洋葱伯克霍尔德菌复合体的研究进展
临床检验杂志2008年第26卷第3期 Chinese Journal of Clinical Laborat ory Science, 2008, Vol 126, No 13 文章编号:10012764X (2008) 0320233203 中图分类号:R446. 5 文献标识码:A
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・综述与进展・
洋葱伯克霍尔德菌复合体的研究进展
李金钟(新乐市医院, 河北新乐050700)
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关键词:洋葱伯克霍尔德菌复合体; 分类; 鉴定; 耐药性; 流行病学; 治疗 洋葱伯克霍尔德菌复合体(B urkholderia cepacia co mp lex, BCC ) 是一组关系相近的非发酵革兰阴性杆菌, 广泛分布于自然界和临床环境。BCC 是机会致病菌, 常定植于囊性纤维化(cystic fibr osis, CF ) 、慢性肉芽肿(chr onic granul omat ous ) 患者的肺部, 是CF 患者的高毒力、高致命性病原菌, 也是引起抵抗力低下患者医院感染的重要病原菌。20世纪80年代中期, 20%的此类菌定植患者患有严重的进行性肺功能衰竭
(cepacia syndr ome ) 。由于并伴菌血症, 称为“洋葱综合征”
BCC 可在患者之间传播, 且对许多抗生素高度固有耐药(high intrinsic resistance ) , 因此对其感染治疗非常困难, 死亡率很高[1]。本文主要针对BCC 的分类、鉴定、耐药性、流行病学等问题进行综述。1 BCC 的分类
洋葱假单胞菌(Pseudo m onas cepacia ) 于1950年报道, 1992年, Yabuuchi 6r RNA Ⅱ——(B urkholderia ) , β亚纲(β2subdivisi on of the phylu m Pr ) 。自从该菌属确立后, 其分类经历了相当大的变化, 迄今, 至少由39个菌种组成。
Vanda mme 等经多相分类研究证明, 分离于CF 患者或其他来源的“洋葱伯克霍尔德菌(B. cepacia , BC ) ”菌株中, 至少存在5个不同的基因种(genom ic s pecies 或genomovars ) 。迄今, BCC 至少由9个基因种组成:洋葱伯克霍尔德菌(geno 2movars Ⅰ, G Ⅰ) 、多噬伯克霍尔德菌(B. m ultivorans ; G Ⅱ) 、椰毒伯克霍尔德菌(B. cocovenenans ; G Ⅲ) , 稳定伯克霍尔德菌(B. stabilis ; G Ⅳ) 、越南伯克霍尔德菌(B. vietnam iensis ; G Ⅴ) 、勉强伯克霍尔德菌(B. dolosa ; G Ⅵ) 、不明确伯克霍尔德菌(B. am bifaria ; G Ⅶ) 、B. anthina (G Ⅷ) 和吡咯伯克霍尔德菌(B. pyrrocinia ; G Ⅸ) 。2 BCC 的鉴定
临床微生物实验室对BCC 进行鉴定是困难的。目前, 尚缺乏一种应用简单的实验过程能实现对BCC 正确鉴定的方法。2. 1 表型试验 在常规临床实验室, 通常用选择培养基、常规生化试验和/或商品鉴定系统对BCC 菌株进行推测鉴定。常用的选择培养基有PCA (P . cepacia agar ) 、OFP BL (oxida 2ti on 2fer mentati on poly myxin 2bacitracin 2lact ose agar ) 和BCS A (B. cepacia selective agar ) 等。BCS A 在从CF 患者呼吸道标本分离BCC 和抑制其他菌过程中, 在速度(培养72h, 100%) 和质量(培养72h, 70%的分离菌生长良好) 方面优于PFP BL
和PCA 。但某些不属于BCC 的细菌, 如唐菖蒲伯克霍尔德菌(B urkholderia gladioli ) 和罗尔斯顿菌(Ralstonia ) 也能在BC 2S A 上生长, 因此有人推荐使用PC AT 或T B 2T 培养基(trypan
