微生物壳聚糖酶的研究概况
浙江大学学报(农业与生命科学版) 30(2) :
229~236, 2004
Journal of Zhej iang University (A gr ic. &L ife Sci. )
文章编号:1008-9209(2004) 02-0229-08
微生物壳聚糖酶的研究概况
戴芸, 朱旭芬
(浙江大学生物科学系, 浙江杭州310012)
摘 要:壳聚糖是自然界中最丰富的多糖之一. 壳聚糖酶能够降解壳聚糖生成壳寡糖, 壳寡糖具有多种生物学特性, 用途广泛. 壳聚糖酶主要分布在微生物和一些植物中, 理化性质较稳定. 根据其底物特异性和断裂键的专一性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三类. 根据已测序壳聚糖酶的氨基酸序列相似性, 壳聚糖酶分别属于糖苷水解酶46号、75号和80号. 目前, 只有2种壳聚糖酶的3级结构被测定. 关 键 词:壳聚糖; 壳聚糖酶; 糖苷水解酶; 氨基酸序列中图分类号:Q 556 文献标识码:A
D AI Yun , Z HU Xu -fen (D ep t . of BioSciences , Zhej iang Univ er sity , H angz hou 310012, China ) Progress of research on microbiological chitosanases . Jo ur nal o f Zhejiang U niv ersit y (A g ric. &L ife Sci. ) , 2004, 30(2) :229-236
-1, 4-Abstract :Chit osan is o ne of t he most abundant polysacchar ides in natur e . I t consists o f linked D -g lucosamine (GlcN ) and N -a cet yl- -Dg luco sam ine (G lcN A c) residues. Chitosanases cataly ze the hy-dro ly tic br eaking of its gluco sidic bo nd and pro duce chito san, which ar e widely applied for var io us pur-poses in medicine, agr icult ur e, foo d a nd industr y. Chito sanases fo und in micro or ga nisms and som e plants have stable phy sical and chemical pro per ties . T hey ar e classified into three subclasses based o n t he substra te specificit y and the cleav age positions o f the par tially acetylated chit osan. A cco rding to t he a mino acid alig nment , mo st sequenced chit osanases belong to thr ee-g ly co side hydro lase f amilies desig-nated as number 46, 75and 80. T he thr ee dimensional str uct ur es hav e been deter mined only for t he chit osanases fr om S trep tom y cse sp . N 174and Bacillus circulans M H -K 1. Key words :chito san; chiot sanase; glycoside hydr olase; amino acid a lig nment
壳聚糖(chito san) 是一种阳离子型多糖, 天然存在于接合菌、半知菌等真菌的细胞壁中, 也可由几丁质部分或完全脱乙酰化获得. 几丁质(chitin) 是由D-N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNA c)
通过 -1, 4-糖苷键连接而成的线性长链多糖, 广泛存在于虾、蟹壳中. 几丁质与壳聚糖主要区别是D -氨基葡萄糖残基(GlcN ) 乙酰化程度不同, 一般认为乙酰化程度在70%以上是几丁
收稿日期:2002-09-23
基金项目:浙江省海洋局基金资助项目.
作者简介:戴芸(1975—) , 女, 安徽宣城人, 硕士研究生, 主要从事微生物分子生物学研究. E-mail:yundai75@yhaoo. com. cn.
:, 女, 副教授, 事分子微物学教究. T mail:ufen @j.
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质, 乙酰化程度小于30%称为壳聚糖. 几丁质与壳聚糖都是自然界中最丰富的多糖之一, 在食品、医药、化妆品和农业等方面都有广泛且重要的应用价值.
催化几丁质降解的糖类水解酶称为几丁质酶(chitinase , EC . 3. 2. 1. 14) , 几丁质经几丁质酶降解后生成几丁寡糖; 催化壳聚糖降解的酶称为壳聚糖酶(chitosanase, EC. 3. 2. 1. 132) , 壳聚糖经壳聚糖酶降解后生成低分子量的壳寡糖, 壳聚糖酶在降解壳聚糖多聚物、大规模生产壳寡糖中发挥着重要作用.
