细菌内毒素检测--血站应用指南

细菌内毒素检测

------血站应用指南 血站应用指南

因专业而崛起， 因专业而崛起，因专注而发展 以信誉赢得尊重， 以信誉赢得尊重，以品质求得市场

厦门市鲎试剂实验厂有限公司

Chinese Horseshoe Crab Reagent Manufactory, CO., Ltd., Xiamen.China

目

录

一 国家标准的要求.................................................................................................................... 1 1 细菌内毒素单位：EU ............................................................................................................ 1 2 细菌内毒素国家标准品.......................................................................................................... 1 3 血站常用检测品种的内毒素限值.......................................................................................... 1 4 检测细菌内毒素的设备.......................................................................................................... 1 5 与细菌内毒素检测有关的国家标准：.................................................................................. 2 二 细菌内毒素检查法所用试剂的基础知识............................................................................ 3 1 细菌内毒素.............................................................................................................................. 3 1.1 细菌内毒素标准品............................................................................................................... 3 1.2 细菌内毒素化学结构(LPS) ................................................................................................. 4 1.3 细菌内毒素在水溶液中的状态：....................................................................................... 4 1.4 细菌内毒素的耐热特性....................................................................................................... 4 2 鲎试剂（TAL） ...................................................................................................................... 5 2.1 细菌内毒素及 1,3-(β,D)-葡聚糖和鲎试剂生化反应原理 ................................................. 5 2.2 鲎试剂的凝胶反应过程观测............................................................................................... 6 3 细菌内毒素检查用水.............................................................................................................. 6 3.1 药典对细菌内毒素检查用水的要求................................................................................... 6 3.2 细菌内毒素检查用水注意事项........................................................................................... 6 4 样本处理剂.............................................................................................................................. 6 三 检测方法................................................................................................................................ 6 1 各类样品的预处理及检测方法.............................................................................................. 6 2 血液保存液内毒素检测实例.................................................................................................. 7 2.1 试验器材及试剂................................................................................................................... 7 2.2 供试品资料........................................................................................................................... 7 2.3 试验方法设计....................................................................................................................... 7 2.4 实验过程............................................................................................................................... 8 2.5 结果分析............................................................................................................................... 8 2.6 注........................................................................................................................................... 8

一 国家标准的要求

1 细菌内毒素单位：EU 细菌内毒素单位： 关于细菌内毒素的量值在 80 年代几乎都是以重量单位来表示,它很不科学， 相同重量 的内毒素，由于菌株来源不同，提取方法各异而且所加附形剂不同，因此其生物活性相 差很大。如 EC-2 和 EC-5，其重量换算单位分别：5EU/ng 和 10EU/ng，以效价单位表示 内毒素的量值是十分合理的。2001 年开始美日欧等国开始执行细菌内毒素检查国际统一 调和案，内毒素单位统一用 EU 表示，各国规定的细菌内毒素检查法（包括中国）基本 一致。 因此 EU 已经成为国际公认的细菌内毒素量值， EU 表示的内毒素相关论文也被世 用 界各国所承认，而以前其他重量单位如 ng，pg 等已经被淘汰。 2 细菌内毒素国家标准品 目前国家标准品批号：200707，效价：10000EU/瓶。中国药品生物制品检定所提供。 3 血站常用检测品种的内毒素限值 表 1 血站常用检测品种的内毒素限值

品种 血液保存液(I) 血液保存液(Ⅱ) 红细胞保存液 输液、输血、注射器具 与脑脊液接触和胸内应用医疗器械 空塑料血袋 一次性使用离心式血浆分离器 血浆管路 一次性使用机用采血器 细菌内毒素限值 小于 5.56EU/ml 小于 5.56EU/ml 小于 5.56EU/ml 不超过 20 EU/件 不超过 2.15 EU/件 不超过 20EU/只 小于 0.5EU/mL（浸提介质

4 检测细菌内毒素的设备 微生物检测仪 ELx808IU 系列超级酶标仪配有高质量、耐用的光学系统，胜任于任 何 380-900nm 之间的比色分析(另有 340-900nm 可选)。独特的 8 检测通道专利光学设计， 可选独特的 4-Zone 温控系统，使其成为动力学分析的理想工具。可在控制面板上实现先 进的读取控制及数据处理， 还可选择 Gen5 软件包或国内其它的中文操作软件， 实现更为

