包涵体蛋白的纯化与复性

1．菌体的收集和破碎

用50 ml离心管分别收集诱导表达后的培养物，8000 rpm 4℃离心10 min(离心时间和速度应该都不够)。沉淀用适量的超声破菌缓冲液重悬。

【备注】超声破菌缓冲液：20 mmol/L Tris-HCl pH8.0、0.5 mol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1 mg/mL溶菌酶（暂时我没用）

重悬后的菌液于冰浴中进行超声波破碎，其条件为：功率为300W，占空比50%，每个循环30 s，总时间20 min。破碎后的匀浆， 4℃、 12000 rpm离心15 min。分别取上清液和沉淀进行12% SDS-PAGE分析，确定目的蛋白是否以包涵体的形式表达。

2．包涵体的处理

洗涤：沉淀用适量的包涵体洗涤缓冲液重悬后，搅拌洗涤20~30 min，于4℃，12000 rpm离心15 min，弃去上清液。重复一次。再用适量的50 mmol/L Tris pH8.0溶液洗涤一遍（以去除残留的EDTA），于4℃ 12000 rpm离心15 min，弃去上清液。

【备注】包涵体洗涤缓冲液（20 mmol/L Tris－HCl pH 8.0，0.5 mol/L NaCl，2 mol/L尿素，2％ Triton）

2％Triton X-100溶液：量取2mlTriton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)液，加M缓冲液98ml即可。

溶解：沉淀用适量的包涵体溶解缓冲液重悬，室温搅拌5-6小时或过夜。12000 rpm 4℃离心15 min，收集上清液。

【备注】包涵体溶解缓冲液（即结合buffer）：20 mmol/L Tris－HCl pH 8.0，0.5 mol/L NaCl，8 mol/L尿素，0.2 mmol/L DTT或100 mmol/L β-巯基乙醇，2％Triton

3．目的蛋白的纯化

亲和层析基于目的蛋白与固相化的配基特异结合而滞留，其他杂蛋白会流过柱子。

谷胱甘肽S-转移酶（GST）是最常用的亲和层析纯化标签之一，带有此标签的重组蛋白可用交联谷胱甘肽的层析介质纯化，但本方法有以下缺点：首先，蛋白上的GST必须能合适的折叠，形成与谷胱甘肽结合的空间结构才能用此方法纯化；其次，GST标签多达220个氨基酸，如此大的标签可能会影响表达蛋白的可溶性，使形成包涵体，这会破坏蛋白的天然结构，难于进行结构分析，有时即便纯化后再酶切去除GST标签也不一定能解决问题。

另一种可应用的亲和纯化标签是6组氨酸标签,组氨酸的咪唑侧链可亲和结合镍、锌和钴等金属离子，在中性或弱碱性条件下带组氨酸标签的目的蛋白与镍柱结合，在低pH下用咪唑竞争洗脱。组氨酸标签与GST相比有许多优点：首先，由于只有6个组氨酸，分子量很小，一般不需要用酶切去除；其次，可以在变性条件下纯化蛋白，在高浓度的尿素和胍中仍能够保持结合力；另外6组氨酸标签无免疫原性，重组蛋白可直接用来注射动物，也不影响免疫学分析。虽然有这么多的优点，但此标签仍有不足，如目的蛋白易形成包涵体、难以溶解、稳定性差及错误折叠等。镍柱纯化时金属镍离子容易脱落漏出混入蛋白溶液，不但会通过氧化破坏目的蛋白的氨基酸侧链，而且柱子也会非特异吸附蛋白质，影响纯化效果。若目的蛋白可与某种碳水化合物特异结合，或者需要某种特殊的辅因子，可将该碳水化合物或辅因子固相化制成亲和柱，结合后目的蛋白可用高浓度的碳水化合物或辅因子洗脱。

融合蛋白的表达和纯化过程：

1.挑单菌落于3-5 ml 2YT或LB 培养中，37℃过夜培养。

2.按1：100的比例取过夜培养液转接。37℃扩大培养至OD 0.5左右。

3.加入IPTG终浓度0.2～0.4 mM/L。 37℃摇床培养4～6h。

4.12000g离心15min，去上清。按40ml/100ml菌液加入1×Binding Buffer {破碎缓冲液组成： 左右,1mM EDTA ，溶菌酶(10 礸/g cell)，；或 20 mmol/l Tris-HCl, pH 7.5,1mmol/lEDTA, 0.1mM PMSF, DNAse (10 礸/g cell) }细胞破碎缓冲液中不含脲等变性剂，故不溶解包涵体。或4×PBS重悬细胞。

