细胞凋亡信号转导途径及调控的研究进展

细胞凋亡信号转导途径及其调控的研究

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学号： 基础兽医学 药理毒理学 ma cai hui 13203023

细胞凋亡信号转导途径及其调控的研究进展

摘要 目的：为了研究抗肿瘤药物促使细胞凋亡的作用机理，探讨细胞凋亡的信号转导途径以及相关基因对其的调控。方法：查阅近年的国内外相关文献，归纳整理细胞凋亡的信号转导途径和相关的调控基因。结果：介绍了细胞凋亡存在三条主要通路：线粒体通路、内质网通路和死亡受体通路，各通路间互相联系，共同调节细胞凋亡。以及调控凋亡的主要基因，Bcl-2、p53、c-myc、P16、Rb。结论：研究抗肿瘤药物的作用机理应从以上三条凋亡途径和相关调控基因出发。

关键词 细胞凋亡；信号转导途径；基因调控；caspase

Progress study on signal transmission pathways and

regulation of cell apoptosis

Wang Saiqi

School of Pharmaceutical Sciences, Zhengzhou University, Zhengzhou, 450001

Key words : cell apoptosis; signal transmission pathways; gene regulation; caspase

Abstract Aim : To check the mechanism of apoptosis induced by anticarcinogen and research the cell apoptosis signal transmission pathways and related genes on its regulation. Methods: Signal transmission pathways and related genes were concluded by referring to related papers at home and abroad in recent years. Results: Three main signal transmission pathways, death receptor-mediated pathways, mitochondrial pathway, endoplasmic reticulum pathway and several main regulator genes,Bcl-2,p53, c-myc,P16,Rb were introduced. Conclusions: Research on the mechanism of anticarcinogen should start from the said signal transmission pathways and genes. 1 细胞凋亡概述

细胞凋亡，又名细胞程序性死亡，是诱导性的细胞自杀过程，它使生物体可以有序地清除受损伤或无用的细胞。自从1927年John Kerr第一次提出凋亡这一概念后，人们发现它在多细胞生物的基本生命活动中起着十分重要的作用。它对于

生物发育过程中控制细胞数量平衡必不可少。由于这种死亡是由基因调控引发的，因此也被称为程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD)。目前大多数人认为，肿瘤是一种细胞凋亡过少而增殖过多的疾，病若能抑制肿瘤细胞的增殖并诱导其凋亡，肿瘤细胞就有可能停止生长[1]。

细胞凋亡时细胞质、细胞核和细胞膜会发生一系列生物化学和物理上的变化。在细胞凋亡早期, 细胞膨胀变圆, 与邻近细胞的联系断绝并且脱离后皱缩。在细胞质中, 内质网肿胀积液形成液泡。在细胞核内, 染色质逐渐凝集成新月状, 附在核膜周边，嗜碱性增强。最终细胞核裂解为由核膜包裹的碎片。在细胞膜上, 细胞结点不再相连, 细胞膜变得更活跃进而发生内陷。这些变化都将导致细胞裂解为由细胞膜包裹细胞内容物的凋亡小体。在生理条件下, 细胞膜上发生特定的调节作用, 这可以使吞噬细胞识别并吞噬凋亡小体。在细胞发生凋亡的过程中不会伴有细胞内容物渗漏和炎症反应。此外, 与细胞凋亡相比, 细胞坏死将导致细胞器的崩解、细胞膜破损，大量细胞内容物渗漏。但在体外培养的细胞中, 坏死的细胞能导致大量细胞凋亡, 这为具有吞噬功能的细胞发挥吞噬功能创造了条件, 这一机制被认为是对缺乏专业吞噬细胞的一种有力补充。在体内, 正在死亡的细 胞( dying cell) 是很难被观察到的, 这是由于凋亡细胞被其邻近的细胞在无任何明显征兆的情况下吞噬和消化。为了保持细胞内环境的稳定, 细胞群落依靠凋亡机制在增殖与消减之间保持着严格的平衡[2]。

2 细胞凋亡的三条主要途径

细胞凋亡的三条主要通路分别是死亡受体介导的凋亡途径或外在途径（dea- th receptor- mediated pathway 或extrinsic pathway)和线粒体凋亡途径或内在途径(mitochondrial pathway 或intrinsic pathway) 以及内质网途径(endoplasmic retucul- um pathway)。虽然三条凋亡通路的上游事件( up- stream activation)不同[3]，但是它们最终都要激活共同的凋亡效应物, 即特异的胱冬酶( caspase)。Caspase属白介素-1β转化酶家族，目前已发现的cspases有14种之多，分别记作Caspase1～14。Caspases在胞质中以不活化的前体形式存在，大多通过蛋白裂解得化。Caspase-8、caspase-9、caspase-3位于凋亡通路上的3个关键因素。Caspase-8对来自细胞外的凋亡诱导因子的刺激作出应答，以启动细胞解体。Caspase-9对各种药物和损伤引起的刺激作出应答,启动细胞色素C从线粒体中释放，并与dATP、凋亡蛋白酶