分子量/
k D 27A 76B 58
R hod otorula g racilis P enicillium island icum P enicillium sp inulosum B acillus R4
B acillus sp . No . 7-M B . amy loliquef aciens UT K B acter ium sp. K-1S tr e p tomyc es sp. No. 6S tr e p tomyc es g riseus My xobacte r sp . AL -1R hod otorula g racilis A sp er gillus sp. Y2K A sp er gillus f umig atus KH94M atsu ebacter chitosanotabid us 3001P suedomanas sp. H-14B urkholid ia gladioli CHB101
ND
31*[1**********]8. 9100*2522. 51083435Ⅰ:37Ⅱ:30A :28
B acilus subtilis KH 1B acillus cereus S 1N ocar dia orientalis E nter obacter sp. G-1B acillus ehimensis EAG1A . oryz ae IAM 2660B acillus sp . KFB -C 108B acillus sp. CK4B acillus circulans W L-12T ric hod erma reesei PC-3-7
2845265031*4048304093
NA 诱导型诱导型NA NA NA NA 诱导型诱导型
5~7. 57. 067. 0NA NA 6. 5NA 9. 54. 0
诱导型诱导型组成型
100*30
组成型NA 组成型诱导型组成型
4. 55. 05. 66. 0NA
诱导型4. 5~6. 0
[2]
[1]
1 壳聚糖酶的分布与性质
壳聚糖酶分布广泛, 到目前为止, 已从多种微生物包括细菌(Bacillus 、My x obacter 、Enter -obacter ) , 放线菌(Str ep tomy ces 、N ocar dioid es ) , 霉菌(Asp ergillus 、Penicillium ) , 病毒(Chlorella v irus PBCV-1、CVK-2) 和植物组织中检测到壳聚糖酶. 各种壳聚糖酶的具体理化性质详见表1[2~21].
表1 各类壳聚糖酶的性质
T able 1 Ch itos anases properties 产酶方式诱导型组成型
最适pH 5. 35. 0
最适温度[**************]0NA [1**********]5~7070~8030~4030Ⅰ:65Ⅱ:50A:5550605050NA NA 55NA NA 50
8. 3NA 4. 05. 5NA NA NA NA NA NA
-1, 3-葡聚糖胶体几丁质、乙二醇几丁质
羧甲基纤维素
[**************]4
等电点
pI 8. 84. 94. 7ND 4. 2ND 8. 30ND 10. 1ND ND 9. 7ND ND 8. 47. 38. 49. 610. 1NA
Ⅱ:乙二醇几丁质乙二醇壳聚糖
445
羧甲基纤维素羧甲基纤维素羧甲基纤维素羧甲基纤维素
[1**********]33
胶体几丁质除壳聚糖外的其他
底物特异性
来 源
A myc olatopsis sp. CsO-2M uc or rouxii
参考文献
22
诱导型5. 5~6. 9诱导型4. 5~6. 5诱导型组成型NA NA
8. 04. 56. 55. 54. 04. 05~9
组成型5. 0~6. 8
4. 5~5. 550~60
诱导型5. 0~6. 0
第2期 戴芸, 朱旭芬:微生物壳聚糖酶的研究概况
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续表1 各类壳聚糖酶的性质
Continuation of Table 1 Chitosanas es pr operties
来 源
B acillus sp . PI -7S B acillus megaterium P1 F usar ium solani
B acillus circulans M H-K1Chlor ella v ir us PBCV -1Chlor ella v ir us CVK2S tr e p tomyc es sp. N174B acillus subtilis
分子量/
k D
432343, 39. 536323737, 29. 429. 531. 5
组成型4. 5~6. 0诱导型NA NA 诱导型NA
6. 55~8NA 5. 55. 7
405050NA 6560
NA 7. 5NA ND 9. 2
产酶方式NA
最适pH 5. 0
最适温度3750
等电点pI ND ND
羧甲基纤维素几丁质
乙二醇几丁质、羧甲基纤维素
[1**********]1
除壳聚糖外的其他
底物特异性
参考文献
1516
诱导型4. 5~6. 5
注:*表示GF(凝胶过滤) 法获得分子量, NA 表示无法获得确切资料, ND 表示未确定.