[2]
blue 2tetracycline ) 。但Ver m is 等研究发现, BCS A 和Mast
B. cepacia mediu m 是支持BCC 生长最有效的培养基, 而G Ⅵ
在PCAT 培养基上不生长。2006年, Vanlaere 等对Ste wart’s培养基进行了评价, 在该培养基上, 91. 7%(66/72) 的BCC 参考菌株显示黄色斜面2绿色底部的颜色反应(提示氧化葡萄糖和缺乏精氨酸双水解酶) 。, 、窄、() 和其他革兰阴性’s 培养基是一种
3]
、BCC 的鉴定往往失败, 常被错误、皮克特罗尔斯顿菌(Ralstonia pickettii ) 、产碱菌、假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、黄杆菌、华丽杆菌, 而这些菌株也同样可被错误地识别为BCC 。商品系统(包括V itek G N I Plus 、Re mel Uni 2N /FTek Plate 和N /F筛选) 有相对高的预测值, 但据此鉴定为BCC 的菌株应该进一步测试在BCS A 的生长, 蔗糖和侧金盏花醇的氧化, 氧化酶的存在, 溶血、色素产生以及42℃生长等情况。有一些表型试验可以将BCC 的成员、唐菖蒲伯克霍尔德菌、潘多拉菌、皮克特罗尔斯顿菌、木糖氧化产碱杆菌和嗜麦芽窄食单胞菌鉴别至种或基因种的水平。但菌种内的表型特征具有明显的异质性, 且不同的方法获得的结果之间可能存在一定差异, 因此, 仅依靠表型鉴定的BCC, 应送参考实验室进行更全面地分析。2. 2 分子生物学鉴定
2. 2. 1 全细胞蛋白质分析 Vanda mme 等报告, 用S DS 2P AGE 进行全细胞蛋白质分析, 对BCC 成员的鉴定是一项稳定的技术。但该法获得的鉴定结果与其他方法相比存在一定差异, 尤其是在G Ⅰ与G Ⅲ、G Ⅳ与G Ⅶ之间缺乏鉴别力。该方法在对蛋白质谱富有经验的研究机构中是鉴定BCC 有价值的工具, 但不适合临床实验室应用。2. 2. 2 全细胞脂肪酸分析 该法以高度自动化、相对简便、成本较低为优点, 是临床实验室对细菌进行鉴定的一项有价值的技术。但Vanda mme 等认为, 此技术不能区别BCC 的成员与唐菖蒲伯克霍尔德菌。此外, 在BCC 的成员与其他洋葱伯克霍尔德菌样菌如潘多拉菌和罗尔斯顿菌之间, 脂肪酸成分的性质和数量虽有一定差别, 但从标准差(standard devi 2ati ons ) 的角度来考虑, 这些差异不能满足鉴定至种的水平。
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作者简介:李金钟, 1963年生, 男, 副主任技师。主要从事临床细菌学检验与研究。E 2mail:lijzh001@sina . com 。
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4 BCC 的致病性和流行病学特征
2006年, Krej í和Kr oppenstendt [4]用Sherl ock 商品系统(M I 2
D I, I nc . ) 进行细胞脂肪酸甲基酯分析表明, 该方法可以对皮
克特罗尔斯顿菌和潘多拉菌进行鉴别, 并能进一步区分G Ⅸ、G Ⅶ和G Ⅴ。2. 2. 3 PCR 技术 关于BCC 鉴定的PCR 技术已见诸多报道, 如以16S 和/或23S r DNA 的核苷酸序列为基础的, 以及针对种和/或基因种特异性引物或16S r RNA 基因PCR 扩增的限制片段长度多态性(RF LP ) 分析等。这些方法对于G Ⅱ、G Ⅳ、G Ⅴ和G Ⅵ的鉴定是可用的, 但对于G Ⅰ、G Ⅲ和G Ⅶ则不能相互区别, 且缺乏对G Ⅷ和G Ⅸ的鉴定资料。以r RNA 操纵子为基础的PCR 技术可以鉴别G Ⅱ和G Ⅴ, 但不能对G Ⅰ与G Ⅲ、G Ⅰ与G Ⅳ进行鉴别。M ahenthiralinga m 等建立的PCR 扩增rec A 基因的RF LP 分析技术可以将G Ⅰ、G Ⅱ、G Ⅲ、G Ⅳ和G Ⅴ5个基因种完全进行鉴别, 并将G Ⅲ进一步分
