木耳菌种分离新方法简介

木耳菌种分离新方法简介

杜

萍1，2

崔宝凯1*

（1北京林业大学微生物研究所，北京100083；2黑龙江农业经济职业学院，牡丹江157041）

摘

要

介绍了一种利用干耳组织分离木耳菌种的简便方法，

基冷却后备用。

分离效率高，操作时间短，节省材料，只需一小块耳片就能成功分离出所需菌种。关键词文章编号

耳片

组织分离

无菌操作

2

2.1

组织分离方法

材料准备

挑选朵型大、肉质厚、无筋或少筋、颜色正、

1000-8357（2009）06-0027-01

无霉、无虫害野生或栽培的当年头茬干木耳1片放入无菌超净工作台内。每号标本准备10管斜面培养基。

近年来，随着山区开矿和城镇建设使木耳物种的数目日益减少，对木耳种质资源的收集、保存及研究成为一项必不可少的基础工作[2]。而一株优良的木耳菌株经过多年的扩大生产使用，其优良特性会出现严重的退化现象，也必须进行重新分离复壮[3]，为了保证木耳产业的正常发展，不间断地选育优良菌株势在必行。传统的选育菌种大多是通过组织分离方法，多用鲜耳直接分离或将干耳用水泡湿后再分离。目前也有采用干耳进行分离的，但程序繁杂，所用药品较多，条件差的地方难以做到。由于受多种药物的作用，即使分离成功，菌丝萌发和生长也很缓慢[4]。黑木耳的耳瓣薄，并富有胶质，所以在过去的分离法中很少采用耳片组织分离。本方法克服现有的干耳菌种分离方法中所存在的操作复杂、成本高、菌丝分离成功率较低、质量差等缺陷，是一种操作简单，用材少（包括药品），成本低，菌丝萌发快，长势强，浓密，分离成功率高的干耳组织分离方法，以解决木耳的常规分离法所存在的一系列技术问题，为广大制种工作者提供方便。

2.22.32.3.12.3.2

用具准备组织分离所用工具为剪刀和镊子，使用前在

酒精灯火焰上方消毒即可。

组织分离及纯化培养干木耳消毒并润湿剪取耳片组织块

在超净工作台内将干耳片表面用用无菌剪刀将耳片四周边缘去掉，

75%酒精棉球擦拭2~3遍，用酒精棉包住耳片约2min 。

剪取远离耳基没有筋的最平部位的耳片，得到长0.5cm 左右，宽0.2cm 左右的组织块。

2.3.32.3.4

组织块灭菌消毒分离培养

用无菌镊子夹取该组织块在酒精灯

火焰的外焰上方来回快速穿梭2~3次，每次1~2s 。

将组织块的1/3~1/2部位插入5mL 离心

管中的斜面分离培养基的中下部位之中；上述整个过程都要遵循无菌操作。将接种后的离心管插入离心管盒中（32管/盒），置于25℃恒温培养箱中培养。

2.3.5纯化培养分离培养5~6d 后，挑取新生长出的菌丝

1

1.1

供试材料

耳片来源

作为接种块接种于纯化培养基中进行纯化培养。

2008年将从江西省分宜县大岗山、海南省

3结果与讨论

组织分离2~3d 后，长势旺盛的可看到白色绒毛状菌丝，

陵水县吊罗山、海南省昌江县霸王岭、重庆市重庆师范大学、湖北省武汉市黄鹤楼景区、河北省涞水县北辛庄等野外采集的黑木耳[Auricularia auricula （L.ex Hook. ）Underw.]、毛木耳

分离成功率达95%以上。在用干耳组织分离过程中若出现污染也只是细菌污染，几乎没有霉菌污染，因此可在分离培养中添加100μg/mL的青霉素钠来增强培养基抗细菌污染的能力[5]。另外，转管时如不慎，挑取了染有细菌的菌落，转管后几天内细菌长势较旺，无法纯化菌丝。因此转管时应将接种块插入培养基（最好用平板）内部，接种块露出培养基表面1/3即可，这样细菌在培养基内生长，待其长出表面时菌丝的生长势已明显强于细菌，培养1周左右待菌丝长到无菌区再次转管可获得纯菌丝。

