基于聚集诱导发光的荧光探针法检测植酸和植酸酶

·1150·化学通报2015年第78卷第12期http ：//www．hxtb．org

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研究简报

分子植酸（Phytic acid ）又称为肌醇六磷酸，

结构中含有6个磷酸根负离子。植酸是在谷物和种子成熟过程中自然形成的，植物性食物中约有超过70%的磷以植酸的形式存在。植酸与多种金属离子有很强的配位能力，从而形成配位络合物，会影响金属离子在生物体内的正常生理作用。同时也有一些研究表明，植酸具有降低心脏病发

［1］［2］

病率、防止肾结石生成、降低某些癌症发病

刘磊

（B2014208121）、河北省教育厅项目（Z2013001）和河北科技大学五大平台开放基金项目（2014PT86）资助

2015-06-19收稿，2015-07-13接受

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基于聚集诱导发光的荧光探针法检测植酸和植酸酶

刘磊

1，2*

黄凯

1，3

吕海军

1

王丽丽

1

王彬彬

3

1

陈爱兵

1

于奕峰

1

高子彬

2*

（1河北科技大学化学与制药工程学院河北省药物化工工程技术研究中心

2

石家庄050018；石家庄050041）

河北省药用分子化学重点实验室石家庄050018；河北远征药业有限公司

摘要以4-甲氧基二苯甲酮为原料，合成了四苯乙烯季铵盐化合物4，将其作为荧光探针分子用于植

酸和植酸酶的检测。植酸中含有6个带负电荷的磷酸根离子，在静电引力的作用下，诱导带正电荷的四苯乙烯季铵盐发生聚集，导致荧光增强；向该体系中加入植酸酶后，在植酸酶的催化作用下，植酸被水解，聚集体解聚，荧光明显减弱。从而建立了水相中植酸和植酸酶检测的新方法，实现了对植酸和植酸酶的灵敏检测。

关键词

植酸

植酸酶

聚集诱导发光

四苯乙烯

荧光探针

DOI:10.14159/j.cnki.0441-3776.2015.12.017

Detection of Phytic Acid and Phytase by Fluorescent

Probe Based on AIE Fluorogen

2*3

Liu Lei 1，，Huang Kai 1，，Lv Haijun 1，Wang Lili 1，Wang Binbin 1，

Chen Aibing 1，Yu Yifeng 1，Gao Zibin 2*

（1Hebei ＲesearchCenter of Pharmaceutical and Chemical Engineering ，College of Chemical and Pharmaceutical Engineering ，Hebei University of Science and Technology ，Shijiazhuang 050018；

2

Hebei Key Laboratory of Molecular Chemistry for Drug ，Shijiazhuang 050018；

Yuanzheng Pharmaceutical Co．，LTD ，Shijiazhuang 050041）

3

Hebei

Abstract Quaternary ammonium salt of tetraphenylethylene ，（E ）-N ，N ，N -triethyl-3-（4-（2-（4-methoxy-

phenyl ）-1，2-diphenylvinyl ）phenoxy ）propan-1-aminium bromide was synthesized and used to detect phytic acid and phytase．Negative charged phytic acid can induce the aggregation of positive charged quaternary ammonium salt of tetraphenylethylene ，and the fluorescence emission can be enhanced accordingly．The fluorescence emission was weakened with the deaggregation of the ensemble when phytic acid was hydrolyzed by phytase．A “turn-on ”fluorescence probe of phytic acid and phytase in aqueous solution was established effectively．

Keywords

Phytic acid ，Phytase ，Aggregation-induced-emission ，Tetrapuenylethylene ，Fluorescent probe

