亲水作用色谱及其在碱性药物分析中的应用_李瑞萍
第18卷第11期2006年11月
化 学 进 展
PROGRESSINCHEMISTRY
Vol.18No.11 Nov.,2006
亲水作用色谱及其在碱性药物分析中的应用
李瑞萍
1*
黄骏雄
2
(1.三峡大学AlanG.MacDiarmid再生能源研究所 宜昌443002;
2.中国科学院生态环境研究中心环境化学与生态毒理学重点实验室 北京100085)
摘 要 亲水作用色谱是采用极性固定相、高含量极性有机溶剂-水相缓冲液为流动相的一种分离技术,它能有效地保留反相色谱中保留弱或不保留的强极性碱性药物。本文综述了以未键合硅胶为固定相的亲水作用色谱分离碱性药物的机理、特点及其应用的最新进展。关键词 亲水作用色谱 碱性药物 分离
中图分类号:O657.7;O657.63 文献标识码:A 文章编号:1005-281X(2006)11-1508-06
HydrophilicInteractionChromatographyandItsApplications
intheSeparationofBasicDrugs
LiRuiping HuangJunxiong
(1.AlanG.MacDiarmidResearchInstituteofRenewableEnergy,ChineseThreeGorgesUniversity,Yichang443002,China;2.StateKeyLaboratoryofEnvironmentalChemistryandEcotoxicology,ResearchCenterforEco-EnvironmentalSciences,ChineseAcademyofSciences,Beijing100085,China)Abstract Hydrophilicinteractionchromatography(HILIC)isaconvenientmethodforseparatingbasicdrugsandtheirmetaboliteswhichhavepoorretentiononreversed-phasecolumnbypassinghighlypolarorganic-aqueousbuffermobilephaseacrossapolarstationaryphase.ThemechanismandcharacterizationofHILICusingsilicacolumnPreversed-phaseelutionsystemaredescribed.Inaddition,therecentprogressofitsapplicationsintheseparationofbasicpharmaceuticalsisreviewed.
Keywords hydrophilicinteractionchromatography;basicdrugs;separation
使这些化合物用反相色谱很难保留和分离。因此必须采用二次化学平衡的原理,利用离子对色谱、离子抑制或硅羟基掩蔽剂等,以保证良好的分离效果。但这些洗脱条件降低质谱检测灵敏度,不能与质谱
[3,4]
兼容。以非极性或低极性有机溶剂为流动相、硅胶为固定相的传统正相色谱已广泛用于分离多种中性化合物,尤其适用于分离异构体。然而由于极性大的碱性化合物与固定相作用强,需要高极性流动相才能将其从硅胶柱上洗脱。1975年Jane首次采用高浓度、高极性有机溶剂-水相缓冲液成功地分离了碱性药物。此后这种采用正相硅胶色谱柱/反相洗脱液的色谱系统引起了人们的广泛注意,
[6]
[7]
[5]
1*
2
1 引言
碱性药物的分离一直是色谱界研究的热点。其原因之一是在日益发展的制药业中,很多新开发的药物为强碱性化合物,其药效和纯度的评价需用色谱法。为得到碱性药物理想的色谱行为,人们不断开发新的色谱填料及分离模式以满足其需求。目前,以硅胶为基质的各种化学键合填料为固定相的反相色谱仍占碱性药物分离的主导地位。但由于键合不完全,碱性化合物常与残留的硅羟基发生作用,致使峰形严重拖尾。而且强极性碱性化合物的亲水性很强,在酸性pH条件下它们带的净电荷
收稿:2006年1月,收修改稿:2006年5月 * 163.[1,2]
第11期李瑞萍等 亲水作用色谱及其在碱性药物分析中的应用
[8]
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1990年Alpert色谱。
