细胞周期检测点的流式细胞术分析_谢大兴
!癌症
!!
细胞周期检测点的流式细胞术分析
谢大兴#
吴剑宏#
冯永东#
李小兰#
陶德定#
龚建平
技术与方法’’
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bRV?$Mb).1#Xcd)$.Me’.1#
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华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤研究所#湖北武汉3JGGJG
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通讯作者&龚建平
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基金项目&国家自然科学基金$9(L
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’/56)%,#&‘+
+摘
要,
背景与目的&真核细胞的细胞周期运行遵循着严格的时相次序#这种精
J4OJG0OG#9(LJ4KOGJK2%*国家
杰出青年基金$9(LJ4O02G0O%*04OJ1肿瘤计划$9(LI544TG25050%*卫生部临床重点学科$9(L0GG502JO%资助
!
$9(LJ4OJG0OG#9(LJ4KOGJK2%*
密的延缓和强制的次序#由细胞监控机制---检测点来完成#检测点功能的丧失会导致肿瘤的发生.传统的细胞周期检测点分析多数基于群体细胞89:直方图的流式细胞术.本研究以晚;6期检测点为模式#建立一种新的细胞周期检测点分析方法---!9:双参数流式细胞术#并评价应用该方法进行细胞周期检测点分析的可行性和优越性.方法&将紫外线照射诱导后的人类急性淋巴细胞型白血病细胞株$?@ABC3%于不同时间点收获固定#分两组进行流式细胞仪检测&一组用
9+E)*+,Z/#%$/%[)$D-(*
8#&E#$S)#&
$9(LI544TG25050%*.,#$#/+,^%
89:直方图法#?(D#-#E软件分析计算;1=;6期细胞总数*另一组应用.
细胞数量进行定量分析#并比较两组实验结果.结果&用89:直方图法观察到紫外线照射后1H3
Z)_X%/E]%&%+*/
$9(L011602JO%收稿日期&0113C61C14修回日期&0113C60C62
!!
8C早期细胞数缓慢上升%结论+()*+,-
谢大兴!等!细胞周期检测点的流式细胞术分析
购自8LN(4公司%取对数生长期细胞#密度约为OPCAO9F+$经紫外线照射
期及8H93期’个细胞群体!用3IW,X,Y软件计算8D98C期细胞总数%图H示
19
的荧光强度及表达阈值定量化!对于细胞晚8C期检测点的检测比传统的
HA.后!分别培养C;A*C;O*H;A*H;O*’;A*’;O*7;A*M;AQ后收获细胞%!
$%&直方图分析法
收获培养细胞后!用RAS冷乙醇固定!置于THDU箱过夜%细胞固定后!用KNV洗涤二次!随后温育于7D!+
345267细胞经紫外线照射HD.后继
续培养D&MQ!细胞8D98C期阻滞动力学改变+D&7Q!8D98C期细胞数目为O’DD&OODD!变化不明显)MQ时
关键词+白血病9遗传学)流式细胞术)
345267细胞株)细胞周期)细胞周期
检测点)细胞周期素中图分类号+J^’;’
文献标识码+N
文章编号+CAAAT7M^Z#HAAO$A_TCCOCTAO
真核细胞的细胞周期运行遵循着严格的时相次序
8D98C期细胞数目开始上升#MH7C$!提
示该时间点8C期检测点已被激活!细胞阻滞在8C期%
K(缓冲液’O(中!约’DF,-%再次洗涤细
胞后!用CD!G9F+KL和D;CSJ-
HDF,-!待流式细胞仪检测后!3IW,X,Y
软件分析计算8D98C期细胞数目%
!