活化因子1和细胞色素C一起形成复合物,以启动细胞解体。Caspase-3能放大caspa- se-8和caspase-9的信号，引起细胞全面自杀性解体。Caspase-8、caspase-9都可以通过蛋白水解片断活化caspase-3，而caspase-3则反过来使细胞内许多重要的蛋白质(包括其余的caspase成分)水解而得以活化。聚ADP核糖聚合酶是细胞凋亡中第1个被鉴定的由caspase3水解的DNA修复相关酶[4]。DNA修复功能的丧失，使基因组的稳定不能维系，从而间接促使细胞凋亡。

2.1 死亡受体信号途径

细胞凋亡的死亡受体(death receptor, DR) 途径是一条主要的细胞凋亡途径。细胞表面特定的死亡受体接受胞外的死亡信号而激活细胞内的凋亡机制，从而诱导细胞凋亡[5]。

死亡受体是一类跨膜蛋白，属肿瘤坏死因子(TNF) 受体基因家族成员, 其胞外有一段富含半胱氨酸的区域，胞质区有一段高度同源性的氨基酸残基组成的结构, 有蛋白水解功能，称为“死亡域(death domain ,DD)”。“死亡域”使死亡信号得以进一步传递启动凋亡。肿瘤坏死因子受体(TN F-R s) 是具有代表性的最大的死亡受体家族， 主要包括TNFR1(p 55,CD120a)、TNFR2 (p75,CD120b) 、Fas(CD95, Apo21) 、DR3、DR4(TRAL -R1)和DR5(TRAL -R2)。其中其中最典型的死亡受体有CD95(称Fas或Apo1)和TNFR1(称p55或CD120a) [6]。CD95是一种广泛表达的糖基化的细胞表面分子,含有335个氨基酸残基。CD95的表达细胞因子如干扰素和TNF刺激，并可由淋巴细胞活化，它通过与其天然配基CD95L结合来诱导细胞凋亡。

2.1.1 Fas 介导的凋亡信号转导途径

Fas是一种广泛表达的糖基化的细胞表面分子，含有335个氨基酸残基。Fas 的表达可由细胞因子如干扰素和TN F刺激，并由淋巴细胞活化，通过与其然配基FasL 结合来诱导细胞凋亡。这个过程的发生是因为Fas是一个同源三聚体分子，可诱导Fas三聚体化， 导致Fas分子胞质区位于C末端的死亡结构域(death domain ,DD )与一种具有死亡域的Fas相关蛋白FADD (Fas-associated protein with death d- omain) 结合，FADD通过自身的DD与Fas作用，而其位于N末端的死亡结构域DED (death effector domain )则与caspase-8或caspase-10作用，由于Fas的寡聚化导致了DISC (death-inducing signaling complex) [7]的形成及caspase-8、10的寡聚化。

Caspase-8、10通过自身剪接作用被激活，从而又可使caspase-3和caspase-7 被激活[8]，接下去caspase-3又可激活caspase-6，如此启动caspase 的级联反应，最终导致细胞凋亡。Sun等[9]报道了磷脂酶- D能有效阻止胱冬酶- 3、- 8 前体的剪切活化，这将使外在凋亡通路无法发挥生物学效应， 细胞将不断分裂增殖。

2.1.2 TNFR1 介导的凋亡信号转导途径

TNF-α通过与细胞膜上肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor,TNF- R)结合，实现其细胞毒性、抗病毒、免疫调节等生物学功能。无论是跨膜形式TNF-α前体还是可溶性TNF-α都是以三聚体的形式发挥作用[10]。TNF与TNFR1结合后可激活转录因子NF-κB和AP－1，诱导促炎因子和免疫调节因子的表达。在一些细胞中，TNF也可以通过与TNFR1结合诱导细胞凋亡。但是，与Fas不同的是TNF只有在蛋白合成被阻断的情况下才可以诱导凋亡，表明细胞中预先存在的一些细胞因子，可以抑制TNF产生的凋亡信号。这些抑制蛋白的表达可能是由 NF-κB和JNK／AP-1调控的[11]。