1. 1 分子量
壳聚糖酶的分子量一般都在23~50kD 之间, 相对低于几丁质酶的分子量(31~115kD) . 但也存在少数高分子量的壳聚糖酶, 如曲霉A sp er gillus f umigatus KH -94有2种壳聚糖酶, 其中一种酶的分子量高达108kD [3].
1. 2 等电点与最适pH
壳聚糖酶多数为碱性蛋白, 等电点pI 变化范围比较大, 在4. 0~10. 1之间. 来源于各类微生物的壳聚糖酶其最适pH 范围一般在4. 0~8. 0之间, Bacillus circulans WL -12的壳聚糖酶的最适pH 为9. 5[4].
1. 3 酶的最适反应温度与稳定性
大多数微生物的壳聚糖酶具有较好的热稳定性, 最适反应温度在30~60℃之间. Bacillus sp . str ain CK 4的壳聚糖酶的耐热性很高, 60℃处理30m in 仍然能保持全部酶活性, 80℃处理30min 和60m in 后剩余酶活分别为85%、66%, 只有在90℃处理60m in 后酶才完全失活[12]. 从Bacillus sp . KFB -C 108纯化的壳聚糖酶其最适温度为55℃, 80℃热处理10min 或70℃热处理30min 酶活仍然保持稳定; 而且酶稳定性也比较强, 用螯合剂、烷化剂和各种金属离子处理对酶活都没有影响, 只有Co 离子抑制酶的活性.
1. 4 壳聚糖酶的催化性质
来源于不同微生物的壳聚糖酶对不同脱乙[12]
2+
聚糖、羧甲基纤维素和羟乙基壳聚糖) 有不同特异性, 但是一般不能降解胶体几丁质和纤维素. B . subtilis KH1壳聚糖酶则对氨基葡萄糖寡聚体(2~6聚体) 具有糖基转移酶活性. B .
-circulans WL -12产生的壳聚糖酶同时具有 1, 3-1, 4-葡聚糖酶活性, 酶的主要底物是壳聚糖和 -1, 3-1, 4-葡聚糖, 而且对2种底物具有相似的催化效率, 这种广泛的底物特异性有助于B . cir culans WL-12充分降解和利用真菌的细胞壁成份[13].
大部分壳聚糖酶属于内切酶, 降解壳聚糖生成壳二糖、壳三糖等寡聚体的混合物, 反应速度很大程度上依赖于壳聚糖的乙酰化程度. 在放线菌N ocardia orientalis 和真菌Trichoder -ma reesei PC -3-7中分离纯化了外切型壳聚糖酶. A . f umigatus KH94的2种壳聚糖能
2+
被M n 2+激活, 而被Cu 2+、Hg 抑制, 壳聚糖酶Ⅰ具有内切酶活性, 能水解壳聚糖生成壳二糖; 而壳聚糖酶Ⅱ则具有外切酶活性, 能水解壳聚糖生成氨基葡萄糖; 另外, 当反应初始底物中壳聚糖含量高过2%时, 壳聚糖酶Ⅱ还具有糖基转移酶活性[3]. 1. 5 壳聚糖酶的分类
由于壳聚糖酶和其他水解酶(如几丁质酶、溶菌酶、胞外N-乙酰 -D-氨基葡萄糖酶、胞外 -D 葡萄糖酶) 区分模糊, 根据酶的底物特异性把壳聚糖酶分为3类(表2). Ⅰ类酶的产物是杂合寡糖, 糖的还原末端为GlcNAc , Ⅱ类酶不, [6, 14]
[6]
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糖, 其还原末端为GlcN. 所有研究过的壳聚糖酶有一个共同性质就是要求糖苷键的一侧至少
有一个GlcN 残基, 而不能催化GlcNAc-[22]
GlcNAc 键的断裂.