将这种色谱模式命名为亲水作用
亲水作用色谱(hydrophilicinteractionchromatography,HILIC)是一种以极性固定相(如硅胶或衍生硅胶)及含高浓度极性有机溶剂和低浓度水溶液为流动相的色谱模式。它与传统正相色谱相似,流动相的有机部分是弱溶剂,水溶液是强溶剂。化合物是按亲水性增加的次序流出,但所用的溶剂又与反相色谱相似,采用与水互溶的极性有机溶剂如乙腈或甲醇;而不用传统正相色谱中所用溶剂如正己烷及氯仿,且水的含量较大,通常为5%或更高。与反相色谱分离碱性药物相比,该分离模式具有峰形对称、保留时间短、重现性好及柱寿命长等优点
[4,9]
[8]
图1 硅胶结构中硅羟基的存在形式
Fig.1 Thesilanolspeciespresentinthesilicastructure
尽管碱性化合物在硅胶表面的保留机理复杂,
影响因素较多,但普遍认为存在离子交换机理,即在硅胶固定相上,极性的碱性化合物与带负电荷的硅羟基进行弱的阳离子交换。Bidlingmeyer等
[12]
。最近几年该技术又与质谱联用,应用于
生物样品中碱性化合物及其代谢产物的分离与鉴定。该分离技术的优点之一就是保留一些用反相色谱无法简单保留的碱性化合物
[4,10]
在普
。随着人们对
HILIC的深入了解,它在碱性药物分离中的应用越来越受到研究药物代谢、药物开发和组合化学的科学家们重视,近几年的研究报道也逐渐增多。本文介绍了以硅胶为固定相的亲水作用色谱分离碱性药物的分离机理、特点及在碱性药物分析和药代产物研究中的应用。
通硅胶色谱柱上,系统地研究了离子强度、pH值、离
子交换容量及溶剂强度对溶质保留的影响,证实了碱性化合物在反相洗脱条件下以多种机理在硅胶柱上保留。在一定pH条件下,溶质的保留值随流动相中无机盐浓度的增大而减小,说明存在离子交换机理。当离子强度一定时,随着pH的增加,所有离子型有机胺类药物的保留逐渐增大,当pH接近有机碱pKa值时保留达到最大,随后又降低。他们还观察到,当保持pH值和离子强度恒定时,溶剂组成与容量因子kc之间成线性关系,与典型的反相系统类似。硅胶极性弱于反相洗脱剂,硅氧烷是疏水的,因此在高pH值的亲水作用色谱系统中,碱性药物的解离部分和未解离部分分别与硅胶表面亲水性的SiO和疏水性的硅氧烷作用。最近作者
[15,16]
-[14]
[2]
2 HILIC分离机理
硅胶表面含有硅羟基和硅氧烷两种基团,以及极少量的金属杂质。由于硅氧烷的存在,硅胶具有弱的反相特性。硅羟基以孤单的(single)、成双的(germinal)或相邻的(vicinal)结合形式存在(图1),不同的硅羟基具有不同的反应活性和吸附活性。大部分硅羟基为弱酸性,极小部分为强酸性,文献报道硅胶的pKa值在115)10的范围内。硅胶的pKa值一般是指其表面所有硅羟基pKa的平均值,它并不一定能反映硅胶表面强酸性点的存在,尽管这些表面浓度极低的强酸性点在色谱过程中非常活泼。硅胶表面的复杂性使得碱性化合物在HILIC模式下的保留机理非常复杂,通常为混合保留机[2,4,12)14]理,存在的机理有:亲水作用、离子交换及反相保留。这种多形式的保留对调节溶质的分离选择性非常有用。但由于各种吸附力强弱的不同,产生不正常的峰形,特别是不只一种机理控制溶质的保留时更是如此。因此在分析碱性化合物时控制所有的保留机理非常重要,以使溶质主要以一种机理与
[2]
[2]
[2,6,11]
及
其他一些学者也证实了HILIC模式下碱性化合物在硅胶柱上类似的复杂保留机理。
根据离子交换理论,保留值kc是溶质pKa值的函数,则保留受溶质pKa值的影响。Law
[17]
采用pH
=912的甲醇-乙酸铵缓冲液(9B1)为流动相,研究了69种有机胺类药物的pKa值与保留之间的关系,证实logkc与pKa值之间具有良好的线性相关性,使离子交换理论得到了很好验证,同时还发现logkc与pKa值之间的相关性受碱性中心或其附近取代基的影响。Cox等
[13]
通过研究认为碱性化合物在硅胶柱
上的保留机理与其在色谱条件下所呈的状态有关,呈离子型的有机胺类药物主要以阳离子交换作用保留,而非离子的则主要以疏水作用保留。
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化 学 进 展
是弱溶剂,能直接进样到硅胶色谱柱中
第18卷
[22)24]
3 HILIC特点
