酵母扩大培养过程关键控制点

酵母扩大培养过程关键控制点

金星集团信阳啤酒有限公司 黄华龙 465100

啤酒工厂从单细胞分离得到一个酵母细胞，经过鉴定确认、生产试验，得到优良菌株，然后经过若干次扩大培养，最后制备成107～108个细胞/ml后供发酵用，酵母扩大培养关键在于：第一，选择优良的单一细胞出芽菌株；第二，在整个扩大培养中保证酵母菌种的强壮、无污染。近代由于发酵规模越来越大，对接种酵母要求越来越严。各工厂扩大培养方式和顺序大致相同，而扩陪的结果得到种酵母的纯度、强壮情况、污染情况却差异很大，其原因在于是否有一个科学、无菌的扩培技术管理。

一、 出芽菌株的选择

作为扩大培养的出芽菌株，，无论是实验室保藏菌株还是生产现场（主酵或酵母泥）分离得到的菌株。一般均需进行单细胞分离，并通过一系列生理特性和生产性能测定，包括酿酒口味鉴评后，确认是工厂生产需要的优良纯种后才允许投入生产扩大培养。此单细胞分离和菌株鉴定，需要在有丰富微生物理论和实践经验的技术人员指导下进行。

二、 扩陪过程的无菌操作

扩大培养应严格建立在纯种的基础上，扩大培养过程的无菌技术 是扩陪成败的关键。它包括：培养器皿、设备的无菌，移种操作的无菌，培养过程中通风调节温度的无菌。在汉生罐以后从麦汁进罐至移种结束，必须保证汉生罐处于正压状态，这是杜绝吸入有菌空气的先

决条件。

三、 优良的培养基

麦汁是啤酒厂最方便的酵母培养基，但绝对不是“凡可以用来酿 造啤酒的麦汁均是优良的培养基”。许多工厂，常常从大生产麦汁中分割作为任何一级扩陪培养基，由于麦汁组成太差，会造成扩大培养失败。无论是哪级扩陪，培养基均需要有特殊要求的麦芽汁。

实验室（从试管至大锥形瓶）培养用麦汁，一般应有实验室自己制备，可按以下方式制备成10°P 全麦芽麦汁用于试管活化及菌种保藏。

1. 麦汁制备:

1) 称取优级麦芽约200g ，除去铁屑、石粒等坚硬杂质，采用EBC 粉碎。

2) 调EBC 粉碎机的磨间距，使细粉颗粒直径为0.2㎜。

3) 料水比例：1：3～3.5

4) 称取细粉适量（准确至0.1g ），于已知重量的糖化杯（500～600ml 专用金属杯中），加入46℃水200ml, 在不断搅拌下于45℃水浴中保温30min 。

5) 把温度数显表调至70℃，设定。使醪液以1℃/min的速度升温，在25min 内升至70℃，此时于杯内加入70℃水100ml （加水时注意冲洗杯壁和搅拌棒）。

6) 醪液在70℃下保温1hr ，在保温10min 时开始碘检，用玻璃棒取一滴麦汁，置于白瓷滴板上，冷却后加一滴碘溶液，混

匀。观察碘液颜色变化，每隔5min 重复一次试验，直至碘液呈黄色。

7) 保温结束后，在10～15min 内用冰水迅速冷却至室温。

8) 用水冲洗搅拌器，擦干糖化杯外壁，放置托盘天平上，加水使其内容物准确称量为450.0g

9) 取干燥玻璃漏斗，内放入折叠好的中速滤纸，置于铁架台的固定铁环内，漏斗下用塑料杯连接。

10) 将最初收集的约100ml 滤液返回重滤，收集滤液于平底烧瓶内。

11) 把滤液置于甘油浴内煮沸40min 后，或用电炉煮沸也可，用双层滤纸过滤至干燥杯中。滤液用冰水冷却至15℃，取一洁净、干燥、恒重的比重瓶，用滤好的麦汁入20±1℃的高精度恒温水浴中，待内容物温度达20℃时，用滤纸吸取溢出支管的水，盖上小帽，擦干瓶壁，立即在分析天平上称量（准确至0.0001g ）

