光纤光谱成像技术原理及其应用

光纤光谱成像技术原理及其应用

赵友全 王锦 范世福

(天津大学精密仪器与光电子工程学院 300072)

本文介绍了一项国外最新研制的纤维束成像压缩技术（FIC），应用该项技术可以实现光学吸收光谱和荧光光谱成像。吸收光谱成像像实验测定了染色的百合茎部切片的光学吸收分布情况，荧光光谱成像实验测定了红宝石荧光边界的移动，分析了夹挤在两金刚石界面间的微晶红宝石粉的压力分布状况。

关键词：荧光光谱；吸收光谱；光谱成像；光学纤维；显微镜。

1.引言

带电耦合器件（CCD）和红外聚焦平面阵列（FPA）探测器的发明推动了光谱和化学成像技术的快速发展。一般而言，这个过程包括了三维数据空间的光谱成像数据的采集，包括定义对象图像的两个空间轴和一个用化学方法测定图像每点处材料的一维光谱尺度。过去获取这些光谱成像立方体的方法是运用液态晶体可调谐的滤波器（LCTFS）或声-光学可调滤波器（AOTFS）去扫描光谱尺度，或者运用结合线形照度的机械移位扫描。这些方法需要通过3D 数据立方体系对一系列切片的图像连续采集，故不能同时采集一整幅光谱图像。相反，最新研发的光纤束成像压缩方法（FIC）允许在CCD 探测器的一次扫描中进行整幅光谱图像数据晶系的同时采集。FIC技术和与其密切相关的其他技术一样，在近期还应用于拉曼成像、红外线成像和原子发射成像[1]。

2．FIC技术原理与结构

FIC 光谱成像系统结构如下图所示：在显微镜工作平台的基础上，配置有透射照明光源（汞灯）和落射式荧光激光光光源。FIC为一有着特殊构造的光纤束，来自样品发射的光成像到光纤束的搜集端，搜集端光纤束是圆形阵列光纤束，光纤束的另一端（探测端）的光纤按照一定顺序被排列成一条线，它被用作摄谱仪的入缝。

图1、 荧光光谱成像装置结构示意图

（Ar+激光，L1－显微镜焦面扩束透镜，HBS－全息分光片，HNF-全息槽形滤光片，L2－成像透镜，圆形集光端面，线性排列光纤末端，摄谱仪CCD）

光纤的收集端和探测端中每根光纤一一对应，这种排列使图像的两个空间维压缩成为一个。样品发射的光因此而产生光谱色散并被CCD 探测器一次读取成像。也就是说，CCD上的每个像素（或区域）包含了三维（X/Y/λ）的位置信息，在CCD 获取的一帧图像中包含了来自样本的完整的光谱成像。3D数据立方体重建要求简单地将光纤在线性排列中的位置映射到圆形接收端的位置，之后具体的图像处理可采用任何图像处理软件即可。

FIC 方法的相对于可调滤波器（TF）和线形扫描（LS）成像方法的最大优点，在于它不需要为构建一幅光谱图像而重复扫描。此外，不同于TF 成像方法的是，FIC一次提供了视野区域样本所有点的一个完整的光谱，而不是特定某个波长的光谱。FIC方法的空间分辨率取决于显微放大后成像到FIC 光纤束端面的图像，即系统的光学衍射限制，这与TF 和LS 方法一致。另外，FIC方法在图像分辨率上还有严格的限制，即参与成像的像元数限制，这是由光纤束中所有单根的光纤数量决定的。这种约束依次为CCD 探测器的高度和光谱图像的分辨率指定，因为CCD 接收面必须对所有FIC 光纤束端面的光纤全部成像。

3．FIC吸收光谱和荧光光谱实验

吸收光谱成像是通过对百合花茎部切片样本的测量来进行的，照明光源来自奥林巴斯BH2显微镜底部的100w 的汞灯。为防止在1S 内使CCD 探测器达到饱和，照明光源的强度由被置于显微镜镜台的中性滤光片衰减。样本透射光为40×光学无穷远修正的显微物镜所接收，物镜焦距为4.5mm，数值孔径为0.75(奥林巴斯模型UMPlanF1)。样品透过率测量的方法是通过记录穿过植物切片不同区域的光谱图像以及在没有切片的情况下得到的图像相除而得到的。因此这样所得的光谱明显地描述了植物切片图像上每个位置处的光的透射情况。也就是说，因样品内部散射引起的任何图像上的变化与通过显微镜目镜所看到的一样。用于本实验测量的高品质植物切片如图2所示，它是由置于显微镜顶端的CCD 成的样本透射光的灰度图，显示了由安置在显微镜上的头顶CCD 摄像机所获得的通过样品的光束的无色差图像。图2也包含了用于获取样本光谱图像的61根光纤的FIC