植酸对降低环境磷污染也有重率的作用。此外，

要作用，全世界每年使用的磷肥有50%被植物体转化成了植酸。

生物体从环境中摄取的植酸不易被消化吸收，大部分直接被排出体外。植酸酶能够将植酸水解为肌醇和磷酸，从而被生物体吸收。1991年，荷兰

brocades 公司首次在动物饲料中添加植酸的Gist-酶，代替了直接添加无机磷酸盐的传统做法。

38岁，mail ：liulei@hebust．edu．cn 女，博士，副教授，主要从事π功能分子的合成和性能研究工作。E-

国家自然科学基金项目（21102032）、北京分子科学国家实验室开放基金项目（20140120）、河北省自然科学基金项目

鉴于植酸对环境、生物体等的作用，需要对其进行定性和定量检测。传统检测植酸的方法包括核磁共振法、高效液相色谱法、比色法、阴离子交

［3］

换树脂法等，但是这些方法存在着检测方法复杂、处理过程繁琐、需要昂贵仪器设备等缺点，因而建立快速、简便、灵敏的植酸检测方法在工业、医学和科研领域具有重要意义。

荧光探针技术由于操作方法简便、检测灵敏度高、响应时间短等优点在生物/化学检测领域备受关注，是一种蓬勃发展的检测技术。聚集诱导发光（AIE ）化合物由于具有高效的固态发光效率，可以用来实现对生物/化学体系的灵敏检［4］

测。本文首次报道利用具有AIE 性能的四苯乙烯季铵盐化合物作为探针分子检测植酸和植酸酶的新方法。检测原理如图1所示。探针分子侧链上的季铵盐基团带有正电荷，植酸中磷酸根离子带有负电荷，因此植酸可以通过静电引力诱导带有正电荷的探针分子发生聚集，从而使荧光增强；植酸酶水解植酸后，聚集体解聚，荧光减弱

。

酶（百灵威有限公司）；四氢呋喃（天津市永大化

学试剂开发中心）。所有试剂均为市售分析纯级。四氢呋喃用前经金属钠/二苯甲酮回流，蒸馏使用，其他试剂使用前未作进一步纯化处理。

1. 2合成与表征

经4步反应得以4-甲氧基二苯甲酮为原料，到了四苯乙烯季铵盐，合成路线见图式1

。

图式1

Scheme 1

四苯乙烯季铵盐的合成tetraphenylethylene

Synthesis of quaternary ammonium salt of

1. 2. 1（E ）-1，2-1，2-双（4-甲氧基苯基）-二苯乙

［5］

将0. 5g （2. 3mmol ）4-甲氧基二烯（1）的合成

4. 0g （60mmol ）锌粉、2. 20g （6mmol ）苯甲酮、

AlCl 3/TiCl3、50mL 无水四氢呋喃加入装有回流冷凝管、干燥管和温度计的100mL 四口瓶，加热回

流。反应产生的大量氯化氢气体用碱液吸收。24h 后，TLC 监测反应完成。停止加热，冷却至室温，溶液呈墨蓝色。抽滤，滤液旋蒸，硅胶色谱柱分离（V 石油醚∶V 乙酸乙酯=10∶1），真空干燥，得淡黄

1色固体0. 15g ，收率30%。熔点149～153℃；H NMＲ（400MHz ，CDCl 3）δ：7. 10～7. 06（m ，

10H ），6. 93（t ，4H ），6. 64（t ，4H ），3. 74（s ，

图1

荧光探针法检测植酸和植酸酶

Fig．1Detection of phytic acid and phytase by fluorescent probe

δ：158. 0，144. 4，139. 7，136. 5，132. 6，131. 5，127. 8，126. 3，113. 2，55. 2；MS （TOF ）m /z ：392. 1（M +）。1. 2. 2

1，2-（E ）-4-（2-（4-二苯乙烯甲氧基苯基）-［4，6］基）苯酚（2）的合成搅拌下，将氢溴酸（0. 1mL ，1mmol ）缓慢滴入0. 70g （1. 8mmol ）化合物

6H ）；13C NMＲ（101MHz ，CDCl 3）

1

1. 1

实验部分

仪器与试剂

Avance 400-MHz 型核磁共振谱仪（瑞士

Bruker 公司）；Apex IV FTMS 质谱仪（瑞士Bruker 公司）；FTS 135型傅里叶变换红外光谱仪（美国

Ｒad公司）；ＲY-Bio-1G 型熔点仪（天津新天光分2501PC 型紫外-可见析仪器技术有限公司）；UV-光谱分析仪（日本岛津公司）；F97pro 型荧光光谱仪（上海棱光技术有限公司）。

AlCl 3/TiCl3（美国Aldrich 公司）；4-甲氧基二苯甲酮（百灵威有限公司）；氢溴酸（天津市大茂

3-化学试剂厂）；1，二溴丙烷（邹平铭兴化工有限公司）；45%植酸水溶液（百灵威有限公司）；植酸

1的10mL 乙酸溶液中，加热回流4h ，停止反应，溶液冷却至室温。反应液倒入100mL 二氯甲烷，分

液，水相用二氯甲烷（2×100mL ）萃取，合并有机相，依次用饱和NaHCO 3溶液（2×50mL ）、饱和食盐水（50mL ）洗涤，无水Na 2SO 4干燥。旋蒸除去溶剂，固体用二氯甲烷和甲醇重结晶，得白色固体