12) 根据公式计算滤液的比重。（按常规麦汁检测方法操作）

13) 然后从附录A 中查出该比重所对应值，该值即为麦汁的浓度。要求浓度为11±0.2°P ，如达不到，则重做。

2. 麦汁培养基的制备

1) 澄清

(1) 按0.5—1L 使用一个鸡蛋清的比例，取若干个鸡蛋，收集蛋清于一洁净的烧杯中用搅棒把蛋清打成泡沫儿。

(2) 将麦汁加热至45±2℃，加入打成泡沫的蛋清，在不断搅拌下保温30min 然后升温煮沸30min 。

(3)

滤。

2) 调糖度 ：将麦汁用蒸馏水调糖度至11±0.2°P 。

3) 用1N 的磷酸调PH5.4～5.8，（检测方法同糖化检测醪液PH ），即制成了麦汁液体培养基。

4) 分 装 ：准备18×180的试管10支，每只试管各加10ml 液体培养基 。

5) 灭 菌 ：将分装好的培养基放入高压蒸汽锅灭均，0.05Mpa 40min 。放入无菌室备用。

3. 蛋清的制备

取10个新鲜鸡蛋，收集蛋清，把蛋清打成泡沫儿，备用。

4. 液体培养基的制备

取约10升大生产用的糖化麦汁，用滤布过滤后，加热至40℃，加入事先已准备好的蛋清煮至沸腾后，开始计时，再煮沸20分钟，加适量蒸馏水补充到麦汁浓度要控制在10℃～11℃之间，再煮沸至沸腾后，放凉、过滤。用1N 的磷酸调pH 5.4~5.8，备用。

5. 液体培养基的分装

⑴ 在20×200的试管中，加入10毫升液体培养基

⑵ 在250毫升锥形瓶中，加入150毫升液体培养基

⑶ 在3000毫升锥形瓶中，加入1500毫升液体培养基 煮沸后的麦汁用水浴冷却至80—90℃，用双层中速滤纸过

⑷ 分装完毕后，试管和锥形瓶分别用牛皮纸包扎好。准备灭菌。

6. 液体培养基的灭菌

将上述制备好的液体培养基放入高压蒸气灭菌，0.05MPa ，灭菌40分钟。放无菌室备用。

7. 固体培养基的制备：

1) 制备：取上述已处理过的澄清自制麦汁200毫升加入4克营养琼脂后，加热溶解后备用。

2) 分装：在18×180的试管中，加入10毫升固体培养基，用牛皮纸包扎好，准备灭菌。

3) 灭菌；将上述制备好的固体培养基放入高压蒸气灭菌，0.05MPa ，灭菌40分钟。放无菌室备用。

8. 卡氏罐麦汁的制备：

取大生产糖化麦汁16升，用四层滤布过滤，分装入两个体积15升的卡氏罐，每只卡氏罐大约装7.5升麦汁。盖好盖子，塞上棉塞，用牛皮纸好。高压蒸气灭菌。0.05MPa ，60分钟。放无菌室备用。

从卡氏罐至各级扩大培养，由于培养基用量太大，一般由生产车间制备，但此麦汁也应是专供培养酵母用的，剩余麦汁可供啤酒生产用。要求辅料比例不要太高，麦汁澄清透明。

现在，许多啤酒厂生产的麦汁a-N 偏低，核苷酸、泛酸、肌醇不足，导致扩大培养中酵母营养不良，影响增殖。

四、 恰当的扩大比例

在逐级扩大培养过程中，不同的扩大比，会影响到起始细胞浓度、

扩陪时间、酵母菌龄一致性以及在扩大培养中抵抗杂菌污染的能力。扩大比遵循的原则如下:在汉生罐以前各级，由于采用较高培养温度（25～27°C ），酵母倍增时间短，无菌操作条件好，可采用1:10～20；反之，汉生罐以后各级，采用低温培养（不大于13°C ），酵母倍增时间长，杂菌污染机会多，扩大比宜小，一般1:4～5。