光纤的投影图。

图2 透射照明得到的百合茎切片图像

红宝石荧光实验利用了514.5nm 的氩激光（光谱物理，型号2060-10s）激发样品产生荧光，带通

滤光片(514.5，T-BOA, Intor INC.)来滤除激光器上的等离子体线。利用一个标准的光学系统将激光导入显微镜并且经过全息分束器DIC（HBS,Kaiser Optical System, Inc.）直接射向样本，保证有90%以上激光被反射而且90%以上信号透射。激光聚焦到样本上，物镜20×，无穷远光学校正，焦距9mm，工作距离11mm，数值孔径为0.4（奥林巴司，型号100155），样品曝光时间为5秒。后向散射的荧光信号被同一物镜收集并通过一个有全息凹槽的滤光片(HNF:Kaiser光学系统)移除进入的入射激光。在样品上激光被一个置于外部的透镜散焦成一个200um 大小的斑点，如前面图1所示。这种方法可以激发全部成像面的样本产生荧光同时保证样本位于焦面不动。

光纤束的直线排列末端被用作一个成像摄谱仪(定制的250mm 焦距的双透镜摄谱仪)的入缝。摄谱仪的入缝宽度100um，因为单根光纤芯径为100，在吸收研究中，摄谱仪装配有150线/mm的光栅（Milton Roy），分辨率为3nm@600nm；在荧光性研究中，闪耀波长为750nm，600线/mm的光栅，分辨率为1nm@690nm（Instruments SA）。色散光谱接收使用液氮冷却分光CCD 照相机(Princeton Instruments Corp, 普林斯顿仪器公司，配置ST-135控制器的CCD,LN/1024EHRB)探测获取，象素为1024×256（每个象素大小为27平方微米）。在成像过程中，CCD芯片不在仪器内部（the ccd chip was not binned during image collection）。

可分辨的图像像元的大小由光纤直径与投影到FIC 光纤束端面的样品放大率共同决定。红宝石样品的总的放大率为5倍，视场直径为200um 的区域（一根光纤的有限的分辨率为20um），显微物镜20×。对百合植物切片，总放大率为10倍，显微物镜40×，视场直径为100um 的（分辨率为10um）。为了对中光纤束端面与样本图像平面，采用手持式670nm 二极管激光器对光纤束线性端面照明，然后观察圆形光纤端面与样本图像的重叠情况即可完成每个光纤与样本的对中。

4．结果与讨论

光学吸收测量需要对穿透样品的光强I 与无样品吸收的光强I0的比值的测定来完成。得出的样品透光率T＝I/I0与样品A 的吸光度有关。作为FIC 技术应用的示例，我们采集了百合茎部染色切片（Edmund 显微镜载波片号59－5280/6）的光学吸收图像。图2显示了这个样品的白光传输图像和每个FIC 光纤采光的位置（如前所述）。图3a 和3b 显示了无样品时由FIC 光纤束中的某单根光纤测得的I0的光谱分布。图3a 中的光谱是在光路中没有任何吸收介质的状况下测得的，显示的是卤灯光谱。图3b 显示了在载物台样本位置上放置了一个标定为0.1（光学距离为1，10%的透射率）的中性滤光片所得的光谱曲线。光纤1中所测得的吸光率的任何微小偏差（一些可能由衰减片本身的制造误差所致）都显示了仪器吸光不确定度的最差的测量状况。特别地，在545到845nm 之间所测0.95±0.1的衰减，误差小于2%（假定衰减片真实的衰减率为10%）。图3b 所示在光谱远红区和蓝区有明显的噪声，是由于这些区域的汞灯的光强很弱造成的，这也因此限制了测量吸收光谱的波长范围（同时避免了测试时在光谱范围内探测器达过饱和）。

图3. （a ）汞灯的透射光谱，（b ）中性衰减片的吸收光谱OD=1，（c ）单根光纤的光谱，吸收峰约为525nm （来自植物切片的深红色区域），（d ）另一根光纤的吸收光谱（样本蓝色区）

图3c 和3d 显示了两个不同光纤获得的百合染色切片的吸收光谱。为了区分两个吸收最大值，通过目镜观察的样品的这两个区域标有明显不同的颜色（在图2所示区域中从粉红色变到蓝色）。图3c 对应粉红色的区域，图3d 对应样品的蓝色区域。