5.超声波破碎：占空比50％，超声15s，停15s，10～20min。破碎后的匀浆在4℃，12,000 rpm下离心30 min，弃去上清液。

6.洗涤包涵体：2M尿素在50mM Tris pH7.0～8.5左右,1mM EDTA ，10% Triton X-100中洗涤。洗涤2～4h 去除膜碎片和膜蛋白。8M尿素在50mM Tris pH7.0-8.5左右,1mM EDTA ，10% TritonX-100，二硫键还原剂中洗涤。洗涤4～8h，使包涵体变性可溶。

7. 过Ni柱：

Ni2＋亲和层析柱纯化

包涵体溶解后的上清液，用镍亲和层析柱纯化。操作过程参照Amersham Pharmacia Biotech公司提供的操作指南进行。具体过程如下：转移树脂到柱子，待完全沉淀后，用三蒸水洗涤镍亲和层析柱，以除尽基质中的乙醇和空气，并防止下一步Ni2＋沉淀；5×柱体积的Charge Buffer充电；20×柱体积的三蒸水洗涤，去尽游离的Ni2＋；10×柱体积的Binding Buffer平衡柱子；手工上样，根据蛋白的浓度来确定上样体积；20×柱体积的Binding Buffer洗涤，至检出无蛋白，并收集流出液，用于12％SDS-PAGE电泳检测；6×柱体积的Wash Buffer洗涤，至检出无蛋白；Elution Buffer洗脱，每次1 mL，收集洗脱流出液，洗脱至检出无蛋白；10×柱体积的Binding Buffer平衡。此时，即可用于纯化同种蛋白，不需重新充电。

纯化操作完成后，加5×柱体积的Strip Buffer洗涤，去尽Ni2＋；10×柱体积的三蒸水洗涤去尽EDTA；加5×柱体积的0.5 mol/L NaOH，静置0.5-2 h，去沉淀的蛋白质；三蒸水洗涤，至流出液的pH值为7.0；20％乙醇洗涤，再加适量20％乙醇，于4℃保存。

A、过柱前的注意事项：

a、样品必须澄清、无颗粒物，否则会堵塞柱子、缩短其使用寿命；

b、包含体洗涤的最后一步及溶解时所用的Buffer中不能含EDTA、DTT、2ME；

c、确保样品及Binding Buffer中有适量的NaCl，以防止杂离子与Ni离子竞争；

B、过Ni柱的操作步骤：

①用DDW洗涤，洗去20％的乙醇、除尽基质中的空气，并能防止下一步中Ni离子沉淀；

②⑩5×柱体积的Charge Buffer（50mM NiSO4）充电；

③5×柱体积的DDW洗涤，去游离的Ni离子；

④10×柱体积的Binding Buffer（20mM Tris-HCl,0.5M NaCl,5mM咪唑，pH8.0）平衡；

⑤上样（手工上样，样品体积应根据目的蛋白的浓度来确定）；

⑥10×柱体积的Binding Buffer洗涤，至无蛋白检出，用三氯醋酸检测，收集流出液；

⑦Elution Buffer（20mM Tris-HCl,0.5M NaCl,500－1000mM咪唑，pH8.0）洗脱，每次1ml，应呈现正态分布（两边稀，中间浓）；

