高速逆流色谱法分离纯化金银花中的绿原酸_张霞
)106)药物分析杂志ChinJPharmAnal2010,30(1)
高速逆流色谱法分离纯化金银花中的绿原酸
张霞,崔海燕,贾晓艳,王玉玲,张志琪
1,2
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1*
(1.陕西师范大学化学与材料科学学院,西安710062;2.宁夏医科大学药学院,银川750004)
摘要 目的:采用高速逆流色谱法对金银花提取液中的绿原酸进行分离纯化。方法:采用微波辅助提取金银花中的绿原酸,提取液经过滤、浓缩,所得浸膏作为高速逆流色谱分离的样品。采用TBE-300A型高速逆流色谱仪,以正丁醇-乙酸-水(4B1B5)为溶剂体系进行分离纯化,用下相作流动相,上相作固定相,流动相流速为210mL#min-1,仪器转速为1000r#min-1,温度为25e。结果:金银花粗提物经过一步纯化,得到绿原酸的纯度为9812%。结论:用微波辅助提取、高速逆流色谱法分离纯化金银花中的绿原酸,方法简单、有效,为绿原酸的分离纯化提供了一种新途径。关键词:高速逆流色谱;金银花;绿原酸中图分类号:R917
文献标识码:A
文章编号:0254-1793(2010)01-0106-04
SeparationandpurificationofchlorogenicacidfromFlosLonicerae
byhigh-speedcountercurrentchromatography
ZHANGXia,CUIHai-yan,JIAXiao-yan,WANGYu-ling,ZHANGZhi-qi
(1.SchoolofChemistryandMaterialScience,ShaanxiNormalUniversity,Xi.an710062,China;
2.CollegeofPharmacy,NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China)
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Abstract Objective:ToseparateandpurifyofchlorogenicacidfromthecrudeextractofFlosLoniceraebyhigh-speedcounter-currentchromatography(HSCCC).Methods:Chlorogenicacidwasextractedwiththeassistanceofmicrowavepower,thenfiltratedandconcentratedunderreducedpressure.ThecondensedsamplewasseparatedbyHSCCC.Two-phasesolventsystemcontainingn-butanol-aceticacid-water(4B1B5)wasrunonapreparativescale.Thelowerphasewasusedasthemobilephaseandtheupperwasusedasthestationaryphaseintheheadtotailelutionmode.Theflowratewas210mL#min.Therunningratewas1000r#min
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at25e.Results:Chloro-
genicacidwith9812%puritywasobtainedbyonceseparation.Conclusion:TheHSCCCmethodissimple,high-performanceandsuitableforisolatingandpurificatingchlorogenicacidfromFlosLonicerae.Keywords:HSCCC;FlosLonicerae;chlorogenicacid
高速逆流色谱(high-speedcounter-currentchromatography,HSCCC)是一种基于液-液多级逆流萃取建立的色谱体系,以轻巧的聚四氟乙烯螺旋管作分离柱,在行星式运动中连续地完成整个分配、传递、
[1]
分离过程,无需固相载体,避免了待分离样品与固相载体表面产生化学反应而导致的不可逆吸附;可采用多种溶剂系统实现物质的对流分配;能在一个流程中分离复杂样品中极性差异较大的各个组分,制备纯品;仪器及试剂成本明显低于高效液相色谱
[2~4]
其主要活性成分为绿原酸。绿原酸具有抗菌、抗病毒、止血、抗氧化、消除自由基、抑制突变和抗肿瘤等多种生物活性效用
[6~8]
,在医药、卫生、食品等领域具
有很大的应用价值。因此,从植物中提取分离绿原酸具有重要的意义。本研究采用高速逆流色谱法对金银花粗提物进行分离纯化,得到了高纯度的绿原酸,为金银花中绿原酸的分离制备提供了一种新途径。1仪器、样品与试剂