图4显示了在一个大气压下红宝石晶体与处于高压下的红宝石粉末的荧光光谱。 显然高压情况下的峰比一个大气压下的峰阈值要宽得多，而且后者的2峰和1峰之间出现凹陷。我们认为这种峰的加宽是由每个FIC 光纤（红宝石粉样品内一个20um 的区域）成像区域的光谱的平均的变化所造成的。而且，因为光纤束超聚焦地采集光信号，样本不同深度处发射的光谱也被平均掉。因此，观测到的光谱很可能

会被认定为非均匀地展宽。

图4. 叠加在仪器的荧光光谱曲线（一个大气压－虚线，高压－实线）

最大峰的漂移可以测量受压的红宝石粉末在每一个区域位置的平均局部压力。因为存在荧光峰值漂移被用作0.1GPa 到10GPa 压力范围内的一个标准测量，故我们利用不同光纤红宝石荧光性极大值的漂移作为红宝石粉末样品内每点处平均压力的测量。特别地，每个FIC 光纤记录的光谱最大峰值位置（峰值位置由荧光性最大值附近利用一个高斯公式算出）用来代表每个光纤位置处的平均压力。荧光光谱峰移可以由高压下的光谱曲线的峰值减去值减去一个大气压下R1峰的峰值。该波长处峰移的压力计算可利用下面的标准压力定标公式：

P(GPa)=2.74×Δλ(Å). (1)

图5显示了局部压力变化的多项式插值结果（如上所述由所测压力值的样条插值获得）。结果会被作为局部压力变化值的3D 界面绘图。压力值以kilobars 为单位（1kbar＝0.1GPa）。压力值纵断面的投影等高线图如下图显示在XY 平面上。

图5 插值后的曲面表明红宝石晶体粉末的平均压力变化

XY 平面上为等压力线（间距1.25Kilobars ），每个水平轴的长度代表样本200um 的距离。

5．结束语

实验利用FIC 技术同时采集完整的光学吸收和荧光光谱图像，FIC 技术在测量因样品内局部光学参数改变或不同区域相对强度不同而引起的光谱成像方面有着很好的应用。光谱的所有阵列被一组光纤同时采集，故FIC 方法可比TF 成像法更高效地用于提取类似于光谱漂移之类的信息，因为TF 方法需要对研究对象光谱在每个波长处的独立图像做连续的采集。故FIC 方法实质上更适合应用在快速的光谱成像中（低或中等的空间分辨率）。

FIC 方法的光谱范围主要是受样本光学透射特性影响而不是光纤（在200nm 到2000nm 内有90%以上的透明度）。这一特性又与基于可调滤波的LCTF 方法形成明显对照，尽管使用者可购买不同光谱范围的可调滤波器，但LCTF 方法所适用的光谱范围还是很有限。此外，LCTF滤波器最多只有30%的透过率，而FIC 方法的通光量仅受光纤束和摄谱仪的限制，这完全比得上LCTF。

FIC 方法与LS 有相似之处，它们都是用一个单个的CCD 探测器的读出器采集全部光谱的所有阵列。但LS 方法一次只能记录两个空间维度，其中第二个维度是通过对样品的机械扫描完成的。在FIC 和LS 方法中，一个单个CCD 读出器所采集的分辨率元素的最大数目受到CCD 上纵向象素数目的限制（假定FIC 光纤直径和CCD 象素尺寸的大小相同）。故FIC 和LS 方法的主要区别仅在于每个CCD 读出器上采集数据的区域的形态不同。正由于这一区别，FIC方法更适用于对被测对象小区域高分辨率成像前进行的大区域的高速、低分辨率的测量。特别地，寻找被测对象含有某种化学物质的区域时可用一个低功率显微物镜进行大范围的测量。一旦含有某种光谱特性的区域被确认，一个具有更高放大率的物镜将会将那个区域进一步放大。用FIC 方法来进行这种测量和图像的电子放大显然比用LS 方法要好得多。

参考文献：

1．Brian L . Mcclain , JiaY Ma et al. , Optical Absorption and Fluorescence Spectral Imaging Using Fiber Bundle Image Compression，Appl. Spectrosc. , 53(9), 1999:1118~1122;

2.H. Matsuoka et al. Single-cell viability assessment with a novel spectro-imaging system, Journal of Biotechnology, vol. 94, 2002: 299–308