⑧10×柱体积的Binding Buffer洗涤。此时，即可用于纯化同种蛋白，很少需要重新充电。

⑨用20％的乙醇充满柱子，保存在4℃。

注：同种蛋白纯化5～10次后，应进行strip和re-charge。

C、柱的清洗与保存（最好每天清洗一次）：

（1）去Ni离子：

①5×柱体积的Strip Buffer（20mMTris-HCl,0.5M NaCl,50mM EDTA，pH7.4）洗涤；

②10×柱体积的DDW洗涤。

（2）去沉淀的蛋白质：

①5×柱体积的0.5M NaOH装满柱子，静置0.5～2hr；

②DDW洗涤，至流出液的pH值为7。

（3）保存：20％乙醇洗涤，再加20％乙醇保存于4℃。

D、柱的再生：

当流速很慢、充电后基质不变成蓝绿色时，应进行柱的再生。

① 2×柱体积的6M盐酸胍洗涤，然后3×柱体积的DDW洗涤；

② 1×柱体积的2％SDS洗涤；

③ 5×柱体积的0.5M NaOH装满柱子，静置0.5～2hr；

④ 5×柱体积的DDW洗涤，然后5×柱体积的100mM EDTA，pH8.0洗涤；

⑤ 3×柱体积的DDW洗涤，然后3×柱体积的20％乙醇洗涤；

⑥ 20％乙醇保存于4℃。

【备注】Ni2+亲和层析柱纯化缓冲液（1×Buffer）：

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4. 目的蛋白的SDS-PAGE

分别取加有IPTG的空载体pET22(b+)表达的上清液、未加IPTG和加IPTG诱导的重组子全提取物、超声波破碎后的上清液和沉淀(即包涵体)、纯化后的蛋白溶液，进行12％SDS-PAGE分析。通过蛋白质分子量标准，判断目的蛋白的相对分子质量，并对纯化后的蛋白进行纯度分析。

5、蛋白质的复性

目的蛋白在大肠杆菌中以包含体形式存在，要获得有活性的产物，必须对纯化的目的蛋白进行复性。将收集的洗脱流出液装入透析袋，对含适量甘油的0.01 mol/L PBS pH8.0透析48 h，每4～8 h更换一次PBS溶液。然后，将上述透析袋包埋在聚乙二醇粉末中，对蛋白溶液进行浓缩。

【备注】PBS配方：

配制 0.01 M PH 7.4 PBS 2L：

0.2 mol/L Na2HPO4(mL) 81.0

0.2 mol/L NaH2PO4(mL) 19.0

NaCL 17 g

用水稀释到2 L即可。

另外，可加入下列重折叠（复性）介质：

①氧化还原系统：还原/氧化型谷胱甘肽（10:1～3:1）

②L-Arg或Gly（0.5mol/L）

③甘油：10%

④聚乙二醇（浓缩）

⑤高摩尔浓度的Tris(0.4～1mol/L)

1．学习亲和层析的原理。

2．掌握亲和层析法分离蛋白质的技术与操作。

【实验原理】

亲和层析是以普通凝胶作载体，连接上金属离子制成螯合吸附剂，用于分离纯化蛋白质，这样的方法称为金属螯合亲和层析。蛋白质对金属离子具有亲和力是这种方法的理论依据。已知蛋白质中的组氨酸和半胱氨酸残基在接近中性的水溶液中能与镍或铜离子形成比较稳定的络合物，因此，连接上镍或铜离子的载体凝胶可以选择性地吸附含咪唑基和巯基的肽和蛋白质。过渡金属元素镍在较低pH范围时（pH 6-8），有利于选择性地吸附带咪唑基和巯基的肽和蛋白质，在碱性pH时，使吸附更有效，但选择性降低。金属螯合亲和层析行为在很大程度上，由被吸附的肽和蛋白质分子表面咪唑基和巯基的稠密程度所支配，吲哚基可能也很重要。

本实验室纯化的目的蛋白是用IPTG诱导表达的pGFPuv，该蛋白是和6His融和表达的，含有特定的组氨酸标记物，这种可溶性蛋白质能用金属亲和层析法进行分离，且操作简单，快速，纯化效率高。

【试剂与器材】

〈一〉试剂

1. 0.05mol/L EDTA—0.5mol/L ，NaCL溶液100mL

2. 2mol/L NaCL 溶液 50mL

3. 1mol/L NaOH溶液 50mL

4. 0.2mol/L NiSO4溶液 50mL

5. 平衡缓冲液：50mmol/L Tris-HCL，500mmol/L NaCL，pH7.0 500mL

6. Ni2＋ Chelating Sepharose Fast Flow 5－10 mL

7. 重组pGFPuv质粒大肠杆菌工程菌经诱导表达的细胞裂解蛋白样品 20—50ml

8. 洗涤液：50mmol/L咪唑，50mmol/L Tris-HCL，500mmol/L NaC,pH 7.0

9. 洗脱液：300mmol/L咪唑， 50mmol/L Tris-HCL，500mmol/L NaCL.pH7.0

10 20%乙醇溶液50ml

〈二〉器材

1. 1.5cm X 50cm层析柱

2. 蠕动泵

3. 紫外检测仪

4. 自动收集器

5. 伍豪色谱工作站

【操作方法】

1. 样品的制备

细胞的培养及荧光蛋白表达看实验十，细胞的破碎及蛋白的收集如下：收集在25 ℃用细胞培养液，8000r/min，离心5min，去上清液，菌体用平衡缓冲液洗涤一次，离心收集菌体，用三分之一（细胞培养液）体积的平衡缓冲液充分悬浮，冰浴下进行高压破菌处理。然后8000r/min。离心30min，取上清液。放冰箱备用。