表2 壳聚糖酶的分类
T able 2 S ubstrate specificity of ch itos an as es
酶类ⅠⅡⅢ
断裂的键
GlcNAc -GlcN 键; GlcN -GlcN 键GlcN-GlcN 键
GlcN-GlcNAc 键; GlcN -GlcN 键
代表菌
B . pumilus BN -262、Strep tomy ces s p . N 174、P . islandicum B acillus sp. No 7-M
S . g riseus 、B . cir culans M H -K1、N . orientalis 、B . circ ulans WL -12、B acillus sp. strain CK4、B . su btilis
2 壳聚糖酶的分子生物学特性
O -糖苷水解酶(O -Gly coside hydro lases, EC 3. 2. 1-) 是一组广泛的催化2个或多个糖分
子、或者一个糖分子与另一个非糖分子之间糖
苷键的酶. 由于酶的氨基酸顺序与分子折叠相
似性之间有直接的联系, 根据酶的氨基酸序列的相似性, 糖苷水解酶分成不同的家族(除去不能分类的) , 共有87个. 根据已知的壳聚糖酶氨基酸序列, 壳聚糖酶分属其中的4类(表3) :46、75、80和8号[21, 23].
表3 壳聚糖酶的分子生物学特性
T able 3 M olecular characteris tics of ch itos an as
es
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2. 1 糖苷水解酶族46号
链霉菌S trep tomy ces sp . N 174壳聚糖酶基因的启动子序列与一个反向重复序列部分重叠, 反向重叠序列可能是链霉菌调节蛋白的识别位点. 壳聚糖酶原信号肽区段分3个区:n 区、h 区和v 区, n 区由N 端的9个氨基酸组成, 其中2个氨基酸带有正电荷, n 区后面是h 区(疏水核心区) 和v 区(恒定区) .
目前, B . circulans M H -K 1和Strep to -myces sp. N174的壳聚糖酶3级结构已被测定, S trep tomyces sp. N174的壳聚糖酶3级结构与细菌噬菌体T 4溶菌酶的3级结构相似. 虽然B . cir culans MH -K 1和S trep tomy ces sp .
N1742种壳聚糖酶在氨基酸序列上有20%的相似性, 但总的分子构像相似, 两者分子结构有3个显著差别: 在M H -K 1壳聚糖酶的N 末端有2个额外的 螺旋, 共16个氨基酸残基, 长于N174的壳聚糖酶; M H-K1壳聚糖酶上区域的顶部 6螺旋后有2个 折叠片, 而在5螺旋; 2个N 174的壳聚糖酶中仅有1个
壳聚糖酶的C 末端的二级结构完全不同, MH -K1壳聚糖酶的C 末端是 螺旋结构, 而N174壳聚糖酶的C 末端则是2个 折叠片. 另外, 在M H-K1壳聚糖酶中Cys50和Cys124形成1个二硫键连接 1折叠片和 7螺旋, 而这2个Cys 在其他壳聚糖酶中不是保守的. 通过定点诱变发现S trep tomyces sp . N 174壳聚糖酶的催化位点是N 端的2个保守氨基酸Glu62和Asp80, 从晶体学和定点突变可以推断出当酶作用于位于催化位点的糖残基的C -1位碳时, Glu 62的作用相当于1个质子供体, 而Asp 80残基作用则是激活水分子; 而B . circulans
[21]
M H-K1壳聚糖酶的催化位点则是Glu79和A sp 97, Glu 79位于中心螺旋, 其作用相当于1个普通的酸, 是质子供体, 而位于连接 1和 2的 折叠片上的Asp97作用是极化进行攻击的水分子. 通过比较2个酶的3级结构可以得知, 虽然B . circulans MH -K 1和Str ep tomy ces
sp. N174壳聚糖酶都同属于糖苷酶46号, 但由于这2个酶的活性位点结构不同和主链取向不同, 因而能识别不同的底物, 催化不同的 -1, 4-糖苷键, 降解不同类型的壳聚糖[18].