3.1 色谱柱效高,峰形对称,保留时间短
早在HILIC命名前,以硅胶为色谱柱的HILIC色谱模式就已成功用于碱性药物及其代谢物的分离
[2,4,9]
。因此
HILIC不仅适合高通量快速分析应用,而且可提高分析物回收率,使样品的检出限更低。3.4 提高电喷雾质谱(ESI-MS)的灵敏度,有利于药物代谢研究
为提高反相色谱中强极性化合物的保留,必须要用弱的流动相。这种水含量高的流动相使分析物和固定相间的疏水作用达到最大,但这些不挥发的流动相用ESI-MS电离化合物并不理想,结果使灵敏度下降。
在HILIC中,硅胶柱用挥发的流动相就能保留强极性的碱性分析物,对ESI-MS电离化合物十分理想,因而产生了更高的灵敏度和更低的检出限。这对药物代谢的研究十分重要,因为代谢物的极性通常比其母体化合物更强而且存在的浓度极低。
[15,22,23,29]
[4]
[4,25)29]
。研究发现,碱性药物在这种正相硅胶/反相
洗脱系统中分离柱效高,大多数碱性药物色谱峰形
[4,9,14,18,19]
对称性好,不对称因子小于1.2。碱性药物在该模式下保留的另一特点是溶质的保留与其亲脂性无关,保留因子范围窄,药物的保留时间短。另外,由于流动相中含高浓度有机溶剂/低水含量,色谱柱压降低,因此可在高流速下以低反压进行分离,减少了分析时间。
3.2 流动相组成简单,固定相稳定
由于HILIC利用被测组分与硅羟基的相互作用,因此不需要加离子对试剂(如烷基磺酸盐)的洗脱液就能对大范围内的碱性药物进行分离,流动相组成简单,一般为甲醇-水相缓冲液或乙腈-水相缓冲液,常用的缓冲液有硝酸铵-氨水、乙酸铵-乙酸P甲酸P三氟乙酸及磷酸盐-磷酸等
[20]
[4,9]
[4]
[2,9,18]
4 HILIC在碱性药物分析中的应用
HILIC的主要应用领域就是碱性药物及其代谢物的分析。在早期的研究中,大多采用高pH值缓冲液,主要用于分析血浆样品中的碱性药物及其代
谢物,碱性药物的极性范围较大。由于HILIC色谱条件与质谱兼容,近年来HILIC的一个重要应用领域就是与质谱/质谱联用,多采用酸性流动相,不仅用于分析体液及组织中的碱性药物及其代谢物,也有用于植物样品中该类研究的报道。4.1 碱性药物的系统分离
在反相色谱中,保留取决于溶质的亲脂性,而在HILIC系统中,碱性药物的保留与其亲脂性无关,所以能同时分析极性范围大的一类药物,且分析效果好、时间短。Law
[18]
。
Law等研究发现,在高pH值(pH=912)的水-高浓度有机溶剂混合液中,固定相稳定,可使用数月不影响柱效。McKeown等
[16]
也证实在pH为718的
流动相中,6种碱性混合物进样636次后色谱柱稳定,未发现柱损伤。这主要是因为在高含量有机溶
剂的流动相中硅胶溶解很慢,在色谱分离过程中可以接受。
通常人们认为硅胶柱用于分析生物样品时不稳定,极性的内源性杂质会在柱上强烈保留,最后导致柱损坏。这对于使用非极性流动相的经典正相色谱来说是正确的,但是研究发现HILIC中使用的极性流动相能将极性的内源性化合物洗掉,因此不会累
[4]
积在色谱柱上,因而色谱柱稳定。3.3 有利于样品制备
样品制备如固相萃取(SPE)、蛋白沉淀(PP)或液-液萃取(LLE)中,其最后一步常含强有机溶剂(如乙腈、异丙醇等)。这些溶剂太强,无法直接注入反相色谱柱,它们必需蒸干再溶于与反相条件相适的弱溶剂中。这一费力又费时的步骤可占到样品处理所需全部时间的50%,消除该步骤可极大地提高样品通量
[21]
给出了一个具有代表性的例子,
他采用该系统分离了8种B-受体阻滞剂,其中普萘洛尔的极性最小,阿替洛尔的极性最大,两者的保留因子分别为0184和1128。而在反相色谱中,分析时间要长一倍,两者的保留因子相差大,分别为1912和0105。同时,Law还分离了结构、化学特性和药理作用完全不同的14种有机胺类药物,包括局部麻醉药、抗疟药、血管扩张药、生物碱、利尿药、抗组织胺药和季铵碱杀菌药,色谱峰形对称,并达到基线分离,显示了HILIC在同时分离多种药物方面具有高分辨率。该特点对于药代研究非常有用,因为药代研究中,溶质的极性相差很大,用HILIC可实现从非极性的母体药物到高极性代谢产物的同时分离,并。此外,若分析物不稳定且/或经不起蒸
发及再溶,则在固相萃取、蛋白沉淀或液-液萃取的最后一步后直接进样就能得到更低的检出限和更高,
第11期李瑞萍等 亲水作用色谱及其在碱性药物分析中的应用#1511#