在TNFR1 介导的凋亡通路中， 三聚化的TNFR1可汇聚接头蛋白TRADD (TNFR -associated death domain) ，TRADD 通过自身的DD使FADD汇聚并导致caspase-8前体的寡聚化， 最终导致caspase级联反应来诱导细胞凋亡的发生。Fas不能活化NF-κB，而TNFR1途径中，接头蛋白RIP ( receptor-interacting protein )分子也具有与TRADD相互结合的DD区，一旦TRADD结合的不是FADD而是RIP，便激活了TNFR相关因子（TRAF-2），形成TRADD-RIP-TRAF-2复合物，于是通过磷酸化作用激活NF-κB诱导激酶（NF-κB inducing kinase ,NIK），继而活化I-κB激酶（inhibitor ofκB kinase complex, IKK），I-κB上游激酶IKK活化后，可使I-κB的N端丝氨酸磷酸化，赖氨酸泛素化，继而在26S蛋白酶体作用下，导致I-κB降解从而失去对NF-κB的抑制，NF-κB转位至细胞核发挥激活转录的作用，主要激活一些抗凋亡基因如c-IAP1等的转录，继而通过抑制caspase-8的活化等途径发挥抗凋亡作用[12]。因此TNFR可能参与凋亡及抗凋亡两种截然相反的信号转导途径，但TNFR活化后细胞究竟去向何处，是生存还是死亡则决定于双方信号水平的强弱及时机的不同。

2.1.3 DR3 介导的信号转导途径

DR3(death receptor 3)是一个含有死亡结构域的细胞因子受体, 由于其氨基

酸序列与TNFR1高度同源，与TNFR1类似，DR3可以与连接分子TRADD结合，激活一系列下游信号。DR3还可引起与TNFR1类似的NF-κB激活和细胞凋亡反应,同样与TNFR1类似，DR3通过TRADD、TRAF2和RIP激活NF-κB，也可通过TRAD-

D、FADD和caspase-8诱导细胞凋亡[13]。

2.2 线粒体信号通路

线粒体途径机制的主要过程是细胞凋亡分子细胞色素C、Smac/(Diablo)蛋白、凋亡诱导因子和核酸内切酶从线粒体中释放，然后产生级联反应使细胞凋亡。细胞线粒体细胞色素C及其他凋亡分子的释放，受Bc1-2蛋白家族的调控。其中的促凋亡亚族(Bax)是p53激活转录的产物，可以促进或诱导线粒体凋亡因子的释放从而促进凋亡。在正常情况下这些蛋白定位于细胞的非线粒体组分，一旦细胞受到凋亡因子的诱导，它们就以线粒体作为靶细胞器而向线粒体转位，对凋亡进行调控。线粒体通透孔道(PT)是位于线粒体内外膜之间的多蛋白复合物，包括多种酶，PT通过调节线粒体基质中的Ca2+、酸碱度(pH)和电荷，保证氧化磷酸化道路通畅，对凋亡控制具有重要作用[14]。各种刺激诱导细胞凋亡时，线粒体膜通透性增强，线粒体内的各种蛋白被释放出来，包括细胞色素C。细胞色素C进入细胞质中与凋亡蛋白激活因子Apaf-1及Caspase-9前体形成凋亡小体，在细胞质中存在的脱氧三磷酸腺苷(dATP)的共同作用下，活化caspase-9前体，被激活的caspa- se-9能激活其它的caspase如caspase-3等，caspase-3又激活DNA断裂因子，导致静息状态的核酸内切酶激活，最终引起DNA断裂[15-16]。

此外，Smac/Diabo ( the second mitochondrial-derived activator of caspase) 在细胞凋亡时也被释放出来, 它与细胞色素C 一起释放到胞浆, 通过与LA P s(inh- hibitor of apoptosis)、XIAP作用从而成为线粒体途径的一部分。它本身不能诱发细胞凋亡，只是解除凋亡抑制。

2.3 内质网途径

内质网对细胞凋亡的作用表现在两个方面：一是内质网对Ca2+ 的调控, 二是凋亡酶在内质网上的激活。Ca2+ 是真核细胞内重要的信号转导因子, 它的动态平衡在细胞正常生理活动中起着举足轻重的作用。因此, 作为细胞内重要的钙库, 内质网对胞质中Ca2+ 浓度的精确调控可影响细胞凋亡的发生。大量试验表明, 许多细胞在凋亡早期会出现胞质内Ca2+ 浓度迅速持续的升高[17-18]，相对高浓度

Ca2+一方面可以激活胞质中的钙依赖性蛋白酶,另一方面可以作用于线粒体,影响其通透性的改变，进而促进凋亡。位于内质网上的抑凋亡蛋白Bcl-2则可以调节内质网腔中的游离Ca2+浓度，使胞质中的Ca2+维持在合适的中等浓度水平，从而起到抑制凋亡的作用。研究发现caspase家族中的caspase-12定位于内质网, 当内质网钙离子动态平衡破坏或过多蛋白积聚时内质网可激活caspase-12，活化的caspase-12可进一步剪切caspase-3而参与内质网途径引起的细胞凋亡。 3 凋亡的基因调控