收获培养细胞后!用RDS冷乙醇固
相则延缓开始!而新的细胞周期时相开始后!上一个细胞周期时相必须结束%这种精密的延缓和强制的次序!由细胞内固有的监控机制&&&检测点来完成’%&’(%当细胞发生损伤或突变!细胞周期检测点将这类细胞阻滞在相应的位置进行修复)检测点功能的丧失!会导致肿瘤的发生%因此!细胞周期检测点的状态或功能分析不仅在细胞生物学领域!而且在肿瘤生物学领域显得越来越重要%近年来新发展的()*+,-./
定!置于THDU冰箱过夜%细胞固定后!用KNV洗涤二次!然后用稀释的D;HOS
2:,YI-Z6CAA在冰上处理OF,-!随后加
以KNVOF+!离心!洗涤H次!然后加入用CSNV0稀释的鼠抗人()*+,-1!在
图
C
345267细胞
7U放置过夜%次日细胞用KNVOF+离
心!洗涤后!加入标有羊抗鼠LG8抗体#V,GF
\,GE:?C
?a‘I-?-Y,
J#
同型非特异性抗体#LG8$替代鼠抗人的
图H
紫外线照射后不同时间点8A98C期
间内迅速检测到检测点的激活!其敏感而精确的独特优势!使得检测点机制研究不断的深入!已成为当前细胞周期研究领域内一种科学的分析方法%
本研究采用()*+,-1/
*)*+,-单克隆抗体!其余处理步骤同上%!0
流式细胞仪检测和分析
经上述处理的细胞用\0(VI:Y流式细胞仪#N?*YI-
细胞总数#由
\,GE:?H8A98C‘Q
Y,F?‘I,-Y.
Q,.YIG:
#
()*+,-.1$%&双参数法
图’示未经同步化处理处于对数生长期的345267细胞()*+,-1的二维等高分布图%该图中横坐标表示单个细胞的
()*+,-1荧光强度*阈值及8%各亚期
细胞数目进行定量分析’7()并与单纯
检测点分析更具敏感性和科学性%
!
!
材料与方法
细胞培养和处理
()*+,-1的荧光强度!反映细胞内()*+,-1含量的高低%8D98C各亚期细
胞#包括8D期*8C早期及8C晚期$分别以J?G,I-C!H!’表示%J?G,I-C区域内所示为8C晚期#8C5$细胞!细胞()*+,-
345267细胞为急性2淋巴细胞
白血病细胞#美国!
#
#
结果
1表达强阳性!在8C6V交界处()*+,-1
的表达有一个阈值#箭头所示$!细胞内
$%&含量直方图法
图C为未经同步化处理!处于对数
!G9F+的链霉素$和HFFI+95谷氨酰
胺的JK3L6CM7A培养液中悬浮培养%细胞培养中所用的培养液*胎牛血清等
()*+,-1合成积累需达到这个阈值才
能进入V期!J?G,I-H和J?G,I-’内分别为8C早期#8C1$和8D期细胞%
生长期的345267细胞的
谢大兴$等
图!
显示细
胞经紫
外线照射
!!
期及89:#的细胞数目变化趋势’#>!’$
89:细胞数目相对稳定
之间#$&’时细胞略有减少
./012二维等高图
像未给出#$从图上可看出随着时间延长$*)*+,-.的含量和表达阈值明显上升%
图3示(4++564$7软件定量计算照射后不同时间点89:细胞内()*+,-.平均荧光强度和阈值的变化趋势%图上
图%
&’开始增多&8#期细胞数变化不大$#>!’略为下降%
图;为不同时间点8#/89细胞总数$89:细胞数及89:细胞()*+,-.平均荧光强度和阈值的变化比率曲线图$该图直观显示出照射后细胞数目和
BC:DE!细胞()*+,-./012
二维等高地形图
可见89:细胞()*+,-.荧光强度在照射后一小时内便出现变化$随后呈现快速!大幅度上升$由
F,G6H4%I$JK47H,**J-7J6HKLMJN()*+,-./012,-7’44OMJ-4-7,L++)GHJP,-GBC:DE!*4++$
D’4Q+L*RLHHJP$’JP$7’47’H4$’J+SJN()*+,-.N+6JH4$*4-*4,-74-$,7)
3==
样迅速发生变化’由
()*+,-.的变化幅度差别%图上可见$
以89:细胞()*+,-.荧光强度和阈值来检测细胞89:阻滞的发生$相比8#/
3
图=示(4++564$7软件计算出不同时间点8#/89各亚期
89:胞数目可提前近3’$且检测效果更
为明显$具有显著的差别%
图!细胞经紫外线照射
F,G6H4!I$JK47H,**J-7J6HKLM$JN()*+,-./012,-7’44OMJ-4-7,L++)GHJP,-GBC:DE!*4++$L7S,NN4H4-77,K4MJ,-7$F+6JH4$*4-*4,-74-$,7)L-S7’H4$’J+SJN()*+,-.P4H4,-*H4L$4SV6,*R+)LN74HWX,HHLS,L7,J-
图3
紫外线照射后不同时间点89晚
图&
紫外线照射后不同时间点89
期细胞()*+,-.平均荧光强度变化晚期细胞()*+,-.阈值变化
F,G6H43()*+,-.N+6JH4$*4-*4F,G6H4&()*+,-.7’H4$’J+SJN89:*4++$
,HHLS,L7,J-
,-74-$,7)JN89:*4++$L7S,NN4H4-77,K4
MJ,-7$LN74HWX,HHLS,L7,J-
L7S,NN4H4-77,K4MJ,-7$LN74HWX
图=紫外线照射后不同时间点8#期!89早期
目变化
S,NN4H4-77,K4MJ,-7$LN74HWX,HHLS,L7,J-*L+*6+L74SQ)()*+,-./012K47’JS
最终结果都表现为细胞阻滞在不同的周期时相中%
传统的细胞周期检测点功能分析是基于同步化细胞Y期或B期形态学变化出现时间的延迟来观察%这种方法
!讨论
转导途径(&$=)%为了更深层次的研究检测点的功能$不仅要找出这些途径上的各种刺激物和信号分子$更要弄清细胞周期运行的*解剖结构+%因为各种内外因素的刺激作用于细胞周期检测点的
一般认为$细胞周期检测点激活后会导致不同的细胞周期阻滞$其中包含着一系列复杂的生化反应和信号
!!
