循环肿瘤细胞(CTC)的基础知识

循环肿瘤细胞（CTC ）的一些基础知识

摘要：通常把进入人体外周血的肿瘤细胞称为循环肿瘤细胞（circulating tumor cell）。随着人们对循环肿瘤细胞研究的深入，尤其是伴随现代检测技术的广泛应用，CTC 逐渐被人们所重视。循环肿瘤细胞的检测可有效地应用于体外早期诊断，化疗药物的快速评估，个体化治疗包括临川筛药、耐药性的检测，肿瘤复发的监测以及肿瘤新药物的开发等。检测CTC 有着良好的应用前景，随着这一研究领域的不断发展，必将产生新的诊疗手段，从而使肿瘤的治疗提高到一个崭新的阶段。

关键词：循环肿瘤细胞；CTC ；检测方法；临床意义

早在1896年，Ashworth 曾报道1例因癌症死亡的患者外周血中发现了类似肿瘤的细胞，并首次提出循环肿瘤细胞（circulating tumor cell, CTC）的概念[1]。随着人们对循环肿瘤细胞研究的深入，尤其是伴随现代检测技术的广泛应用，CTC 逐渐被人们所重视。

1、概 述

CTC 指自发或因诊疗操作进入外周血循环的肿瘤细胞。随着肿瘤细胞的不断增殖, 部分细胞可以通过分泌一种抑制黏附因子表达的物质, 增加其运动能力并使之与肿瘤母体脱离。这些脱落的肿瘤细胞再分泌一种蛋白溶解酶，以破坏周边宿主结缔组织并进入脉管系统。诊疗操作也可使肿瘤细胞扩散进入外周血循环。 2、检测方法

2.1 免疫细胞化学（immunocytochemistry, ICC）

这一检测方法基于抗原抗体结合反应的原理，利用单克隆抗体（McAb ）与特异的肿瘤标记物结合，并通过酶与底物反应显色来判断肿瘤细胞的存在。检测的肿瘤标志物主要分三类：①上皮细胞角蛋白（CK ），如CK19；②上皮细胞膜特异性抗原，如黏蛋白类，包括EMA 、HMFG 、HEA125等；③肿瘤相关糖蛋白（TAG ），如TAG12。1980年，Sloane 等首次采用ICC 的方法检测乳腺癌患者骨髓中的肿瘤细胞。该方法可以进行形态学分析，但是检测的细胞量少，敏感性只有10－4～10－5（即在1万~10万个单核细胞中发现一个肿瘤细胞），而且许多分化差的肿瘤不能表达目标抗原，而非上皮细胞中细胞角蛋白和上皮细胞抗原亦可能阳性, 故特异性不高。Braun 等[2]认为由于CTC 不表达白细胞共同抗原CD45，采用CD45－/CK＋双标技术可以提高ICC 检测的特异性。

2.2 多聚酶链反应（polymerase chain reaction，PCR ）

该方法的原理是特异性扩增出肿瘤细胞中因癌基因、抑癌基因突变或染色体重排而产生的DNA 异常。这类基因的改变应满足以下条件：①该基因的突变在待检肿瘤中发生率较高，至少应达50％左右；②基因内发生碱基突变的部位应相对集中，如果过分分散，目前临床应用有困难。这一方法检测肿瘤细胞的敏感性约1×10－6左右，比Southern 印迹杂交法约提高10 000倍。应用PCR 技术检测CTC 受到缺乏肿瘤特异性和高表达标记的限制，该方法敏感度高，易出现假阳性，同时由于癌细胞的异质性亦可出现假阴性。目前多应用突变等位基因扩增（mutant allelie specific amplification, MASA）的PCR 技术，检测大肠癌和胰腺癌患者外周血中具有K-ras 癌基因突变的肿瘤细胞。

2.3 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR ）

这种方法在PCR 的基础上扩增由肿瘤特异性mRNA 序列逆转录的DNA 片断。RNA 检测的特异性靶mRNA 有：①某些基因改变后RNA 水平的异常，如点突变（p53、ras ）、缺失（BRCA1、BRCA2）、异构（CD44）、扩增（erb- B2、EGFR ）；②组织特异性标志mRNA, 如mucin 、cytokeratin 、ER 、maspin ；③肿瘤特异性标志mRNA ，如CEA 、β-HCG 等。1991年Smith 等[3]首先将RT-PCR 应用于外周血黑色素瘤细胞的检测。此后，这一技术已分别在多种恶性实体瘤中得以应用，如对消化系统肿瘤作CEAmRNA 检测，对乳腺癌作MAMmRNA 检测，对肝癌作AFPmRNA 检测，对前列腺癌作PSAmRNA 检测等。RT-PCR 方法具有高度的敏感性和特异性，其敏感性可达10－6~10－7，特异性在于其扩增模板为mRNA ：RNA 在细胞外环境中极不稳定，一旦检测到特异性mRNA 的表达就意味着有肿瘤细胞的存在；mRNA 的表达不受相应编码蛋白表达高低的影响；引物的设计可以跨越两个不同的外显子，避免了整个基因组的扩增，有利于消除假阳性结果。由于RNA 易被RNA 酶降解，同时该方法具有PCR 技术的局限性，仍可出现假阳性和假阴性结果。为提高RT-PCR 的特异性和敏感性，新的方法不断产生，在RT-PCR 的基础上又增加了定量逆转录多聚酶链反应（QPCR ）, 荧光定量逆转录多聚酶链反应（FQ-PCR ）等。