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强大的功能。该设备在国内外内毒素检测领域得到广泛的应用。 5 与细菌内毒素检测有关的国家标准 WS-10001-(HD-0610)-2002 细菌内毒素 取本品，依法检查（中国药典 2000 年版二部附录 XI E） ，每 1ml 中含内毒素的量应 小于 5.56EU。 WS-10001-(HD-0175)-2002 细菌内毒素 取本品，依法检查（中国药典 2000 年版二部附录 XI E） ，每 1ml 中含内毒素的量应 小于 5.56EU。 GB/T 14233.2-2005 细菌内毒素试验 1 供试液的制备： 在无菌条件下， 每套输液器内腔注入 10mL， 输血器内腔注入 15mL 浸提介质，反复荡洗 5 次后两端密封，置 37±1℃恒温箱中保温 2 小时，取出后将供试液 汇集至一无菌、无热原具塞玻璃容器内。供试液储存应不超过 2 小时。 2 供试液制备： 根据产品标准规定的细菌内毒素限值确定浸提介质体积，选用下列 适宜方法制备供试液： 管类和容器类器具用细菌内毒素检查用水浸泡器具内腔，在（37±1）℃恒温箱中浸 提不少于 1 小时。 小型配件或实体类器具置无热原玻璃器皿内，加入细菌内毒素检查用水振摇数次， 在（37±1）℃恒温箱中浸提不少于 1 小时。 供试液储存应不超过 2 小时。

注 1： 浸提介质体积计算公式： V = L / λ 式中： V-----浸提介质体积，单位为毫升（mL） ； L-----产品细菌内毒素限值，单位为细菌内毒素单位每件（ EU / 件） ； λ------所用鲎试剂灵敏度标示值，单位为细菌内毒素单位每毫升（EU / mL） 。 注 2： 输液、输血、注射器具细菌内毒素限值在产品标准中规定，宜尽可能低。推荐输液、输 血、注射器具细菌内毒素限量每件不超过 20 EU，与脑脊液接触和胸内应用医疗器械每件不超过 2.15 EU。

血液保存液(I) 血液保存液

血液保存液( 血液保存液 Ⅱ)

医用输液、输血、注射器具检验方法 医用输液、输血、注射器具检验方法

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GB 15810-2001 细菌内毒素试验

一次性使用无菌注射器

取至少 3 支注射器，抽取无热原水或 0.9%的氯化钠注射液至总刻度容量，将芯杆拉 回到外套开口处，液体来回振洗两次，封闭在 37℃±2℃恒温箱中，保持 2 小时，取出后 将注射器内的试液汇聚在无热原的玻璃器皿中，供试液储存不得超过 2 小时。 GB 15811-2001 一次性使用无菌注射针

将 25 支注射针浸入 250mL 无菌、无热原的 0.9%氯化钠溶液中，在 37℃±3℃温度下 恒温 1 小时，取出注射针获得供试液，供试液的储存不得超过 2 小时。 YY 0326.1-2002 细菌内毒素 按 GB/T 14233.2 试验时，每只分离杯注入浸提介质不超过 100ml(40ml)，细菌内毒 素含量应小于 0.5EU/mL。 YY 0326.2-2002 细菌内毒素 按 GB/T 14233.2 试验时，每套管路注入浸提介质不超过 50ml(40ml)，细菌内毒素含 量应小于 0.5EU/mL。 YY 0328-2002 细菌内毒素 按 GB/T 14233.2 试验时，每套采血器注入浸提介质不超过 10ml，细菌内毒素含量应 小于 0.5EU/mL 一次性使用机用采血器 一次性使用离心式血浆分离器 一次性使用离心式血浆分离器

细菌内毒素检查法所用试剂的基础知识 二 细菌内毒素检查法所用试剂的基础知识

1 细菌内毒素 1.1 细菌内毒素标准品 （1）细菌内毒素国家标准品（RSE ） 批号： 200707 效价：10000EU

（2）细菌内毒素工作标准品（CSE ） 细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价。

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1.2 细菌内毒素化学结构(LPS)