五、 恰当的移种时间

酵母在一次培养基中培养，将经历滞缓期、对数生长期、稳定期、 死亡期等阶段。我们都清楚在对数期移种，可获得出芽最多、死亡率最低、最强壮的种细胞，而滞缓期最短，增殖最旺盛。困难在于如何判别接种后的对数期。

1) 培养时间估算法

在优良麦汁培养基中，正确的扩大培养，酵母饱和期细胞数可达到9. 0～12.0×107个/ml，在对数后期移种浓度一般在7. 0～7.5×107个/ml。

若采用10°C 培养，世代时间为9h ，接种后细胞浓度为1.5×107个/ml，规定移种细胞浓度为7.5×107个/ml。酵母在对数增殖期遵循如下公式：2n .a 0=A; 式中n-增殖次数；A-移种细胞浓度；a 0-起始增殖

细胞浓度，不等于起始细胞浓度，一般接种后仅有50%以下细胞能出芽增殖，余下细胞虽然可能是活细胞，但不出芽。) 设a 0=1.5×107×

50%，则培养时间t=t0+ntm 式中t 0-滞缓期时间（h ），和培养温度有关，

10°C 培养一般为1～13h ，取8h ；n-增殖次数；t m -酵母在培养温度

下倍增时间（h ）。则t=8+3.3222×9.0=37.9h，若采用12°C 培养，则t 0=6h，t m=6h，t=6+3.2222×6h ；由上计算，如在10°C 培养需

38h ，如12°C 培养培养26h 移种。

2) 降糖判别法

啤酒酵母在11-12°P 麦汁中通风培养，当酵母使麦汁还原糖降至 1/3-2/5时，酵母增殖曲线一般在对数的中期或中偏后，，此时外观泡沫最高并开始下降。结合镜检，汉生罐出芽率45～50%、细胞数经通风搅拌后约6.5～7.5×107个/ml，死亡率在0～1%。增殖罐出芽率在35～45%，细胞数在5.0～6.5×107个/ml，死亡率在0.5～1.0%。对于凝聚性好的酵母，必须经通风搅拌后取样检测细胞数。

移种太早，虽然出芽率高，但细胞太嫩，不但会延迟下一级扩大培养时间，而且会增加下一级酵母的死亡率；移种太迟，虽然细胞数多，但出芽率低，下一级培养后酵母形态大小差异大。

六、 严格控制培养条件

1. 无菌室的消毒与灭菌：

1) 每月一次

酵母无菌室应经常保持清洁，无灰尘，在使用前一个星期用甲醛和高锰酸钾熏蒸灭菌。方法是按甲醛用量的 一半称取高锰酸钾于一

瓷碗或玻璃容器内，再量取定量的甲醛溶液，室内准备妥当后，甲醛液倒在盛有高锰酸钾的器皿内，立即关门。几秒钟后、甲醛溶液即沸腾而挥发。高锰酸钾是一种强氧化剂，当它与一部分甲醛液作用时，由氧化作用产生的热可使 其余的甲醛液挥发为气体。

2) 每周一次

另一种方法是用硫磺熏蒸，硫的杀菌作用要通过燃烧氧化后才得以实现，硫燃烧产生SO2，与水作用生成亚硫酸，它可以附着在菌体细胞上，夺取菌体的氧形成硫酸，同时使微生物脱氧，造成死亡。燃烧硫磺的方法是将硫磺粉放在小铁合内，倒入少量酒精，然后点火燃烧，此时SO2气体散布于空气中。二氧化硫具有强烈的刺激性，使用时应注意安全，防止中毒。