4.2 生物样品中碱性药物及其代谢物的分析
目前,高效液相色谱技术已经成为药物临床前期代谢产物研究的一种重要工具,尤其是当今世界新药的发展日新月异,新药毒理的研究或杂质和降解产物的确证必须尽可能快地反馈给医药化学家。HILIC模式在初期用于体内药物分析时,多采用紫外(UV)检测,但药代动力学、生化分析及临床分析样品基质复杂,浓度低,造成HILIC-UV方法不适应
实际要求。由于HILIC与质谱兼容,色谱条件利于样品制备,减轻样品前处理的压力,随着质谱技术的发展,HILIC结合串联质谱(HILIC-MSPMS)不仅实现
了高灵敏度的快速分析,而且可进行多种药物同时监测,已成为一种简便、快捷的碱性药物及其代谢物的测定方法,并显示出较强的耐用性及稳定性。表1给出了一些应用实例。
表1 生物样品中碱性药物及其代谢物HILIC-MSPMS分析应用实例
Table1 HILIC-MS-MSanalysisofbasicdrugsandtheirmetabolitesinbiologicalsamples
compoundcetirizine
samplehumanplasma
extraction
automatedsolidphase
extractionPPwithACNPPwithacetonitrile
stationaryphaseBetasilsilicacolumn(50@3,5Lm)Inersilsilica,5Lm,50mm@3mmSpher-i5silica,5Lm,[email protected],5Lm,50mm@3mmInertsilsilica,5Lm,50mm@3mmBetasilsilica,5Lm,50mm@3mmBetasilsilica,5Lm,50mm@3mmBetasilsilica,5Lm,50mm@3mmBetasilsilica,5Lm,50mm@3mmBetasilsilica,5Lm,50mm@3mmBetasilsilica,5Lm,50mm@3mmBetasilsilica,5Lm,50mm@3mm
Inertsilsilica,5Lm,50mm@3mmBetasilsilica,5Lm,50mm@3mmBetasilsilica,5Lm,50mm@3mmBetasilsilica,5Lm,50mm@3mmBetasilsilica,5Lm,50mm@3mmBetasilsilica,5Lm,50mm@3mm
mobilephasePflowrate
acetonitrile-water-aceticacid-trifluroaceticacid(93B7B1B0.025,vPvPvPv),0.5mlPminACNP0.05%TFA(95B5vPv)),0.5mlPminACNP10mmolPLammoniumformate(80B20,pH=3vPv),0.7mlPminACNPH2OPTFA(94B6B0.05vPv),0.5mlPminACNPH2OPTFA(90B10B0.05vPv),0.5mlPminACNPH2OPTFA(90B10B0.1vPv),0.5mlPminACNPH2OPTFA(91B9B0.01vPv),0.5mlPminACNPH2OPTFA(92.5B7.5B0.05vPv),0.5mlPmin
ACNPH2OPTFA(92B8B0.01vPv),0.7mlPmin
ACNPH2OPTFA(94B6B0.05vPv),0.5mlPmin
ACNPH2OPTFA(94B6B0.05vPv),0.4mlPminACNPH2OPTFA(95B5B0.05vPv),0.5mlPminACNPH2OPTFA(95B5B0.05vPv),0.5mlPminACNPH2OPTFA(95B5B0.05vPv),0.5mlPminACNPH2OPTFA(95B5B0.05vPv),0.5mlPmin
ACNPH2OPTFA(95B5B0.05vPv),0.7mlPmin
ACNPwaterPformicacid(72.5B27.5B1vPv),0.5mlPminACNPwaterPformicacid(95B5B1vPv),0.6mlPmin
[***********]41ref.34
levovirinacyclovir
ratandmonkeyplasmaratplasma,amniotic