N ocar dioides sp. N106成熟的壳聚糖酶是2种多肽混合物, 这2种多肽只有N 端的1个氨基酸不同, 84%的分子N 端是AAVGLDDPHK KDIAMQ , 16%是AV GLDDPHKKDIAM Q, N 端少1个氨基酸. 在启动子和核糖体结合部位RBS 之间存在一反向重复序列, 与Str ep tomy ces sp. N174的壳聚糖酶基因编码序列上游的反向重复序列相当同源, 相似的顺序可能调节转录的启始. N ocardioides sp . N 106的N 端具有一些典型特征:N 区有9个氨基酸, 其中3个带正电荷, 随后的H 区(疏水核心区) 有10个氨基酸, 以及一个相当长的C 区(恒定区) . 比较B . ehimensis EAG 1、Bur . gladiolis CHB101、B . cir culans M H-K1、N ocardioides sp. N106、Str ep tomy ces sp. N 1745种壳聚糖酶的氨基酸顺序, 可以发现这5个壳聚糖酶的N 端氨基酸序列具有较明显的同源性, 糖苷酶水解酶46号家族有一共同模式GLD-x (6) -I-x (0, 1) -M -x -L-x (4) -E-x (3) -L-x -W-x (3) -Y-x -Y -x -E -D -I -x -D -x -R -G -Y -T -x -G -x (2) -G -x (3) -G (图1) , 这一模式中包含壳聚糖酶催化活性所必需的氨基酸
.
[24]
1-B acillus ehimenisis EAG1; 2-B urkholder ia gladioli CHB101; 3-Bacillus circulans M H-K1; 4-N ocard ioide s sp. N106; 5-Strep tomy ces s p. N 174; 6-Chlorella virus PBCV-1.
图1 46号壳聚糖酶的推测酶活性域氨基酸序列比较
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Bacillus sp. strain CK4的耐热壳聚糖酶的氨基酸序列与B . subtilis 有76. 6%的相似性, 壳聚糖酶编码区G+C 含量为52. 6mo l%, 高于B . subtilis 壳聚糖酶基因G +C 含量(44. 8m ol %) ; 而且密码子第3位(摇摆位置) 的碱基选择更倾向于G 或C :此位置G +C 含量为66. 4mol%, B . subtilis 在此位置G+C 含量42. 6mol%.DNA 序列中特别是每个密码子摇摆位置碱基由A 、T 变为G 、C , 被认为是酶能在高温下保持稳定的机制之一[12]. Chlorella virus CVK2的单拷贝基因vCh-ta -1由于下游基因ORF 245的通读造成基因的双重表达, 编码2种分子量的蛋白质:37kD 、65kD. 其中分子量为37kD 的壳聚糖酶N 部分的氨基酸序列与细菌壳聚糖酶的氨基酸序列也具有22%~25%的相似性, 而65kD 的蛋白质则是由于ORF245所编码的29. 4kD 的多肽与37kD 的Vchta-1蛋白质组合产生的. 这2种壳聚糖酶在病毒感染过程中发挥不同的作用:分子量为65kD 的壳聚糖酶装配入病毒, 在感染的前期发挥作用; 分子量小于37kD 的壳聚糖酶则留在宿主细胞质, 在病毒裂解前帮助降解宿主细胞壁[19]. Chlor ella virus PBCV -1是一种大的多角dsDNA 病毒, 编码2个几丁质酶基因a181/182r 、a260r 和1个壳聚糖酶基因a292l. 根据a292l 的可读框(ORF) 推测出的壳聚糖酶氨基酸顺序与Chlorella virus CVK 2具
有97%的相似性, 与各种细菌壳聚糖酶的氨基酸顺序有28%~29%的相似性[20]. 2. 2 糖苷水解酶族75号
真菌A . ory z ae IAM 2660、F usarium solani (现名为N ectr ia haematoco ) 的壳聚糖酶基因碱基序列与来自A . f umigatus KH 94和昆虫病原真菌Metarhiz ium anisop liae 、球孢白僵菌B eauveria bassiana 的壳聚糖酶相似, 5种酶同属于糖苷水解酶家族75号, 它们彼此之间显著同源, 但与46号没有同源性, 说明真菌壳聚糖酶在进化起源上与细菌壳聚糖酶不同. A . ory z ae IAM 2660壳聚糖酶由多基因编码[11], 从发酵液中纯化的A . ory z ae IAM 2660壳聚糖酶的分子量为40kD , 而通过基因克隆所得到的壳聚糖酶一段基因只有2094bp, 编码有245个氨基酸的多肽, 分子量为26. 5kD. A sp ergillus sp . Y 2K 的壳聚糖酶的N 末端序列(YNLPMM LKQIUDDHK) 与真菌壳聚糖酶的顺序高度相似, 可能也属于这一族
[21, 23]
.