1

0. 51g ，收率75%，熔点195～199℃；H NMＲ（400MHz ，CDCl 3），10H ），6. 92δ：7. 11～7. 02（m ，～6. 83（m ，4H ），6. 63～6. 59（m ，2H ），6. 54～6. 51（m ，2H ），4. 70（d ，1H ），3. 76（d ，3H ）；13C NMＲ

（101MHz ，CDCl 3）δ：158. 3，154. 0，144. 4，144. 3，139. 7，138. 7，136. 8，136. 5，136. 5，132. 9，132. 7，131. 6，127. 8，127. 7，126. 4，114. 8，114. 7，113. 3，113. 2，55. 3；MS （TOF ）m /z ：378. 1（M +）。1. 2. 3

（E ）-（1-（4-（3-2-（4-溴丙基苯基醚）-甲

［6］

1，2-氧基苯基）-二苯乙烯（3）的合成常温氮

气保护下，0. 75g （2mmol ）化合物2、1. 00g （5mmol ）1，3-二溴丙烷和1. 38g （10mmol ）K 2CO 3反应24h 。倒入50mL 水溶于20mL 无水DMF ，中，三氯甲烷（50mL ×2）萃取。有机相用无水硫酸钠干燥，旋蒸蒸去溶剂，硅胶柱色谱分离（V 石油醚∶V 二氯甲烷=3∶1），得到白色固体产物CDCl 3）0. 60g ，收率为70%。H NMＲ（400MHz ，10H ），6. 98（m ，4H ），6. 68（m ，4H ），δ：7. 10（m ，4. 24（m ，2H ），3. 75（s ，3H ），3. 62（m ，2H ）；156. 0，δ：158. 2，144. 4，144. 2，140. 1，139. 7，137. 6，136. 5，132. 8，132. 6，131. 5，127. 8，127. 7，126. 3，114. 8，114. 7，113. 2，113. 2，67. 7，55. 2，30. 1，29. 6；MS （TOF ）m /z ：498. 1（M +）。1. 2. 4

（E ）-N ，N ，N -3-（4-（2-（4-三乙基-甲氧基苯

1，2-基）-二苯乙烯基）苯氧基（1-丙基）-溴化铵（4）

［7］

1. 38g 的合成将0. 50g （1mmol ）化合物3、（10mmol ）碳酸钾和0. 5mL （5mmol ）三乙胺加入到

无水20mLDMF 中，在氮气保护下，室温反应36h 。反应结束后，乙酸乙酯（20mL ×3）进行萃取，有机相用蒸馏水洗涤，无水硫酸钠干燥。减压除去溶剂，硅胶色谱柱分离（V 乙酸乙酯∶V 甲醇=10∶1），得白色

1固体产物0. 40g ，收率为67%。H NMＲ（400MHz ，

6. 87（m ，CDCl 3）δ：7. 11（m ，6H ），6. 98（m ，4H ），13

1

有空白、植酸、植酸酶的3个10mL 容量瓶中。其中空白容量瓶中待二氯甲烷挥发后直接用蒸馏水

定容至10mL 。标有植酸的容量瓶中，待二氯甲烷挥发后加入0. 1mL 45%的植酸，用蒸馏水定容至10mL 。标有植酸酶的容量瓶中待二氯甲烷挥发后，加入0. 1mL 45%的植酸，同时加入0. 01g 植酸酶，用蒸馏水定容至10mL 。将3个样品超声10min 后测定荧光光谱。激发波长为365nm 。设定F97pro 荧光分光光度计的倍率为1，扫描速度为1000nm /min，激发带宽为10nm ，发射带宽为10nm ，扫描增益为7。

2. 2结果和讨论

化合物4的紫外可见吸收光谱如图2所示，其在365nm 附近有最大吸收

。

C NMＲ（101MHz ，CDCl 3）

图2可见光谱（1×10－4g /mL水溶液）化合物4的紫外-Fig．2

UV-Vis spectra of compound 4in water

（1×10－4g /mL

）

以365nm 为激发波长，测定化合物4的溶

液及加入植酸、植酸酶的溶液的荧光发射光谱，

4H ），6. 71（m ，4H ），3. 94（m ，2H ），3. 73（m ，3H ），3. 04（s ，9H ），1. 70（m ，4H ），1. 44（m ，2H ），1. 30（m ，2H ）；13C NMＲ（101MHz ，CDCl 3）δ：161. 2，