图 1 革兰氏阴性菌细胞壁结构 ①O-特异性多糖链(亲水端) ② 核心多糖 ③ 类脂 A（生理活性中心）(疏水端)

1.3 细菌内毒素在水溶液中的状态

图 2 细菌内毒素在水溶液中的状态 （注：细菌内毒素很容易吸附在容器壁上或聚集在一起，所以在溶解时要充分混匀）

细菌内毒素很容易吸附在容器壁上或聚集在一起，2005 版中国药典明确注明：细菌 内毒素溶液要混旋 15min 和 30s，以充分混匀。 1.4 细菌内毒素的耐热特性 由于细菌内毒素要在高温 250℃ 30 分钟才能完全灭活，所以在制药工业和一次性医 疗器械及血袋等生产工艺中都是让人头疼的问题，检测使用的各种玻璃器材均应严格清 除内毒素后才能使用，我们提供的成品试验器材要经过 7 道严格工序才达到要求。

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2 鲎试剂（TAL） 鲎试剂（ ）

图 3 海洋节肢动物——鲎

图 4 鲎血提取得生物制剂——鲎试剂

2.1 细菌内毒素及 1,3-(β,D)-葡聚糖和鲎试剂生化反应原理

革兰氏阴性菌死亡 真菌等代谢产生

细菌内毒素（LPS）

1,3-(β,D)-葡聚糖

C 因子被活化为活化 C 因子

G 因子被活化为活化 G 因子

B 因子被活化为活化 B 因子

凝固酶原产生凝固酶

凝固蛋白原产生凝固蛋白（凝胶） 图 5 细菌内毒素及 1,3-(β,D)-葡聚糖和鲎试剂生化反应原理

鲎试剂有两条反应通路，可检测革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素和真菌产生的 1,3-(β,D)-葡聚糖，即可以间接检测革兰氏阴性菌和真菌的存在，目前试剂厂家可以提供 分别针对于这两种物质的特异性鲎试剂。

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2.2 鲎试剂的凝胶反应过程观测

吸光度 A

时间（秒）

图 6 鲎试剂的凝胶反应过程观测

3 细菌内毒素检查用水 3.1 药典对细菌内毒素检查用水的要求 凝胶法中的内毒素含量小于 0.015Eu/ml。 定量法中的内毒素含量小于 0.005Eu/ml。 3.2 细菌内毒素检查用水注意事项 使用和鲎试剂同一个厂家的细菌内毒素检查用水。 4 样本处理剂 由于一些样本对鲎试剂的反应有一定的干扰， 需要经过样本的前处理才能正常检测， 常用的处理剂有：血液前处理液、钙离子调节剂、缓冲液、PH 调节液等，试剂厂家已经 根据不同的样本将试剂盒配套好，并且配好了符合国家标准的标准操作规范。

三 检测方法

1 各类样品的预处理及检测方法

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表 2 各类样品的预处理及检测方法 样本 样本前处理方法 检测方法 限值

血液保存液(I) 取处理好 血液保存液(Ⅱ) 取样品 0.1ml 到血液保存液处理液中，摇匀即可 血液保存液(Ⅲ) 的 样 本 0.1ml 加入 到 96 孔板 中， 再加入 0.1ml 反应 空塑料血袋 注入浸提介质（细菌内毒素检查用水）40ml 主剂鲎试 剂中， 放入 将 25 支注射针浸入 250ml 无菌、 无热原的 0.9%氯化 一次性使用无 钠溶液中，在 37℃±3℃温度下恒温 1 小时，取出注 菌注射针 射针获得供试液，供试液的储存不得超过 2 小时 仪器进行 检测

5.56EU/ml

5.56EU/ml

5.56EU/ml

红细胞保存液

5.56EU/ml

20 EU/件

20 EU/件

2 血液保存液内毒素检测实例 2.1 试验器材及试剂 检测仪器：厦门市鲎试剂实验厂有限公司，微生物检测仪 ELx808（配套 IU） 内毒素检测鲎试剂盒（动态浊度法）标准品：厦门市鲎试剂实验厂有限公司，细菌 内毒素工作标准品效价：10EU/支 血液保存液内毒素检测鲎试剂盒（动态浊度法）：厦门市鲎试剂实验厂有限公司， 批号：100603 2.2 供试品资料 供试品：血液保存液 I 内毒素限值：L =5.56EU/ml 标准曲线线性范围的选择：10EU/ml—0.1EU/ml,λ = 0.1EU/ml 最大稀释倍数:MVD = L×C/λ = 5. 56/0.1=55.6（倍） 2.3 试验方法设计 试验概述：做 10，1，0.1 三个点标准曲线，做样品 10 倍稀释液的内毒素检测。在符 合药典回收率规定前提下（50—200%），测定出样品中细菌内毒素含量。

