异性较好，条带间无拖带，说明RNA完整性较好，即提取的总RNA质量良好，符合建库要求。2.2双链cDNA的合成及短片段去除
经LD-PCR合成双链cDNA，取5.0μL双链cDNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，在0.4～3.0kb间呈弥散状条带，其中900bp处附近有高丰度的亮带(图1-B)，说明合成的双链cDNA符合建库要求。以凝胶回收方式去除短片段后，再进行琼脂糖凝胶电泳检测，发现各条带均在0.5kb以上，且多集中于1.0kb附近区域（图1-C）。
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图1凡纳滨对总RNA(A)、双链cDNA(B)和短段后的双链cDNA电泳图(C)
Fig.1ElectrophoretogramoftotalRNAextractedfrommuscles（A），doublechaincDNAsynthesisfrommRNA（B）andcDNAremoved
（C）short-fragment
M1:λ-EcoT14IMarker(TaKaRa);M2:pHYMarker(TaKaRa)
2.3
文库质量评价
初始文库库容约8.50×106CFU，重组率在95%左右。对16个单菌落进行PCR鉴定，发现插入片断大小
为0.5～4.0kb(图2)，多数在1.0kb以上，说明所插入的片段长度较好，文库质量良好。
图2阳性克隆PCR检测电泳图
Fig.2IdentificationofpositiveclonesinplasmidusingPCRM1:λ-EcoT14I;M2:pHY;2.4
文库中cDNA的序列分析结果
随机挑取72个阳性克隆进行两端测序，如未测通序列则重新设计引物，直至测通为止。除去低质量的序列和载体序列后，与克隆序列拼接后共获得66条高质量的cDNA全长序列，平均插入长度为1105bp。经BLAST检索GenBank，发现66条cDNA全长序列中有11条(16.67%)为重复序列，余下55条序列中有10条有功能注释，27条序列预测开放阅读框得到预测的蛋白质序列并搜索到有功能注释的基因，18条仅在EST数据库中搜索到同源序列，为编码未知蛋白的基因。有功能注释的37条cDNA通过GeneOntology功能分类可分为蛋白质合成(10条)、细胞骨架（5条）、细胞信号传导（5条）、代谢（5条）、转运（4条）、能量（2条）、转录（2条）、抗病及防御（1条）、生殖发育(1条)和未知功能基因（2条）等10类（图3）。其中，蛋白质合成类基因最多(27.03%)，与细胞骨架(13.51%)、细胞信号传导(13.51%)及代谢类基因(13.51%)共占67.56%。
cDNA约占基因组DNA的3%，均是性状表达的有用序列。因此，在基因工程研究中，真核细胞的cDNA
性状基因的一种首选方法。目前，构建cDNA文库的方法有经典cDNA文库、标准化cDNA文库、消减cDNA文库、染色体区域特异性cDNA文库、PCRcDNA文库、RACEcDNA文库、固相cDNA文库等（Figueiredoetal.，2007）。cDNA全长文库筛选是获取基因全长cDNA的基本方法之一，基因全长cDNA的获取是研究酶结构
3讨论
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与功能的关系、基因表达和调控、基因工程应用的重要前提。传统的cDNA合成方法通常是利用mRNA3'端的poly(A)尾巴，以Oligo（dT）为引物，通过AMV和M-MLV反转录酶反转录合成cDNA的第一链，但不能反转录出全长mRNA序列，尤其是在mRNA较长或者具有复杂二级结构的情况下，
会造成5'端缺失（OkayamaandBerg，1982）。SMART技术能够在少量总RNA(>50ng)的情况下，
利用反转录酶的SMART特性，在mRNA反转录结束时会自动在第一链cDNA末端添加3个C的特性，自动地将两端接头同时加在cDNA上，获得长链cDNA。避免mRNA纯化、cDNA第二链合成、甲基化和接头平端连接等繁琐操作，既简化建库程序，又减少RNA降解的机率，可有效地保证cDNA的完整性。
本研究中采用SMART技术构建凡纳滨对虾全长cDNA文库，经菌落PCR鉴定，插入片断大小为0.5～4.0kb，且多数在1.0kb以上，可满足全长基因筛选的要求。据报道，如要克隆到某低丰度mRNA的概率为99%时，文库的克隆数不应低于1.7×105个拷贝（金小宝等，2005）。本研究中初始文库库容约8.50×106CFU，重组率在95%左右，高于所需标准，说明该文库质量较高。通过随机测序获得55个非重复基因序列，对有功能注释的37个基因进行功能分类，发现蛋白质合成类基因最多，与细胞骨架、细胞信号传导及代谢类基因共占67.56%。说明与蛋白质合成、能量、细胞骨架、细胞信号传导相关的这些ESTs序列占凡纳滨对虾肌肉组织cDNA文库中的大部分，可能是由于本研究选用的样品是93日龄的凡纳滨对虾肌肉组织，此时的凡纳滨对虾正处于高速生长期，生长代谢极其旺盛，所以与能量、蛋白质合成、代谢等相关基因表达丰度较高。
目前，我国对虾分子生物学研究相对于养殖业还处于严重滞后状态，有关对虾生长发育分子机理也尚未清楚。肌肉的生长与生长性状直接相关，对肌肉中相关基因序列的获得及分析，将为筛选生长性状的主效基因、了解生长发育中的表达调控等奠定基础。
4结论
本研究利用SMART技术构建了凡纳滨对虾肌肉组织的全长cDNA文库，经EST测序分析表明，初始文库库容约8.50×106CFU，重组率在95%左右，插入片断大小为0.5～4.0kb，多数在1.0kb以上；随机测序72条cDNA，可获得有功能注释的37条全长cDNA和18条编码未知蛋白的基因序列；通过GeneOntology功能分类可将有功能注释的37个基因分为蛋白质合成、细胞骨架、细胞信号传导、代谢、转运、能量、转录、抗病及防御、生殖发育和未知功能基因等10类。可见，构建凡纳滨对虾肌肉组织的全长cDNA文库，可实现短期内
获得大量凡纳滨对虾肌肉组织的功能基因表达信息，为深入了解功能基因在凡纳滨对虾肌肉组织中的表达提供分子生物学依据。
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（责任编辑兰宗宝）