试验采用的纯化培养基营养丰富，较适合木耳菌丝的生长，接种于60cm 的平板培养基上，25℃恒温培养条件下生长势最强的菌丝6d 就可长满平板，获得大量的木耳纯菌丝，菌丝生物量鲜重最高达到176.9mg/13mL ，干重为70.8mg/13mL ，长势中等的需10d ，长势较弱的需10d 以上长满平板。

此方法与传统的木耳组织分离方法相比主要具有以下优点：①方法简便，节省材料，只需一小片耳片就能成功分离出所需菌种，又能较稳定地保持原有菌种的优良特性。②分离效

[Auricularia polytricha （Mont. ）Sacc.]及皱木耳（Auricularia deli -cata （Fr. ）Henn. ）标本带回室内自然阴干或于28℃的烘箱烘

干，干燥后即可用于组织分离菌种。

1.2培养基制备①分离培养基：麦芽浸粉20g ，琼脂18g ，

水1000mL ，pH 自然。将分离培养基煮好后趁热分装于5mL 的离心管中，装液量为1.8mL ，装于离心管架上，于121℃高压灭菌20min ，灭菌后将离心管架倾斜摆放使培养基成一斜面备用。②纯化培养基：麦芽浸粉20g ，葡萄糖20g ，琼脂18g ，磷酸二氢钾3g ，水1000mL ，pH 自然。将纯化培养基煮好后趁热装于500mL 的三角瓶中，用牛皮纸封口后于122℃高压灭菌20min 。灭菌后趁热移至无菌超净工作台，分装于60cm ×

1.3cm 的平皿中，装液量为13mL ，将平板水平摆放，待培养

收稿日期：2009-03-03

基金项目：国家863高技术研究发展计划（No.2007AA021506）。*通讯作者。e-mail ：[email protected]

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草菇菌种的提纯复壮初探

王志强

（上海农科院食用菌所农业部食用菌遗传育种重点开放试验室上海市农业遗传育种重点试验室，上海闵行201106）

关键词文章编号

制种纯化草菇复壮菌种

24支左右，如因操作失误而达不到此数量，要补充合格种菇

再分离。

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菌种的分离与筛选是在食用菌栽培过程中的重中之重。食用菌的菌种在使用过程中存在着变异与退化，尤其是草菇菌丝，生长快退化也快，因此要定期引种或提纯复壮，才能保证菌种质量及种性稳定，从而为最终产量稳定打下基础。

2

2.1

分离菌株的鉴定与筛选

初筛1

①一般分离培养3d 左右菇肉上萌发出白色菌

丝，此时挑出因操作不过关而导致斜面感染杂菌的试管，余下继续培养；②待菌丝长至2cm 左右时，观察菌丝生长情况：a. 基内菌丝整齐浓密，纤细有力呈银灰色，生长速度快；气生菌丝爬壁能力强，长势整齐一致的继续培养；b. 基内菌丝很稀疏，气生菌丝长势混乱，气生菌丝发白，气生菌丝远比基内菌丝多或者感染杂菌，只要出现其中一种情况就剔除；③观察满管快慢，标注满管时间；④观察厚垣孢子出现早晚，标注时间；优先选择先满管先出现厚垣孢子的试管，留最好的12株，不足则有多少留多少。

1组织分离

工厂化生产草菇时，为了保证种性稳定，大多采用定期组

织分离、严格筛选，获得菌种。一般每次选择种菇时，首先要选择出菇好（产量高，整体菇形大小适中，整齐度高）的菇房，菇房内无明显病虫害；其次在此菇房内选择出菇最好的床架，从该床架中挑选出菇最好的料层；在该料层上最好的一片菇中选择无杂菌虫害、生长健壮、非常结实、底盘肥大的草菇幼菇（五六分熟，呈小水蜜桃状）3～4个。采下幼菇立即放入无菌或洁净的塑料袋中，连同分离用的试管培养基带到菌种室超净工作台。