fluid,placentaltissue,andfetaltissuehumanplasmahumanplasmahumanplasma
4330
fluoxetineandnorfluoxetinenicotineandcotinineloratadineanddescarboethoxy-loratadine
LLE(MTBE)LLEwithethyletherLLEwithhexane96-wellC18SPE
39314524
morphine,morphine-3-humanplasmaglucuronideandmorphine-6-glucuronidefentanylhydrocodoneandhydromorphoneparoxetinesildenafiland
desmethylsildenafilalbuterolribavirinribavirinfluconazole
humanplasmahumanplasmahumanplasmahumanplasmahumanserumratandmonkeyplasmahumanplasma
plasma
and
96-wellcertifiedSPE(mixed-mode)96-wellcertifiedSPE(mixed-mode)LLE(MTBE)
96-wellcertifiedSPE(mixed-mode)certifiedSPE(mixed-mode)PPwithACN96-wellPPwithACN96-wellLLEwithmethy-ltetrabutylether(MTBE)
LLEwithethyletherPhexane96-wellSPEand
Oasis
HLB
29
humanplasma
midazolam,1-OHmidazolamand4-OHmidazolam
monkeyplasma
omeprazole,metoprololhumanplasmaandfexofenadinepseudoephedrine
humanplasmahumanurine
96-wellC18SPE
#1512#续表
compoundomeprazole,5-OHomeprazole
samplehumanplasma
extraction
化 学 进 展
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stationaryphaseBetasilsilicacolumn([email protected],5Lm)
Hypersilsilica,5Lm,[email protected],5Lm,[email protected],5Lm,50mm@2mmBetasilsilica,5Lm,50mm@3mmInertsilsilica,5Lm,50mm@3mmHypersilsilicacolumnAtlantisHILICsilica,5Lm,50mm@3mmsolventmisersilica,5Lm,[email protected]
mobilephasePflowrate
acetonitrile,waterandformicacid(from95B5B0.1to73.5B26.5B0.1in2min),1.5mlPminACNPwater(8B2vPv),containing0.1%TFAand4mmolPLammoniumacetate,0.8mlPminACNPwater(9B1,vPv),containing0.06%TFA,1mlPminACNPwaterPformicacid(80B20B1vPv),0.2mlPminACNPwaterPformicacid(80B20B1vPv),0.7mlPminACNPwaterPformicacid(90B10B1vPv),1mlPminACNPwaterPHAcPTFA(85P15P0.5P0.04)acetonitrile-ammoniumformate(190mmolPL,pH=3.0)(94B6,vPv)gradientelutionBACNPwaterPethanolP1molPLammoniumacetatePaceticacid(800B127B68B3B2to500B500B85B27B18vPv),0.4mlPminmethanolPACNPwaterPformicacid(59.8B5.2B34.65B0.35vPv),0.23mlPmin