TBE-300A高速逆流色谱仪(中国上海同田生化技术有限公司);Waters1525型高效液相色谱仪,配置Waters2996DAD检测器和Empower色谱工作
。
[5]
金银花(FlosLonicerae)属忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或初开的花,是传统的清热解毒常用中药
,
(-i:ls
药物分析杂志ChinJPharmAnal2010,30(1))
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107)
站(美国Waters公司);液质联用仪(安捷伦与德国布
鲁克公司);Millipore纯水机(美国Millipore公司);RE-52A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);KD-23B-AN2微波炉(广东美的);SHZ-D循环水式真空泵(巩义市英峪华仪器厂);HR-120电子天平(日本);FW100型高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)。
金银花,购于西安市长延堡中药店;绿原酸对照品,购自中国药品生物制品检定所,质量分数\99%;乙腈为色谱级,超纯水,其他试剂为分析纯。2 方法
2.1 样品制备 微波法提取:将金银花粉碎,过40目筛。准确称取金银花粉末10g于1000mL圆底烧瓶中,加入43%甲醇400mL,在400W功率下,微波提取8min,将提取液浓缩得浸膏5116g,即得微波提取样品。热回流法提取:准确称取上述金银花粉末10g于1000mL圆底烧瓶中,加入43%甲醇400mL,回流提取1h。将提取液浓缩至80mL,用石硫法初步纯化,即用质量分数为20%的石灰乳调节浓缩液的pH至12,滤取沉淀物,加2倍量乙醇混悬,再用体积分数为50%的硫酸将pH调为3,充分搅拌,过滤,滤液用质量分数为40%的氢氧化钠溶液中和至中性,再过滤,滤液浓缩干燥,得粗样0185g,即得热回流提取样品。
2.2 供试品溶液制备 称取微波提取样品或热回流提取样品013g,溶于10mL等体积的两相溶剂体系[正丁醇-乙酸-水(4B1B5)]上、下相中,制成HSCCC分离的供试品溶液。
213 溶剂体系的选择在分液漏斗中按适当比例配制两相溶剂体系,充分振摇后静置,分层后备用。取样品25mg放入试样管中,加入已平衡的两相溶剂体系(上、下相溶剂各2mL),充分振摇使样品溶解,然后静置,待分层后取上下相各013mL,分别加入50%甲醇017mL,混合,过0145Lm微孔滤膜,进样10LL,用HPLC法对上相和下相中的绿原酸进行分析,根据两相的绿原酸色谱峰面积计算分配系数,通过分配系数K选择合适的两相溶剂体系。214 HSCCC分离过程配制两相溶剂体系,充分振摇后静置,使用前分开上下相,超声脱气后待用。取上相溶剂作为固定相,下相溶剂为流动相。将固定相
-1
以10mL#min的流速泵入高速逆流色谱仪的分离柱中,同时开启恒温循环装置使温度保持在25e,待固定相充满管道后,启动高速逆流色谱仪主机,调整
,-1
[9]
设定转速(1000r#min)时,以2mL#min的流速泵入流动相。当流动相从分离柱出口流出时,两相体系已经在高速逆流色谱的分离柱中达到流体动力学平衡,将供试品溶液打入样品环进样。分离柱出口与紫外检测器及色谱工作站连接,在280nm处进行检测,根据色谱工作站谱图收集馏分。215 HPLC分析条件
采用AgilentTC-C18色谱柱
(416mm@250mm,5Lm);流动相为乙腈(A)-011%磷酸(B),梯度洗脱(0~18min,9%Ay15%A;18~30min,15%Ay24%A;30~52min,保持24%A;52~55min,24%Ay9%A),流速110mL#min;检测波长280nm,柱温为室温,进样量10LL。3 结果与讨论
311 样品制备方法的选择
将微波辅助提取、热回
流提取浓缩所得提取物各约0125g,用40%甲醇溶解
并定容至50mL量瓶中,摇匀,精密量取该溶液5mL,置25mL量瓶中,加40%甲醇,摇匀定容至刻度。经0145Lm微孔滤膜过滤,进样10LL,用选定的高效液相色谱条件进行分析,色谱图见图1。由图1可知,微波辅助提取对绿原酸物的提取效率优于热回流法提取,且提取物成分相对简单,用HSCCC法分离纯化提取物中绿原酸,无需初步纯化,简便省时。因此,样品制备方法确定为微波辅助提取。
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图1 金银花提取物的高效液相色谱图Fig1
ChromatogramsfortheextractfromFlosLonicerae