组织分离时，先用75％的消毒酒精消毒双手和工具以及种菇表面（操作熟练者也可不消毒种菇表面），用充分灼烧的手术刀先在纵面上浅浅的环切一道（不要切破外菌幕），在种菇的基部从正中切开一个小口，用手捏种菇外部剥开菇蕾，在菇盖与菇柄交界处用灭过菌冷却后的手术刀浅切一个“田”字形，每个小块3~4mm 见方（尽量不要划穿菇肉触及菌褶），直接用刀将菌肉小块接入试管培养基上，塞上棉塞。将菌肉小块拍到试管底部，置于29～31℃环境培养。分离到的试管要达到

收稿日期：2009-04-01

2.2初筛2①将剩余的12株编号VZ1－VZ12，取尖端菌丝

转管，底部3cm 不动，每支转20~30支，对应标注VZ1M1-

VZ12M1；②转管后剩余的菌种，在酒精灯下，敲破试管底部

（可用小砂轮沿底部无培养基处用力划出痕迹，然后在火焰上稍稍烤一下，如未破裂，迅速用冷的酒精棉球冷却可使试管底部破裂），用灭过菌的打孔器在底部1～2cm 位置打孔取样（打孔器直径4～5mm ），打2排孔，每排2个；靠基部的那排接到平板中央，另一排接到平板边沿；菌丝面贴培养基，标注与转管试管相同，置于29～31℃倒置培养；③转管试管的筛选方式与下述“草菇母种转管筛选”相同；平板分2块：接在中央的菌种，主要对比菌丝形态，色泽、均一度，是否存在角变，淘汰不稳定的菌株；接在边沿的菌株，主要比较每组的平均生长速度，如果平板的盖板无冷凝水的，比较其爬壁力；综合评比后，

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率高，操作时间短，不需要用酒精或升汞等长时间浸泡处理木耳耳片，只需要将干木耳的表面用75%酒精棉球擦拭2～3遍，用酒精棉包住耳片约2min ，然后将耳片组织块从酒精灯火焰的外焰中快速的来回穿梭2～3次，就能在较短的时间内达到彻底消毒的效果。而现有的木耳组织分离方法中多是采用升汞进行消毒处理，升汞对周围环境有害，对木耳也有一定的不利影响，用升汞消毒后需要用清水进行反复冲洗；但是干木耳如果润湿过度，将其剪成耳片组织块后，由于缺乏硬度和韧性，无法将其顺利插入到分离培养基中并保持竖立，结果造成分离成功率非常低。③耳片经晒干已杀灭部分杂菌，经上述再处理，消毒较为彻底，组织块接种在母种培养基上时，很快吸收无菌水分、使耳片膨胀恢复萌发菌丝能力，分离成功率高达95%以上（常规分离法最高的分离成功率仅为80%左右），菌丝生物量高。

[5][3][4][2][1]

社，2007：1-231. 张

丹，郑有良，高健伟，等. 毛木耳（Auricularia polytricha ）种质

方法操作简捷，生产成本低，菌种分离成功率高，菌丝萌发快、长势强、浓密，适用于野生及栽培的黑木耳、毛木耳或皱木耳等多种胶质耳的组织分离，应用范围较广。

参考文献

戴玉成，图立古尔. 中国东北食药用真菌图志[M].北京：科学出版

资源的ISSR 分析[J].山地学报，2006（增刊）：142-148. 郭翠英. 干耳组织分离试验[J].江苏食用菌，1995，16（2）：33刘光彦. 一种快速简便的黑木耳组织分离新方法[J].贵州农业科学，2005，33（1）：73. 戴水莲，林

警，高

丽.PDA 中加入抗菌素的抗菌作用试验[J].

食用菌，2008，30（1）：28-29.

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