157. 4，144. 2，139. 7，136. 1，136. 0，132. 3，131. 1，128. 4，127. 7，126. 3，114. 1，114. 0，113. 7，113. 6，67. 2，65. 5，56. 0，52. 5，28. 5，22. 0；MS （TOF ）m /z ：599. 2（M +）。

图3

化合物4水相中对植酸及植酸酶的检测

2

2. 1

植酸和植酸酶的检测

实验方法

－4

（c 空=1×10－4g /mL，c 植酸=4. 5×10－3g /mL，

c 植酸酶=1×10－3g /mL，λex =365nm ）

Fig．3

The fluorescence emission spectra of compound 4

（1×10－4g/mL），compound 4with phytic acid （4. 5×10－3g/mL），

compound 4with phytic acid （4. 5×10－3g /mL）and phytase （1×10－3g /mL）in water ，λex =365nm

将化合物4配成浓度为1×10g /mL的水

进行紫外可见光谱测定。溶液，

化合物4溶于二氯甲烷中，配成浓度为1×10－2g /mL的溶液。分别取10μL 该溶液，加入标

结果见图3。从图中可以看出，化合物4在水溶液中荧光很弱。四苯乙烯类化合物具有聚集诱导荧光增强特性，在溶液中，分子处于分散状态，因此发光微弱，符合该类化合物发光特性。494nm 处荧光信号显著增强。但是加入植酸后，

荧光强度与加入植酸前相比增大了8倍（图4）。这是由于化合物4侧链上连有季铵盐基团，带正电荷，而植酸中的6个磷酸根带有负电荷。加入植酸后，在静电作用下，诱使化合物4在植酸分子周围聚集，形成聚集态，从而荧光增强。加入植酸酶后，植酸酶水解植酸，使植酸水解为肌醇和磷酸。肌醇呈电中性，对化合物4不具有静电诱导作用，因而已经形成的聚集

体

发生解聚，化合物分子再次分散到溶液中成单分

子状态，因而荧光强度大幅下降。从强度上看，基本恢复到未加入植酸前的水平。从实验结果可以看出，化合物4溶液中加入植酸以及植酸酶以后，荧光强度变化明显，可以作为检测植酸和植酸酶的荧光探针。

3结论

以4-甲氧基二苯甲酮为原料，合成了具有

AIE 效应的四苯乙烯季铵盐化合物。首次建立了以四苯乙烯季铵盐为荧光探针分子，对植酸和植酸酶进行检测的新方法。植酸的加入使四苯乙烯季铵盐产生聚集，荧光信号明显增强；植酸酶水解植酸后，聚集体解聚，荧光明显减弱，从而实现了对植酸和植酸酶的快速、便捷检测。

参

考

文

献

［1］ＲJ Jariwalla ，ＲSabin ，S Lawson et al．J．Appl．Nutr．，

1990，42（1）：18～28．

［2］ＲJ Jariwalla．Am．J．Clin．Nutr．，1992，56（3），609．［3］I A Vaintraub ，N A Lapteva．Anal．Biochem．，1988，175

（1），227～230．

［4］W Xue ，G Zhang ，D Zhang．Org．Lett．，2010，12（10）：

2274～2277．

［5］H Tong ，Y Hong ，Y Dong et al．J．Phys．Chem．B ，2007，

111，11817～11823．

［6］Q Chen ，D Zhang ，G Zhang et al．Adv．Funct．Mater．

2010，20（19）：3244～3251．

［7］X Gu ，G Zhang ，D Zhang．Analyst ，2012，137（2）：365

～369．

图4化合物4水溶液用于检测植酸、植酸酶的荧光强度对比

（I 494nm ）（c 空=1×10－4g /mL，

c 植酸=4. 5×10－3g /mL，c 植酸酶=1×10－3g /mL）λex =365nm Fig．4

Fluorescent intensity of compound 4（1×10

－3

－4

g /mL），

compound 4with phytic acid （4. 5×10g /mL），compound 4

with phytic acid （4. 5×10－3g /mL）and phytase （1×10－3g /mL）in water at I 494nm ，λex =365nm