谢大兴
单纯的&’(直方图法显得过于简单粗略$后来发展的
修复成功
./012&’(法虽能对!期进行
详尽的分析
近年来
图)
细胞经紫外线照射后EH的
时相性激活
&’(损伤
监测途径将基因改变信号传递给G
!的4&5A4789:;抑制物*包括4789:;?A4&5#%4789:;(A4&5#等+
过渡
4&5#活化的抑制或延迟导致4789:;?
不能及时降解
&’(直方图
J:CK/>)
&’(H:6LBC/MNNMOBP
+-@检测点状态进行分析$
用4789:;?2&’(双参数法可观察到
4789:;?在细胞周期+-中晚期
表达升高
图3
+$2+-期%+-晚期*+-@+细胞数目和+-@
变化百分比值*1T#$6+
-H已出现明显变化
上升
4789:;?平均荧光强度及4789:;?阈值的J:CK/>3
G/BOB/L:B;BP+$2+-OHM6>8>996M;0+-@
通过+-2!过渡
为此+B;C等(-#
+$2+-期细胞总数在EH才开始增多$
此外
8>996M;04789:;?P9KB/>68>;8>:;L>;6:L7M;04789:;?LH/>6HB90BP+-@8>996ML0:PP>/>;LL:N>OB:;L6MPL>/1T
://M0:ML:B;
存在两种不足!一是细胞同步化后会导致不平衡生长
胞术对细胞周期进行了较为详尽的区分$此方法将单个细胞中细胞周期蛋白*4789:;6+的表达情况和细胞在细胞周期中所处的位置结合起来
&’(直方图上还没有表现出明显的阻
滞动力学变化时
+-@阻滞现象$
除了+-@检测点外
+#期和
为+$%+-?%+-@%!期%+#期%
从功能上看
!期%+#期和
功能不同
&’(损伤或突变
阻滞在相应的细胞周期中进行修复
.-2&’(的双参数流式细胞术
究正在进行之中$由于临床肿瘤或多
谢大兴!等G细胞周期检测点的流式细胞术分析
或少地存在一个甚至多个细胞周期检测点的缺失!因此!本项分析方法的建立将为临床肿瘤的诊断和预后判断提供新的!更为敏感的检测手段
#参
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考
文
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新的细胞周期分析方法#X$G癌症!
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谢大兴!吴剑宏!余
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,中国肿瘤*杂志+,肿瘤学杂志*联合征订稿启事
)中国肿瘤*杂志由卫生部主管!中国医学科学院+全国肿瘤防治研究办公室主办!是中国肿瘤防治领域惟一一份综合类科技月刊!e44@>YY8VY989.@>>V9:开!HY页!单价YY
,肿瘤学杂志*是面向全国的学术类科技双月刊!e44@>:H>V>HYg.@IIV>9::fL!大>:开!
以上两刊均为国内外公开发行!均已加入-中国期刊网.+-万方数据库.+-中文生物医学期刊文献数据库.+-中国生物医学期刊引文数据库.+-中文科技期刊数据库.+-中华医学杂志网.等!并专递中国肿瘤网站%B$$D’ff%%%G\F\’G+&$&/
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,中国肿瘤*编辑部
,肿瘤学杂志*编辑部
,中国肿瘤*编辑部WVA