ref.21
LLEwithethylacetate
ethambutol
ethionamide
hydromorphoneclonidine
humanserum,
bronchoalveolarlavagefluid,alveolarcellshumanplasma,
bronchoalveolarlavagefluid,alveolarcellshumanplasmahumanserum
PPwithACN37
PPwithACN38
LLE(MTBE)LLEwithethyletherC18SPE
423627
morphine,morphine-3-humanplasmaglucuronideandmorphine-6-glucuronideatenolollevosulpiride
humanplasmahumanplasma
PP
LLEwithethyletherLLEwithchloroform
334435
cholineanditsmetabolitesmouseliver,ratliver,
ratbrain,cookedchicken,cookedbeef,rawcarrot,rawcabbageheroin,miceserum6-monoacetylmorphine,morphine,morphine-3-glucuronide,morphine-6-glucuronide,codeine
amikacin,gentamicin,humanserumkanamycin,neomycin,paromomycin,tobramycin
SPE
Supelcosilsilica,5Lm,[email protected]
40
automatedsolidphaseextraction(SPE)ZIC-HILICcolumn,[email protected]
solventA:(5B95B0.2,vPvPv)aswellasB(95B5B0.2,vPvPv)isamixtureofacetonitrile,2mmolPLammoniumacetateandformicacid.Thegradientofmobilephaseis:0min100%B,1.6)7.0min10%B,and7.5)10.8min100%solventB.Theflowrateis0.6mlPmingradientelution:ACNPPH2OPformicacid0)0.25min:from90B10B1to65B35B1(vPv),0.25)0.9min:from65B35B1to50B50B1(vPv),0.4mlPmingradientelution:ACNPwaterPformicacid(90B10B1to50B50B1vPv),0.5mlPmin
32
nicotinicacid
metabolites
and
itshuman
urine
plasmaand96-wellOasisMCX
Hypersilsilica,5Lm,
47
ritonavirandnaltrexonehumanplasmaLLE(MTBE)
Betasilsilica,5Lm,50mm@3mm
22
5 展望
综上所述,亲水作用色谱具有许多其他色谱方法不可比拟的优势,正受到人们的关注,并在碱性药物分离及药物代谢研究等方面已经获得了一定的发展。它能有效地保留反相色谱中保留弱或不保留的强极性碱性药物,其色谱条件不仅与样品前处理技术如蛋白沉淀、液-液萃取及固相萃取中所用溶剂兼容,节约了大量样品前处理时间,而且与质谱兼容,
适用于进行高通量药物发现及其新药毒理和药代动力学等研究。但该色谱模式仍存在一些不足,如其
应用范围还不够广泛,还不能作为标准方法为人们所接受。商品硅胶柱种类较多,性能差异较大,结果的可靠性及重现性还有待于进一步提高。
在我国,有关亲水作用色谱在碱性药物分离方面的研究较少,但该系统在分离一些碱性药物方面显示了较大的优越性,较反相色谱简单、高效、经济适用,可很好地补充反相色谱的不足,是一种值得推
第11期李瑞萍等 亲水作用色谱及其在碱性药物分析中的应用
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广的分离技术。
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