2. 亲和层析柱的安装

把层析柱固定在铁支架上，上端的柱头拧下，柱下端出口用夹子封闭。加入少量的无离子水，排去下端的空气泡。取出20%乙醇浸泡的螯合凝胶5－10mL到烧杯中，加入少量的无离子水制成糊状，沿着贴紧柱内壁的玻璃棒把糊状凝胶倒进柱内，打开下端的排水口，让亲和凝胶剂随水流自然沉下。亲和层析剂为5—10mL。然后，将上端的柱头拧紧，并将顶端和下端用软管连接封闭备用。

3. 层析系统的安装、调试

（1）蠕动泵的调试：打开背后电源开关，按下start按钮，上下箭头调节流速为15rpm（约2ml/min），将软管充满去离子水。

（2）系统的连接：将蠕动泵的出水管与层析柱上端管相连，层析柱的下端管与紫外检测仪的进样端连接，将紫外检测仪的out端与自动收集器相连。

（3）紫外收集器的调试：打开紫外背后开关，调节灵敏度旋钮（ABS－Range），调节调零旋钮。

（4）自动收集器的设置：打开电源开关，按“复位”键，确定出液管的位置，按“手动”按钮，进行设置，如选择120seconds一管进行收集，按“自动”即开始计时收集。

（5）伍豪色谱工作站的使用方法：点击桌面的“伍豪色谱工作站“图标打开程序，点击左上角的图标，选择A或B通道，点击“▲”即开始采样，采样结束后点击“■”即结束采样，然后载入A或B通道谱图，保存结果，并打印结果。

4. 层析柱的使用前处理：

（1）用5X柱床体积去离子水清洗乙醇封存的Ni 2＋-Chelating Sepharose Fast Flow亲和层析柱，去除乙醇

（2）用2X柱床体积的0.2M NiSO4过柱，注意观察现象

（3） 用10X柱床体积的去离子水清洗，用5X柱床体积平衡缓冲液平衡柱子

5. 上样：

先从20 mL裂解上清液中取出50 μL用于电泳，作为亲和层析分离前上清液中的总蛋白区带对照图谱。然后以每分钟2 mL的流速上层析柱，分部收集流出液，每管3 mL（记录的紫外吸收峰为穿流峰，取最高的一管样品液用作电泳）。平衡缓冲液过层析柱，直到紫外吸收峰不再下降（达到平台期为止）。

6. 洗涤：

用含50 mmol/L咪唑的洗涤缓冲液25 mL冼脱，分部收集洗脱液，每管5 mL，取紫外吸收最高的一管用于电泳。

7. 洗脱：

用含300mmol/L咪唑的洗脱缓冲液10 mL洗脱，自动收集洗脱液。每管收5 mL，当紫外吸收达最高峰时取样用于电泳及Western blotting实验。

8. 层析柱的后处理及封存：

（1）用2X去离子水清洗柱子

（2）用10X0.5M NaCl，50mM EDTA (pH 8.0) 洗去结合的镍离子

（3）用10X去离子水清洗柱子

（4）用10X1M NaOH洗柱，去残留蛋白

（5）用大约10X去离子水清洗柱，去除NaOH，直到pH值低于9

（6）用大约2X柱床体积乙醇过柱，拆除柱子，保存柱料于20％乙醇中

9. 12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测：

分别取50μL穿流峰流出液、50mmol/L咪唑缓冲液洗涤的流出液和300mmol/L咪唑缓冲液洗脱的流出液。外加一个上柱前的样品液和蛋白Marker作比较。进行12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测亲和层析分离纯化的结果。

【注意事项与提示】

1. 不管是装柱还是上样、洗脱，在整个操作过程中，水或溶液面都不能低于凝胶柱平面。否则，凝胶柱会产生气泡，就会影响层析效果。

2. 样品上柱和洗脱过程，其流速都要慢，分离效果才好。

3. 亲和层析剂可回收，经再生可循环使用。该亲和层析剂用20%乙醇浸泡于冰箱保存。

4. 亲和层析柱在再生处理、上样、洗脱过程中其颜色都有明显变化（白、蓝、绿），只要细心操作，样品是否被吸附上去或被洗脱下来？都能观察到从而作出判断。