His标签融合蛋白纯化步骤

His 标签融合蛋白纯化步骤

（Ni-NTA 琼脂糖凝胶亲和层析纯化法）

1. 缓冲液配制

◆ L ysis Buffer 1 (under native condition) 0.5mM Tris.HCl 0.5M NaCl

5%(w/v) glycerol 10mM Imidazol

100mg(1mg/ml)lysozyme (Purification of 6xHis-tagged proteins from E.coli )

1% Nonidet P40 (NP40 = Igepal CA-630 ) 0.25% Tween 20 （or Triton 100） 0.02% NaN3 (Optional)

2 tablets of protease inhibitor cocktail (EDTA free， Recommended)

200 µg(2µg/ml) RNase A (Optional) 1mg (10µg/ml) DNase1 (Optional) 50 mM NaF (Optional) 1mM Na3VO 4 (Optional)

+ ddH2O to 100ml, Adjust pH to 8.0 using NaOH

此 lysis buffer 适用于从 E.coli 、哺乳动物细胞和昆虫细胞中纯化带His 标签的蛋白质。仅在用于裂解 E.coli 细菌时，加入溶菌酶。

Na3VO4是磷酸酶抑制剂，保护磷酸化的蛋白不被磷酸酶还原。NaF 是酯酶抑制剂，保护脂蛋白不被酯酶降解。

注意：当使用镍琼脂糖凝胶纯化带His 标签的蛋白时，缓冲液中不能加EDTA ，因EDTA 能使镍从螯合物上脱离，从而使分离介质失去效果。

◆ L ysis Buffer 2(under denature condition)

50 mM Tris-Cl

8 M Urea (or 6 M Gu-HCl) 10mM Imidazole 0.05% Tween 20

Adjust pH to 8.0 using NaOH

◆ D ialysis/Tev cleavage Buffer

50 mM Tris-Cl,pH8.0

100 mM NaCl (depends on solubility of protein) 2.5% glycerol 0.5mM EDTA

0.5mM DTT or TCEP

◆ 缓冲液A ：

50mM Tris.HCl

0.5M NaCl 5% glycerol 0.05% Tween 20

用高浓度HCl 调节pH 值至8.0。

◆ 缓冲液B （洗脱缓冲液）：

50mM Tris-Cl

0.5M NaCl 5% glycerol 0.05% Tween 20 500mM 咪唑

用高浓度HCl 调节pH 值至8.0。

◆ 缓冲液C （咪唑梯度洗脱液）：用缓冲液A 和缓冲液B 按不同比例配制，配制比例如下（100ml

总体积）：

2. 样品预处理：

按每克湿重菌体/4~5ml Lysis Buffer 的比例充分悬浮离心收集的菌体，置-80ºC 冰箱过夜；在4ºC 融解菌体，vortex 悬浮细菌， 400w 功率下，每个循环超声5s ，冷却5s ，每次10 min，共循环2次破碎菌体；4℃、12000rpm 离心30min ，收集上清液或者用0.45μm 滤膜过滤，并用低浓度NaOH 调节 pH 至8.0待纯化。

3. 操作步骤

◆ 介质平衡与亲和

取 1ml Ni-NTA琼脂糖凝胶（金益肽TM NTA 货号：JYT-M0007），置入15ml 离心管中，2000 rpm离心2 min，移去上清液；加入5ml Lysis Buffer，混匀，低速离心，去上清。加入4-5 ml细胞（细菌）裂解液，置于混匀转盘，4ºC 低速旋转1小时。

(每个品牌的NI 柱载量都不同，金益肽TM NI-NTA琼脂糖凝胶载量>40mg/ml，请根据目标蛋白的浓度、分子量大小、及体积来选取适量的Ni-NTA 琼脂糖凝胶) ◆ 装柱

1) 将层析柱固定在铁架台或层析架上，封闭层析柱下端出口，向柱内充入纯水，排开层析

柱内空气，先将垫片完全浸没于水面下方，在保持水平的状态下，小心推向底部，避免垫片下方滞留气泡。

2) 打开层析柱下端出口，排出柱中纯水；在液面低至距垫片1~1.5cm高度时封闭下端出口，

用移液管吸取已与样品亲和的介质，将介质加入到层析柱中；在4ºC 静置10min ，让介质自然沉降。

3) 从上端管口将另一垫片缓慢推至介质沉降平面，使介质表面保持水平状态，注意避免垫

片与介质接触面滞留气泡（如对实验要求并非十分严格，为提高流速，可不覆盖上垫片）。 4) 在使用一段时间后，如果层析柱流速减慢，可先用小镊子沿边缘将垫片推翻，夹出垫片，

倒出介质，清洗或更换新的垫片后，按2）、3）所述步骤重新装柱；或不更换垫片，用细棒搅拌介质，使其疏松，再装入上端垫片。 ◆ 洗柱：

用5~10倍介质体积含10mM 咪唑缓冲液C 洗去层析柱中未结合蛋白； 保留洗涤液，待SDS-PAGE 电泳检测无目的蛋白后，再将洗涤液丢弃。 ◆ 洗脱：

用含20、50、250mM 咪唑的缓冲液C 分步洗脱，每个梯度2~3倍介质体积洗脱，分别收集洗脱样品，SDS-PAGE 电泳检测蛋白质；

注：纯化过程流速不宜过快，对于1ml 介质，流速保持在0.5ml/min为宜。