红霉素生物合成的生物化学和基因学

JOURNAL 微生物学杂志　2005年3月第25卷第2期　

OF MICROBIOLO GY Mar. 2005Vol. 25No. 245

红霉素生物合成的生物化学和基因学

孙　艳1, 周仁清2, 吴　琼3

(1. 沈阳农业大学食品学院, 辽宁沈阳　110161;2. 辽宁大学生命科学系, 辽宁沈阳　110036;

3. 吉林大学药学院, 吉林长春　130021)

摘　要　从基因重组技术问世以来, 对红霉素(大环内酯类抗生素) 生物合成的生物化学和基因学的研究到目前已经累积了大量的研究结果。就这2个领域中对红霉素生物合成的研究历史、研究现状和研究前景(组合生物合成) 作以简要的介绍。

关键词　大环内酯; 红霉素; 基因学; 组合生物合成

中图分类号　R978. 1+5　　　文献标识码　A 　　　文章编号　1005-7021(2005) 02-0045-06

Biochemistry and G enetics of Erythromycin Biosynthesis

SUN Yan 1, ZHOU Ren 2qing 2WU 3

(1. Coll. of Food Sci. S henyang A gric. U niv. S henyang 110161; 2. of if L niv. S ;

3. Med. Coll. Jili n U Abstract 　Since the DNA , far a large number of the outcomes of bio 2chemical (antibiotics ) has been accumulated. The histo 2ry of two , current research situation , and theprospect of the research (combina 2torial ) in biosynthesis were summarized in this paper. K eyw ords macrolide ; erythromycin ; genetics ; combinatorial biosynthesis

　　红霉素(Erythromycin , Er ) 是从糖多孢红霉

菌(S accharopolyspora erytherus ) 培养液中分离出来的一种抗生素, 属于大环内酯类抗菌素, 又被称为robimycin 或e 2mycin 。包括红霉素A 、B 、C 、D 、E 、F , 临床上广泛应用的是红霉素A 。　　红霉素对革兰氏阳性菌有较强的抗菌活性, 如溶血性链球菌、肺炎双球菌、草绿色链球菌、白喉杆菌, 对革兰氏阴性菌如脑膜炎球菌、淋球菌、流感杆菌、百日咳杆菌、布氏杆菌及军团菌等也有抗菌作用。其抗菌机制是它与细菌核蛋白体的50S 亚基通过核糖体结合, 而抑制转肽作用及信

一代治疗耐药性细菌的抗生素[1]。目前, 利用基因工程手段对红霉素的结构进行改造的研究越来越多, 而对其进行基因工程的研究, 要在充分认识其生物合成的生物化学和基因学的基础上展开, 因此本文就这一点做以简单叙述。红霉素是糖多孢红霉菌合成的次级代谢产物, 先通过基因转录、翻译成一系列红霉素生物合成相关的蛋白酶, 再由酶利用小分子物质合成红霉素。

1　红霉素的生物合成

　　红霉素的生物合成包括2个方面:大环内酯环的合成和大环内酯环的后修饰。1. 1　大环内酯环的合成　　红霉素的大环内酯环即62脱氧红霉内酯(62deoxyerythronolide B , 62dEB ) 的生物合成是由丙酸和甲基丙二酸在复合酶系—多酮合成酶(poly 2

使核糖核酸(mRNA ) 移位, 使核蛋白体上延伸的

肽链解离, 不再形成正常功能的蛋白质, 从而抑制蛋白质的生物合成。红霉素自发现以来在临床上得到了广泛的应用,1999年的年销售额超过35亿美元, 位居抗生素销售额的第3位, 被认为是下

　收稿日期:2004-08-02

　作者简介:孙艳　女, 博士研究生。研究方向为生物技术。

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ketide synthase , P KS ) 的催化作用下, 经缩合、酮

还原、脱水和烯还原等多轮循环完成的。丙酸和

甲基丙二酸均由初级代谢产物分解而来, 因P KS 具有脱羧酶的活性, 甲基丙二酸脱羧也能产生丙酸。P KS 合成的最终产物为62dEB , 故也被称为62脱氧红霉内酯B 合成酶(62deoxyerythronolide B synthase , DEBS ) 。DEBS 由DEBS1、DEBS2和DEBS3三条肽链组成。

的3条肽链每个都含有两套结构和功能相近的

酶域(domain ) , 每套酶域称为一个模块(module , M ) , 每个模块催化完成一轮碳链的延伸和还原, 每个模块都有3个基本酶域。除了6个模块外, 在DEBS1的N 端有一个由A T 和ACP 组成的负载酶域(loading domain ,LD ) A T L 和ACP L , 它们负责选择和结合起始单元第一个小分子羧酸; 在DEBS3的羟基端有一个硫酯酶酶域(thioesterase , TE ) , 负责将合成的长链脂肪酸从P KS 上水解下来, 并与P KS 的其它部位共同作用将产物环化成62dEB 。