2.4 流式细胞术（flow cytometry, FCM）

该技术是以流式细胞仪为工具对悬液中的细胞进行测量分析，具有快速、准确的优点，其筛选细胞的速度为103~104个细胞/s。应用FCM 从血液中检测上皮性肿瘤细胞其价值很大程度上依赖于可分析的细胞数量[4]。尽管FCM 不能提供有关细胞形态方面的信息，但是, 其在鉴定、计数肿瘤细胞方面比RT-PCR 更可靠。Irene 等研究证明FCM 可作为一种检测CTC 数量的有力工具。现有的FCM 需取大约50ml 外周血方可检测肿瘤细胞负荷，若检测前进行特异性富集肿瘤细胞，将在很大程度上提高检测的敏感性。

2.5 其 它

目前，CTC 检测方法较多，但检出率仍有限，一些明确存在转移灶的患者CTC 阳性率可能很低。导致这一情况的原因可能是不了解肿瘤细胞释放的规律（CTC 的释放可能是间歇性的），且循环中的肿瘤细胞常常成群，单点时间的检测可产生一定的偏倚，而实际表达可能更高。连续多次取样或加大样本量可能会提高检出率。再者，检测方法本身也都存在一定的局限性，可能出现假阳性与假阴性。在设立对照，均衡、优化实验条件的同时，可选用免疫磁性分离技术即磁性激活的细胞筛选（magnetic activated cell separation，MACS ）富集肿瘤细胞、激光扫描细胞计数器等来提高检测的敏感性和特异性。Vona 等[5]。根据上皮肿瘤细胞的大小建立了一种简便、经济的分离计数CTC 的方法，即利用上皮肿瘤细胞比外周血细胞大的特点，通过过滤使之得到分离、富集。该方法敏感度高，1ml 血中有1个肿瘤细胞也可检出，适用于多种类型的肿瘤。已有研究表明，在肝癌患者外周血肿瘤细胞的收集方面，该方法的敏感性比RT-PCR 方法更高，若与其它方法联合应用可显著提高检测效率和准确性。

3、 临床意义

3.1 体检（体外早期诊断）：对于肿瘤的常规检测手段来讲，例如影像学。肿瘤在小于一公分的情况下，医生也不认为它是异常。通过国外发表的文章可以看到，不要说是一公分，很多肿瘤在一个毫米的情况下已经在血液里查到循环肿瘤细胞，从这个角度讲，它对于早期诊断来讲有不可低估的意义。

3.2 辅助诊断手段：从临床来讲，要确定一个病人是不是得了肿瘤，一直是一个很难明确回答的问题，这就会对很多病人造成误诊。比如说胰腺癌往往发现确诊以后都是晚期的，为什么会这样？就是因为在早期的时候，胰腺癌的确诊非常困难。现在发现，在很多难以确诊的病人的血液中，如果说能够检查到循环肿瘤细胞，那对于配合医生下肿瘤诊断的结论是具有积极意义的。

3.3 根据循环肿瘤细胞的个数判断愈后及存活时间：经美国FDA 认证的易莫尼康

（Immunicon ）公司通过多年的科研，在几百个病人身上做了大量的科学研究，最终得出结论，在治疗以后通过计算循环肿瘤细胞的个数，可以明确的告诉病人到底能存活半年还是一年或更长时间。也就是说循环肿瘤细胞的应用使人们第一次可以以一个量化的指标告诉医生和病人他的存活时间。

3.4 个体化治疗：个体化治疗指的是针对每一个不同的肿瘤病人，医生开出不同的治疗方案。目前在医院，比如说协和医院，很少做很严格的个体化治疗方案，一般都是医生根据经验来决定给病人用何种化疗药物，但有没有效并不知道。现在国外已经开始用一种新的方法，即把病人体内的肿瘤细胞拿出来培养，培养好以后在体外做药理实验。因为化疗药物有多种，究竟哪种最好最有效不应该由经验来回答，而是应该由事实来说话。把肿瘤细胞培养好以后，用不同的药物来处理肿瘤细胞，看哪种化疗药物对肿瘤细胞杀伤作用最大，然后把杀伤作用最大的药物用在病人身上，这样就增加了治疗的目的性。随着CTC 捕获技术的成熟，人们开始考虑是否可以把CTC 作为个体化治疗的基础，从目前来看这是可行的。即先将CTC 捕获出来进行培养，培养好了以后进行药理实验，在此基础上还可以做化疗药效的快速评估。