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2.4 实验过程 A） 供试品溶液准备： 取 0.1ml 血液保存液样品加入到 0.9ml/支的血液保存液处理剂中，混匀后，即为供试 品溶液。 B） 标准曲线制作： 取效价为 10EU 的细菌内毒素工作标准品 1 支，开启，加入 1ml 细菌内毒素检查用 水溶解，然后用封口膜封闭瓶口，在混旋器上混合 3 分钟，混旋后得到 10EU/ml 的内毒 素工作标准品溶液。如下稀释： 0.1ml 10EU/ml 0.9ml 1EU/ml 0.1ml 0.9ml

0.1EU/ml

注：箭头上方为所取前一浓度溶液量，下方为所取检查用水的量

C）供试品阳性对照液的操作： 10 倍血液保存液 I 阳性对照液：取 450µl 10 倍稀释血液保存液 I 样品 + 50µl 含内毒 素 10EU/ml 的工作品= 0.5ml 含内毒素工作品 1EU/ml 的 10 倍样品 D）加样： 开启鲎试剂，加入 0.2ml 浓度为 10、1、0.1EU/ml 标准品溶液、阴性对照液、供试品 溶液及供试品阳性对照液，轻轻振摇，待鲎试剂溶解后，移取 0.1ml 到微板中。将微板 放置于鲎试仪中反应。

注：阴性对照液即为细菌内毒素检查用水。

2.5 结果分析 标准曲线：|r|=0.9995>0.98 ，符合要求； 阴性对照：反应时间远大于标准曲线最低浓度所用反应时间，阴性合格； 回收率和样品：样品回收率 104%,内毒素含量小于限值，样品合格。 2.6 注 2010 年版中国药典附录《细菌内毒素检查法》中特别强调：为确保所选择的处理 年版中国药典附录《细菌内毒素检查法》中特别强调： 方法能有效的排除干扰且不会使内毒素失去活性 ， 要使用预先添加了标准内毒素 之间， 再经过处理的供试品溶液进行干扰试验 。 当内毒素的回收率在 50%-200%之间 ， 之间 则认为在此试验条件下供试品溶液不存在干扰作用 。 一个完整的细菌内毒素定量检测实验由四部分组成：阴性对照、阳性对照、

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样品、样品阳性，当阴性对照合格，根据阳性对照和样品阳性检测值计算得出的回收率在50%-200%之间时，样品的检测值是有效的。

厦门市鲎试剂实验厂有限公司

2011年血站应用产品清单

微生物检测系统Elx808（配套IU ）

品名

规格 标准配置：

（1）Elx808(IU)主机（含5个波长滤光片：340、405、450、540、630nm ） （2）专业检测软件TALgent

微生物检测系统（细菌内毒

（3）干热恒温仪

素检测，真菌β-葡聚糖检测）

（4）漩涡混匀器

（5）可调移液器两只：A ．100-1000μl B．20-200μl （6）不含电脑，用户另购

产品类别：产品类别：内毒素检验试剂

品名

血液保存液专用内毒素检测鲎试剂盒（动态浊度法） 血站专用内毒素检测鲎试剂盒（动态浊度法）

规格 20测试/盒 20测试/盒

产品类别：产品类别：除热原除葡聚糖实验耗材除热原除葡聚糖实验耗材

产品名称

除热原试管，5支/包 除热原采样瓶

除热原96孔微板（可拆式） 除热原96孔微板（带盖） 除热原吸头（200ul） 除热原吸头（200ul） 除热原吸头（1000ul） 除热原吸头（1000ul） 有机玻璃试管架

规格 10×75mm 10ml/瓶 8孔×12条 96孔/个 5支/包 96支/盒 4支/包 96支/盒