1. 2　对大环内酯环的结构修饰

　　1982年Thompson 克隆出了红霉素抗性基因

mls [2], 后改为erm E , 正是该基因的存在使糖多孢红霉菌能够合成红霉素, 且菌株正常生长, 不死亡。1986年Stanzak 发现红霉素合成基因成簇存在于erm E 基因附近[3],1991年Donadio 等克隆了全长35kb 的DNA , 并根据ORF (open read frame ) 和已知序列相比确定了其上的28个活性位点, 最终提出了聚酮生物合成的模型[4]。DEBS

　　对大环内酯环的结构修饰包括:C 26位和C 212位的羟基化,C 23位和C 25位羟基的糖基化,C 23位糖基上C 23″羟基的甲基化。

图1　红霉素生物合成过程简图

红霉素E 和红霉素F 的生物合成过程不详, 图中未给出

2期　　　　　　　　　　　　　孙艳等:红霉素生物合成的生物化学和基因学　　　　　　　　　　　　　　　　　　47

　　62dEB 在C 26羟化酶的作用下形成红霉内酯(EB ) 。EB 在糖基转移酶的作用下, 先在C 23位接上第1个脱氧糖L 2mycarose , 后在C 25位接上第2个脱氧糖D 2desosamine , 从而形成了具有生物活性的红霉素D (ErD ) , ErD 在C 212羟化酶的催化下转化成红霉素C (ErC ) 。ErC 进一步在甲基化酶作用下于mycarose 的C 23位形成醚, 从而合成了红霉素A 。早在1978年Queen 等就证明ErA 的正常生物合成途径是ErD 到ErC , 再到ErA [5], 也有实验显示ErB 是ErA 合成过程中的一个支路产物, ErF 和Er E 也是红霉素发酵过程中的天然产物, 有人推测ErF 是ErA 到Er E 的中间体[5]。

分布在红霉素多酮合成酶基因的两侧。　　2个脱氧糖生物合成的前两步是相同的, 就是12磷酸D 2葡萄糖在TDP 2D 2葡萄糖合成酶的催化作用下生成TDP 2D 2葡萄糖, 随后C 24和C 26位在4,62脱水酶的作用下脱水。糖多孢红霉菌中

gdh 和kde 基因已被克隆, 它们编码的蛋白类似

这些酶, 但这2个基因不在红霉素基因簇中, 而且gdh 编码的4,62脱水酶还不能够确定参与了红霉素的生物合成。1998年Salah 2Bey 提出了脱氧糖生物合成和连接的模型(如图2) [14]。2个脱氧糖合成后就参与红霉素的生物合成。

3　红霉素生物合成的基因学

　　红霉素生物合成的基因成簇存在于糖多孢红霉菌的染色体上[3], 总长约56kb , 以ery CI 和K [6,7]6dEB 合成的3(A I 约为, ery A 2　脱氧糖的生物合成

　　红霉素分子中有2个脱氧糖,L 2cladinose (甲基化的L 2mycarose ) 和D 2desosamine , 两者的生物合成分别涉及6个ery C 基因和7个ery B 基因, 这些基因都不是成簇存在的, 1编码氨基酸残基个数

ery CI (ORF1) ery E ery BI (ORF2) ery BIII (ORF3) ery F (ORF4)

转录方向

(与erm E 相比)

功能参考文献

1197nt 1143nt

2427nt 1245nt 1215nt 744nt 921nt 1002nt 1266nt 1089nt 9. 5kb 10. 7kb

[***********][***********]68

ORF5

ery G (ORF6) ery BII (ORF7) ery CIII (ORF8) ery CII (ORF9) ery AIII (ORF10) ery AII (ORF11) ery AI (ORF12) ery BIV (ORF13) ery BV (ORF14) ery CVI (ORF15) ery BVI (ORF16) ery CIV (ORF17) ery CV (ORF18) ery BVII (ORF19) ery K (ORF20)

f dx A gdh 未知

969bp 1248nt 714nt 1464nt 1206nt 1470nt 582nt 1197nt 318nt 990nt 未知

[***********][1**********]9相反相同相反相同相同相同相反相反相反相反相反相反相同相同相同相同相同相同相同相同相反333332转氨酶8,102,106,11,126,11,12,136,12,136,12,136,126,14,156,14,156,14,15164,174,1815,1915,1915,1915,1915,1915,1915,199,202122红霉素抗性基因葡萄糖苷酶甲基转移酶C 26羟化酶未知甲基化酶2,32烯还原酶糖基转移酶羟化酶未知未知未知

42酮还原酶糖基转移酶N 2甲基转移酶2,32脱水酶3,42脱水酶3,42还原酶3,52表异构酶C 212羟化酶

为P450羟化酶提供电子4,62脱水酶　注:f dx A —铁氧还蛋白基因; gdh —4,62脱水酶基因; kde —3,52表异构酶基因; 33:该基因不存在ery 基因簇中