A.微波辅助提取(extractedwiththeassistanceofmicrowavepower)B.热回流提取(extractedunderreflux)1.绿原酸(chlorogenicacid)
312 溶剂体系的选择在高速逆流色谱中,溶剂
体系的选择至关重要。溶剂体系在静止时要求能明显地分成两相,样品在两相中要有合适的分配系数,并且固定相能实现较高的保留。由于绿原酸结构中有酚羟基、羧基等,属强极性化合物,因此选择强极性溶剂体系,由正丁醇和水组成基本溶剂,考察了正丁醇-水、正丁醇-乙酸-水、正丁醇-乙醇-水3个不同极性的溶剂体系,用高效液相色谱法测定了绿原酸在各溶剂体系中的分配系数,结果列于表1。在高速逆流色谱仪上要得到满意的分离效果,分配系数应调整在015~210之间。根据表1的试验结果,选择正丁醇-乙酸-水(4B1B5)作为分离纯化绿原酸的溶剂体系。以上相溶剂为固定相,下相溶剂为流动相,获得了很好的分离效果。
表1
绿原酸在不同溶剂体系中的分配系数K值
TheKvalues(partitioncoefficient)for
Tab1
高分离速度,减少逆流色谱分离时间,本实验在进样4h后,停止主机转动,用氮气把固定相推出,并进一步用氮气吹干,得到1112mg
绿原酸。
图2 金银花粗提物的高速逆流色谱图Fig2
HSCCCforthecrudeextractfromFlosLonicerae
314 HPLC及LC-MS分析将高速逆流色谱分离纯化得到的绿原酸以高效液相色谱法分析,色谱图如图3,色谱保留时间及紫外吸收光谱与绿原酸对照品一致。用归一化法测定,绿原酸纯度高达9812%。进
K[1**********]6
chlorogenicacidindifferentsolventsystems
溶剂体系(solventsystem)正丁醇(n-butanol)-水(water)(1B1)
正丁醇(n-butanol)-乙酸(aceticacid)-水(water)(4B1B5)正丁醇(n-butanol)-乙醇(ethanol)-水(water)(3B2B4)
一步对分离纯化得到的绿原酸采用液质联用技术
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(ESI源,N2干燥气流量810L#min,干燥气温度325e,检测电压410kV,雾化气电压24113kPa;正离子模式,80eV,扫描范围为100~2000m/z)鉴定,质谱数据(图4)
也与对绿原酸照品一致。
313 高速逆流色谱分离纯化在高速逆流色谱仪
-1
上用选定的色谱条件:转速为1000r#min,流动
-1
相流速为210mL#min,分离温度为25e,正丁醇-乙酸-水(4B1B5)溶剂体系,以上相溶剂为固定相,下相溶剂为流动相,对提取物浸膏进行分离,固定相的保留率为3615%,样品进样量为013056g,所得高速逆流色谱流出曲线如图2所示。经与对照品高效液相色谱保留值以及紫外吸收光谱比较,确定图2中流出峰4为绿原酸。从图2可知,提取物浸膏中绝大多数杂质成分先于绿原酸流出,为了提
图3Fig3
HSCCC分离纯化得到的绿原酸HPLC及UV图HPLCandUVofchlorogenicacidpreparedbyH
SCCC
图4Fig4
HSCCC分离纯化得到的绿原酸MS图
MSspectraofchlorogenicacidpreparedbyHSCCC
4
结论
与热回流法相比,微波辅助提取金银花中的绿
4
activatedsubstancesinplants(高速逆流色谱在植物有效成分分离中的应用).ChinJPharmAnal(药物分析杂志),1998,18(1):60
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(本文于2009年12月15日修改回)
原酸具有选择性强,省时、高效、节能等优点,其粗提物无需初步纯化,可直接作为HSCCC分离的样品,
使操作更加简便、快速。以正丁醇-乙酸-水(4B1B5)为溶剂体系,经高速逆流色谱法一步分离纯化就可获得纯度为9812%的绿原酸。高速逆流色谱处理量大,适应性强,微波辅助提取结合高速逆流色谱技术,为金银花中绿原酸的分离制备提供了一种低成本、高效、节能的新方法。
参考文献
12
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YUANLi-ming(袁黎明),FURuo-nong(傅若农),ZHANGTian-you(张天佑).ApplicationofHSCCCintheseparationsof
日本国立感染症研究所胁田隆字教授一行访问中检所
2009年12月1日,日本国立感染症研究所病毒二部部长胁田隆字教授一行5人对中检所进行了访问并做了学术报告。中检所副所长王军志会见了来宾,细胞室主任王佑春主持了报告会。日方胁田隆字教授作了有关丙型肝炎病毒(HCV)研究的专题报告,随行的清水博之教授就EV71病毒研究进展向大家作了报告。
详见:www.nicpbp.org.cn