细胞凋亡是在基因的调控下进行的,其相关基因很多,存在着三类与细胞凋亡相关的基因： (1) 促细胞凋亡基因；(2) 抑制细胞凋亡基因；(3) 细胞凋亡过程中表达的基因。据目前研究的结果,调节细胞凋亡的基因主要有以下几种。

3.1 Bcl-2基因家族

Bcl-2(B-cell lymphoma/leukemia-2) 即细胞淋巴瘤/白血病-2基因是研究最早的与凋亡有关的基因，是一种凋亡抑制基因，它可使DNA受损的细胞能长期生存，又称长寿基因，是维持癌细胞无限制生长的主要基因。Bcl-2家族包括Bcl-2、Bax、Bcl-X、Bcl-w、Bak、Bad、A1、NR-13和Mcl-1，其中Bax、Bak、Bcl-Xs是促凋亡因子，其余为抗凋亡因子。Bcl-2对细胞周期无明显影响，而对细胞死亡的干扰有选择性，阻止了细胞死亡的最后途径，包括核苷酸内切酶对DNA的降解。Bax是Bcl-2的一种同源蛋白，最近发现Bax既可以形成同聚体，又可与Bcl-2形成异二聚体(Bcl-2/ Bcl-2、Bcl-2/bax、bax/bax)，通过它们之间的不同比例来调节细胞凋亡[19]。例如，有研究发现去甲斑蝥素（NCTD）作用于Ca9-22和SAS细胞凋亡过程时，分别与Bcl-2、Bcl-xl表达下调有关[20]。

3.2 p53基因

p53基因定位于17p13. 1上，是人类多种恶性肿瘤中突变频率最高的抑癌基因并与细胞凋亡有密切的关系。正常的P53基因，即野生型P53基因(wtP53)与突变型P53基因均参与细胞凋亡的调节，但二者的作用不同，wtP53对凋亡具有促进作用，而突变型P53则对凋亡有抑制作用[21]。故P53基因的功能状态是影响细胞凋亡的主要因素，野生型P53是某些细胞内DNA损伤无法修复时导致细胞凋亡发生的重要调控基因，而突变型P53不仅失去正常的肿瘤抑制基因的作用，而且部分出现癌基因的促进细胞增殖的作用，使突变细胞逃避凋亡途径而发生肿瘤。此

外， Diane等[22]发现，p53通过一种依赖损伤调控的自噬调节剂(damage- regulated autophagy modulator,DRAM) 诱导细胞自我吞噬，并且当只有DRAM发生过表达时会导致最小限度的细胞凋亡，即DRAM是p53介导的细胞凋亡的关键因子。

3.3 c-myc 基因

C-myc基因是细胞凋亡调控中又一个重要的相关基因，其表达产物既可推进细胞周期，促使细胞转化，抑制细胞分化，又可介导细胞凋亡的发生。C-myc诱导的细胞凋亡发生在细胞周期的不同时期，并与细胞的种类、细胞的生长条件以及引起c-myc不当表达的原因等有关，并不为所有类型的细胞凋亡所必需。C-myc原癌基因编码一种DNA结合蛋白，是转录因子，具有双重效应，常与其他细胞凋亡调控蛋白一起对细胞的凋亡起调控作用。通常，c-myc基因表达与其他促癌条件共存时，起促细胞增殖的作用；与其他抑癌条件共存时，就反过来导致细胞走向死亡。蔡辉等[23]观察了c-myc反义寡核苷酸(ASODN)对胃癌MKN-45细胞株的生物学影响。结果显示c-myc基因反义寡核苷酸能明显抑制胃MKN-45细胞增殖、诱导细胞凋亡和下调c-myc蛋白水平。

3.4 P16和Rb基因

P16和Rb也是机体内重要的抑癌基因,P16基因编码的蛋白质是一种肿瘤抑制因子；P16与细胞周期素D竞争结合CDK4，从而特异性抑制CDK4的活性，导致抑癌基因RB的产物对转录因子的抑制作用，阻止细胞从G0期进入G1期，使细胞生长停滞。Rb基因编码的蛋白质Rb蛋白磷酸化修饰对细胞生长、分化起着重要调节作用。GF作用于HepA细胞后,细胞抑癌基因Rb和p16表达显著增强，表明GF对抑癌基因和有激活作用[24]。

4 结语

细胞凋亡是有核细胞死亡的生理性通道,通过凋亡清除不必要的、损伤的或病毒感染的细胞，维持机体内环境的稳定。细胞凋亡的失调被认为在自身免疫性疾病、病毒感染、AIDS、心血管疾病、骨质疏松症、老化、肿瘤形成、神经退行性疾病(帕金森氏病)中发挥重要作用。因此，有关细胞凋亡机制在未来的研究还将进一步深入，所取得的进展将为这些疾病发病机理的阐述提供理论依据，也使通过调节凋亡过程治疗这些疾病成为可能。

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