图2　

脱氧糖的合成途径

图3　红霉素基因的排列顺序和转录示意图(箭头所指为基因的转录方向)

　　Reeves 的实验表明, 红霉素基因簇的转录中含有单顺反子和多顺反子。ery CI 、erm E 、ery B I 和ery K 都是单顺反子, 多顺反子包括:ORF32ORF5、ORF122ORF6、ORF13219和ORF16219, 且

　　由于红霉素口服时易被胃酸降解, 且对其具

有耐药性的致病菌逐年增多, 目前市场上的红霉素种类已无法满足临床治疗上的需求。要获得抗酸并且对耐药性致病菌具有活性的新的红霉素类抗生素药物, 就必须对红霉素的结构进行改造, 研制出新的抗生素类药物。生物技术的不断发展为人们改造红霉素结构提供了新的途径, 目前对红霉素基因工程的研究已越来越深入, 主要是对大环内酯环结构的改造及后修饰中涉及的羟基、糖

红霉素基因簇中的每个顺反子的启动子均有-10和-30序列[9]。

4　组合生物合成技术在红霉素研究

中的发展前景

基和甲基的基因工程改造。这2个方面已有详细的报道, 这里只简单介绍一下组合生物合成。　　组合生物合成(combinatorial biosynthesis ) 是指对自然产物的生物合成路径中编码酶的基因应用基因操作, 重新设计抗生素的结构, 实现新的结构和功能的组合, 使其产生新的活性, 进而获得新的产物。对编码自然产物生物合成路径中酶的基因簇进行重新移位、缺失和基因替代会产生很多“非自然”的自然产物, 这样就能获得其他方法难以得到的新化合物。到目前为止, 利用这一技术已获得了多种可有效应用于临床的化合物。如有报道将链霉菌中产冥菌素的基因引入S t repto 2myces f radiae 中, 从而改变了该菌株脱氧己糖的生物合成能力, 改造后的菌株产生了2种数量很大的具有潜在应用价值的大环内酯, 它们是以前通过发酵不曾获得的新产物[23]。Hoffmeister 运用这一技术改进了蛋白区, 这个蛋白区是用于控制2个urdamycin 脱氧糖糖基转移酶中的核糖和受体底物特性的, 了底物的特性[24]　　P KS , 肽链、, 而每个酶域的功能顺序与染色体上的基因顺序又是相对应的。根据这一点, 在基因水平上通过增加或减少模块和酶域的量, 或用其它类似P KS 中的酶域来替换, 就可以合成新的化合物。尤其是对多酮合成酶模块结构的改变能够产生临床上重要的自然产物, 目前, 应用组合生物合成改变多酮合成酶的结构, 以产生特定自然产物的方法已经完全建立起来, 并且利用这种方法获得的一些大环内酯已经生成了新的抗生素类物质。1999年Xue 等就构建了一个具有3个质粒用于62脱氧红霉内酯B 外源表达的体系, 这个体系便于Ⅰ型多酮合成酶模块利用组合生物合产生多酮类物质, 构建这个体系的方法还可以用于其他P KS 模块中[25]。张部昌等扩增不含KR6酶域的DNA 片段后, 再构建了同源重组质粒之后转入糖多孢红霉菌中, 从而产生了自然界中从未发现的酮内酯类化合物—32脱氧232羧基2红霉内酯B [26]。有报道将苦霉素P KS 中的pik A I 和pik A II 基因与红霉素P KS 中的ery A III 基因融合到一起, 产生了杂交大环内酯32hydroxynarbonolide

[27]

道通过加入额外的模块以扩展多酮合成酶[28]。　　脱氧糖对抗生素的生物学活性具有关键性的作用, 生物活性分子中糖的数量、种类和相对位置对生物学活性和药理学特性有很大的影响。因此, 人们对脱氧糖的基因工程研究也做了很多的工作。Doumith 曾报道构建了2个质粒, 将它们用于在缺失基因ery BV II 的突变体S ac. ery 2thraea 菌株中分别表达S t reptom yces peuceti us 中的基因dum U 和S ac. erythraea 中的基因ery B 2V II , 这2个实验结果都生成了红霉素A , 这也表明,2个蛋白质在d TDP 2L 2daunosamine 和d TDP 2L 2mycarose 的生物合成中具有类似的功能[29]。

运用组合生物合成引入异源脱氧糖生物合成基因, 可以改善产抗生素菌株中脱氧糖的生物合成路径, 途径。

, , 。因此, 这方面的代谢产物的结构和功能的关系。相信, 随着这一研究方法的不断发展, 人们将能够合成更多抗酸且对耐药性致病菌具有活性的新的红霉素类物质, 从而使更安全、更有效的药物不断出现。　　红霉素自发现以来广泛应用于临床, 已经成为不可缺少的抗生素类药物, 目前对红霉素生物合成的生物化学和基因学已有了较全面的认识, 在这基础上人们运用新技术对它的改造也在不断进行, 这必将促进新的大环内酯类抗生素的出现和发展。参考文献:

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