3.5 快速判断化疗效果：目前不管是国内还是国外，给病人上化疗药物以后，一般都要等三个月才可以去评估病人的治疗效果。因为只有经过三个月后，肿瘤的大小才能有比较明显的变化。通过我们的实验以及国外发表的文章可以看出，凭经验给病人上的化疗药物在很多情况下是无效的。很多情况下，经过三个月以后，肿瘤细胞非但没有减小反而继续长大。这对病人来讲就白白耽误了三个月的时间。三个月对于肿瘤病人来讲就意味着有可能最终死亡。随着CTC 技术的成熟，病人不用再等三个月，只需等三周，通过测定CTC 数目的变化，如果CTC 数目是显著下降的，说明化疗药物是有效的，如果CTC 数目还在增加说明药物是无效的，这时医生就应该采取新的治疗方案。

3.6 体内耐药性检测：很多情况下给病人用化疗药物一开始是有效的，但是过一段时间后肿瘤病人的发病并没有得到控制，这有可能是病人对药物产生了耐药性，这一点大家都可以理解，抗体多了容易产生耐药。目前来讲，对于肿瘤治疗病人会不会产生耐药以及什么时候产生耐药是未知的。往往是发现病人产生耐药时，病情已得不到控制。随着CTC 技术的成熟，我们可以做动态的观察，也就是对病人做持续跟踪观察，在动态的观察过程中一旦发现CTC 数目显著增加，医生就应该及时的更换新的治疗方案。

3.7 最后就是检测肿瘤复发：这是北京莱尔生物科技有限公司在协和医院及其他医院做临床实验以后病人反响最大的地方。目前就全世界来说，肿瘤病人经过治疗以后，在恢复的过程中会不会肿瘤复发？以及什么时候复发？没有医生也没有方法可以做出解释。随着CTC 技术的成熟，我们已经知道肿瘤的复发实际上就是肿瘤转移的过程。很多乳腺癌的病人复发后会转移到脑部，还有很多结直肠癌的病人复发后往往转移到肝脏。这说明即使原发部位已经切除，肿瘤还会转移到其他部位，这实际上就是一个慢性的肿瘤转移过程。既然人们已经认识到肿瘤复发和肿瘤转移过程是直接相关的，医生就可以通过监测CTC 直接监测病人是否肿瘤复发。也就是说肿瘤的复发不是一夜形成的，它是一个持续的肿瘤不断释放入血向远端转移的缓慢的过程。对于治疗过的病人，他体内的循环肿瘤细胞应该是没有或者只有极少的数目，如果在他今后的生活过程中检测到循环肿瘤细胞持续增多，这就给病人和医生都敲响了警钟，这时对病人一定要采取适当的治疗，控制住CTC 的增多，因为CTC 的增多很有可能是肿瘤复发的前兆或复发的过程。

3.8 另外人们已经认识到CTC 可以作为药物靶向治疗的一个新的靶向。目前国外很多大的药厂都投入巨资开发肿瘤新药，在开发的过程中不仅把实体肿瘤作为靶向治疗的一个靶标，同时也认识到可以把CTC 作为药物治疗的对象。

4 结语

随着现代分子生物学技术的发展，CTC 检测方法的敏感性和特异性将不断提高，特别是与细胞富集技术的结合更有助于早期CTC 的发现。目前在单个CTC 水平进行基因组及mRNA 表达谱的分析，将有助于提高人们对CTC 本质的认识。总之，检测CTC 有着良好的应用前景，随着这一研究领域的不断发展，必将产生新的诊疗手段，特别是使肿瘤的治疗提高到一个崭新的阶段。

［１］ Ghossein RA, Carusone L, Bhattacharya S. Review:polymerase chain reaction

detection of micrometastase and circulating tumor cells: application to melanoma, prostate, and thyroid carcinomas[J]. Diagn Mol Pathol,1999,8:165-175.

［２］ Braun S, Pantel K. Prognoistic significance of micromet

astatic bone marrow involvement[J]. Breast Cancer Res Trea,1998,52:201-216. ［３］ Smith B, Selby P, Southgate J, et al. Detection of melanoma cells in peripheral

blood by means of reverse transcriptase and polymerase chain reaction [J].

Lancet, 1991, 338:1227-1229.

［４］ Terstappen LW, Rao C,Gross S, et al. Flow cytometry priciples and feasibility in

transfusion medicine.Enumeration of epithelial derived tumor cells in peripheral blood[J]. Vox Sang,1998,74（Suppl 2）:269.

［５］ Vona G, Sabile A,Louha M, et al. Isolation by size of epithelial tumor cells: a new

method for the immunomorphological and molecular characterization of circulating tumor cells[J].Ann J Pathol,2000,156:57.