3) 接种前，每天一次

紫外线照射法：紫外线是位于可见光紫光区以外的，波长为136～390纳米的不可见光，其中波长为260纳米的紫外线杀菌力最强，人工制做的紫外线灯发出253.7纳米的紫外线杀菌力强且稳定。另一方面，空气在紫外线照射下，可产生臭氧，臭氧也有一定的杀菌作用。接种室常用紫外灯光作空气除菌，为了加强紫外线灭菌效果，在开灯以前，可以的接种室内喷洒石炭酸溶液，一方面使空气中附着微生物的尘埃降落，另一方面也可以杀死一部分细菌。接种室内的桌面、凳子等可用2～3%的来苏儿水擦洗，然后再开紫外灯照射30分钟左右。为了检验紫外线灭菌的效果，可以在灭菌后接种室内桌上和桌下（或屋内四个角及中央）各放一套已倾入营养琼脂培养基的平皿，把皿盖

打开15分钟，盖上，至于37℃培养，如果每个平皿的菌落不超过4个，则可认为灭菌效果良好，若菌落很多，则需延长照射时间或同时加强其它措施。

注意事项：紫外线对人体有伤害作用，尤其人的眼睛，所以不能直视开着的紫外灯，也不能在开着灯的情况下工作。

4) 对生化培养箱用75%酒精棉球檫拭一遍，放入打开的平皿放置5 分钟，盖上平皿培养24小时，菌落不超过5个，否则认为灭菌不良，重新进行灭菌。

2. 培养温度

现在诸多啤酒厂使用上面酵母菌，其最适生长温度在20～30°C ， 实际生产扩大培养过程中，还需要考虑到减少酵母的死亡率、减少杂菌的可能及让酵母逐步适应发酵温度。因此，酵母扩大培养采用逐级递减温度培养法。如下：

a) 试管培养：培养温度：25±0.5℃，培养时间：24小时。每隔4小时摇匀一次。白班摇4次，上午下午各两次。以下类同。 b) 小三角瓶培养；培养温度：23±0.5℃，培养时间：24小时。每隔4小时摇匀一次。

c) 大三角瓶培养:培养温度：21±0.5℃，培养时间：24小时。每隔4小时摇匀一次。

d) 卡氏罐培养: 培养温度：17±0.5℃，培养时间：24小时左右。每隔2小时摇匀一次。

e) 汉生罐培养：培养温度：15±1℃，培养时间：36小时左右。每

隔3小时冲氧一次，每次冲5～10分钟。

f) 一次罐培养：培养温度：13±1℃，培养时间：36小时左右。每隔3小时冲氧一次，每次冲10～15分钟。

g) 二次罐培养:培养温度：11±1℃，培养时间：36小时左右。每隔3小时冲氧一次，每次冲10～20分钟。

h) 二次罐培养不得超过4次。

i) 发酵培养:满罐温度控制在9.5～10℃。

发酵温度和培养温度随酵母菌种的不同而异，上述培养温度适合 上面酵母。某些菌株不适应低温发酵，因为培养温度太低，也会影响菌株的繁殖，应参照使用菌株的特性和最佳发酵温度而定。

3. 通风

虽然啤酒酵母可以在好氧或厌氧条件下繁殖，但效果不同，如下 反应式：

有氧呼吸：C 6H 1206+38Pi38ADP+6O2→6CO 2+6H2O+38ATP+△Q

无氧呼吸：C 6H 1206+ 2ADP+2 Pi→2C 2H 5OH+2ATP+△Q

式中ADP-二磷酸腺苷；ATP-三磷酸腺苷；Pi-无机磷酸；△Q-放热 从反应式可知酵母菌在有氧呼吸1mol 麦芽糖时可以获得较多合成细胞用的能量(38个ATP) ，而无氧发酵，只能得到2个ATP ，而且会积累较多抑制繁殖的酒精。有氧呼吸消耗1g 糖可以得到0.5g 酵母干物质，无氧发酵只有0.0278g 。酵母菌有氧呼吸按TCA 代谢，与乙醛酸代谢相联，合成新的氨基酸，比较容易合成RNA 等，供酵母细胞生长需要；若无氧发酵，当培养基缺乏某一氨基酸（虽然其他氨基酸