2. 3 糖苷水解酶族80号
M . chitosanotabidus 3001壳聚糖酶的氨基酸序列与Sp hingobacter ium multiv orum 壳聚糖酶高度相似, 这2种酶被归类为80号. 成熟的M . chitosanotabidus 3001壳聚糖酶的N 端有15个氨基酸:AAAA GVIPVGDSRVY. M . chitosanotabidus 3001是一个新的壳聚糖酶,
氨基酸序列与蛋白质数据库中其他糖苷水解酶
[4]
1-B acillus ehimesnis ; 2-Bur kh old eria gladioli ; 3-S treptomy ces coelicolor ; 4-B acillus amyloliquo -f aciens ; 5-Chlorella v ir us CVK 2;
6-Chlorella virus PBCV -1;
7-B acillus cir culans M H -K 1;
8-B ac illus subtilis ; 9-N ocard ioides sp . N 106; 10-S tr e p tomyces sp . N 174; 11-M atsuebacter chitosano -tabid us ; 12-Sp hingobacter ium multiv or um . (其中1~10属于46号, 11, 12属于80号)
图2 46号与80号壳聚糖酶部分氨基酸序列比较
d
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(包括已知的壳聚糖酶、几丁质酶及N -乙酰葡
萄胺糖苷酶) 没有明显的同一性. 通过定点突变和随机诱变发现在M . chitosanotabidus 3001壳聚糖酶氨基酸序列的N 末端的2个Glu 残基, Glu 121和Glu 141是催化活性残基, 同时Asp 139、Asp 148、Arg 150、Gly 151、A sp 164、Gly280虽然不直接参与催化, 但是对酶活性也是必须的. 大部分糖苷水解酶(溶菌酶、几丁质酶和壳聚糖酶) 中, 酶的催化位点都包括羧基氨基酸, 如Asp 、Glu, 但在M . chitosanotabidus 3001壳聚糖酶中2个催化残基都是Glu(图2) , 这在所有的壳聚糖酶和几丁质酶中可能是唯一的例子[4, 25].
序列对比分析表明80号壳聚糖酶可能与46号家族的酶有着共同的、高度保守的“活性部位”组件:E -[D /N /Q ]-x (8, 17) -Y -x (7) -D -x -[R/D]-[G]-x -[T/S]-x (4) -G-x (5, 11) -D, 它包括来自B . circulans M H-K1、S trep tomyces sp . N 174壳聚糖酶的对维持酶活性和稳定性所必需的几个氨基酸. 因此, 有人建议将46号与80号归为一族[26].
酶的活性中心被确定, 而其它微生物壳聚糖酶在这方面的研究还比较少、不够深入, 而且细菌壳聚糖酶基因的差别较大、同源性低, 需要进一步在分子水平上研究壳聚糖酶的分子结构和作用机制, 以便更有效地克隆细菌壳聚糖酶基因, 构建能高效表达壳聚糖酶的工程菌株, 进而有助于更好地利用壳聚糖, 加速其应用的实用化和产业化.
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3 问题与展望
壳聚糖及其水解产物——低分子量的壳寡糖在生物医学、食品、化学工业方面有着广泛的应用, 具有潜在的多种生物活性如抗菌性和诱导植物产生植物抗菌素, 在体内还具有抗胆固醇合成、通过免疫刺激抗肿瘤等活性因而越来越受到人们的注意. 但是对有关壳寡糖在体内作用效应的理解还很模糊; 另外, 通过化学方法制备壳寡糖不仅工艺复杂、成本高, 而且易污染环境, 因而使壳寡糖的应用范围受到限制. 微生物壳聚糖酶可以用来大规模生产壳寡糖, 并且细菌壳聚糖酶在维持生态平衡、在生物化学和分子水平上研究壳聚糖水解机制方面有着重要作用. 随着分子生物学技术的发展, 微生物壳聚糖酶的研究已经进入了分子水平, 但是与几丁质酶和溶菌酶相比, 只有少数壳聚糖酶的基因被克隆, 仅仅Bacillus circulans MH -K1、Str ep -tomy ces sp . N 174、Matsuebacter chitosano -
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浙江大学学报(农业与生命科学版)
第30卷
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