还很多），由于氨基酸转换困难，细胞合成就受到阻遏。因此，在培养细胞为目的的扩陪过程中，应把氧作为主要的“营养物质”。近代研究证明，酵母细胞合成初期需要有酵母甾醇，而酵母甾醇的合成，必须在有氧条件下进行，而且氧是限制性营养物质，即扩陪过程必需有适当的通风培养。通风不足是影响酵母增殖促进细胞衰退的主要因素。国内啤酒厂一般供氧不足，且种子罐无搅拌，气泡较大，故通风的效果不佳；若扩培罐中通风，溶解氧不足，会产生大量酒精，对酵母产生毒害作用。但培养啤酒酵母的目的是为了进行厌氧发酵，如果一味追求细胞数，过度通氧（特别是最后1～2级），也会造成酵母细胞呼吸酶活性太强，酵母酶活性不足，影响以后的发酵。

4. 汉生培养罐的留种

1) 每次更新麦汁前:汉生罐应预先通过手动搅拌或无菌压缩空气 搅拌，使已经沉淀的酵母均匀搅拌成乳浊液，搅拌和通风必须足够打碎结实的凝聚状酵母，然后按罐实际容积放走85～90%酵母悬浊液，留下10～15%，再补充新的麦汁。如果留种量偏大，虽然起发酵时间可缩短，但补充新的麦汁后，新生酵母会偏少，酵母容易衰老。

2) 更换麦汁:汉生罐不论是否需要扩大，每月要更换一次新的麦汁。 更换的麦汁如前所述，必须是优良的麦汁，通过杀菌罐，在压力0.08～0.10Mpa 下杀菌1h ，并迅速在杀菌罐用夹套冷却至60℃以后，麦汁中必须通入无菌空气搅拌。麦汁冷却至比汉生罐培养温度高3～5℃，使重新发生凝固的蛋白沉降，如杀菌罐底只有1个出口，应先从罐底排出5～10%带有大量蛋白质沉淀的混浊麦汁；如有高低2个出口，

则可从高出口把麦汁压至汉生罐中。（连接管路预先杀菌）

3) 留种汉生罐培养：

作为留种汉生罐培养，应注意培养时间，切勿使培养过头，否则 在低温培养酵母时，由于营养缺乏，会加速酵母的衰老。

培养方法如下：更换新麦汁，罐内保持12～13℃，通风20min 后保温培养，一般6h 左右可以起发。在起发后，注意冷却控温，每个1～2h 通风20min ，继续培养18～24h （在12～13℃），在18h 后注意检查：①发酵度控制在30～35%。②酵母细胞浓度在0.6×107个/ml。如上述两个指标接近时，应开大冷媒，在4h 内降至2～3℃，转入酵母饲养阶段。饲养阶段温度应尽可能均衡维持在2±1℃. 汉生罐保存酵母时，不论哪一阶段，罐压均保持在+0.03Mpa，以防止空气渗入罐内染菌。

汉生罐饲养酵母要转入投产扩大培养时，最好按上述步骤培养一次再移种，因为饲养虽然在低温中，酵母新陈代谢大大减慢，此时酵母也会逐步衰老，若不重新培养，到生产中就扩大，会导致下一代酵母细胞衰老增多，繁殖时间也会延长。

如果培养麦汁营养太差，缺乏a-N 和生长素，可以在麦汁中添加1%麦根（粉粹后用35℃热水萃取3h ，过滤备用）浸出液，增加营养。如果长期用全麦芽汁培养酵母，酵母营养过好，酵母易长的过分肥大而影响发酵力。也可以在麦汁中加30%葡萄糖，加水调节成11°P ，杀菌后培养酵母。