[5]
为2个recA 亚群, 即Ⅲ2A 和Ⅲ2B 。Ver m is 等对以rec A 为基础的基因种特异性PCR (genomovar 2s pecific PCR ) 的敏感性和特异性进行评价。该方法对G Ⅱ和G Ⅶ的特异性和敏感性为100%, 对G Ⅲ的特异性和敏感性分别为100%和92%, 但对G Ⅰ缺乏敏感性(72%) , 且与所有G Ⅸ出现交叉反应。
[6]
Bald win 等选择7个保守的管家基因(conserved housekeep 2ing genes ) 用于多基因座序列分型(multil ocus ing,MLST ) 试验, 可区别当前所有的, 集的1193 BCC BCC , 对多黏菌素固有耐药, 其基础是它的外膜低渗透性、以及其他的耐药机制。如产生诱导型头孢菌素酶或主动外排泵系统等, 则更有助于形成低外膜渗透性。Beck man 和Lessie 指出, 该菌产生青霉素酶的特性与其他革兰阴性菌不同, 它不仅能水解青霉素, 并可利用β2内酰胺类抗生素作为碳源, 因而表现为对青霉素耐药。此外, 它产生的金属β2内酰胺酶, 对β2内酰胺酶抑制剂敏感性较差, 可水解包括碳青霉烯类在内的一大类β2内酰胺类抗生素。外膜上的膜孔蛋白能阻止亲水性抗生素通过, 因此天然耐β2内酰胺类和氨基糖苷类抗生素。BCC 还具有与铜绿假单胞菌泵出系统(mex A 2mex B 2o 2p r M ) 相同的外膜脂蛋白, 表现出对喹诺酮类抗生素和氯霉素也高度耐药[7]。国内研究表明, 哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、头孢他啶、头孢布
[7210]
烯、美罗培南和甲氧苄啶对BCC 有较高的活性。但Zhou [11]
等对分离于1257例CF 病人的2621株BCC 进行抗生素敏感性试验和协同试验表明, 米诺环素、美罗培南和头孢他啶的抑菌活性最高, 但仅分别为38%、26%和23%, 且抗生素联合应用的协同作用非常有限。由此可见, 对BCC 感染不能采用经验治疗, 应依据抗生素敏感试验结果选择有效抗生素治疗。此外, 近年研究发现, 硫醇铋(bis muth 2thi ols, BTs ) 、由1, 22双硬脂酰2右旋甘油232磷酸胆碱(1, 22distear oyl 2sn 2glycer o 232phos phocholine ) 和胆固醇化合而成的微脂粒抗生素制剂(li pos omal antibi otic f or mulati on ) 与妥布霉素均具有明显的协同作用[12213]; 重组人乳转铁蛋白(recombinant hu 2man lact oferrin, r HL ) 具有生长抑制作用和抗生物膜活性, 并可增强BCC 对利福平的敏感性[14]。
尽管BCC 的9个菌种均具有在CF 患者定植的能力。但并非所有菌株均具有交叉传染或引起致命性肺炎(fatal pneu monia ) 的能力。在CF 人群中, G Ⅲ感染的比率占明显优势, 如加拿大83%、美国50%、英国76%、葡萄牙的布拉格和里斯本分别为90%和52%、意大利61. 1%; G Ⅰ在澳大利亚为28. 6%; G Ⅱ在法国为51. 6%、美国为38%; 而G Ⅳ在斯洛伐克为54%[15216]。可见, 在CF 患者中, G Ⅲ是BCC 中分布最广泛、交叉感染最常见的原因, 但不是唯一引起交叉感染的菌种。
有一些标记可能与BCC 菌株的毒力和传播性有关, cbl A 基因编码大量的电缆式菌毛(giant cable p ili ) , 被认为是介导细菌在呼吸道上皮细胞上黏附的重要因素, BCES M (B. cepa 2cia ep ide m ic strain marker ) 即一个保守的1. 42kb 开放读码框(open reading fra me, ORF ) , 此外还有细胞外多聚糖(extracel 2
[17]
lular polysaccharide, EPS ) 等。Bevivino 发现, 在临床与环境菌株中, , 蛋白水解活性(p r ) (oni on tissue macer 2ati on ) , 基因仅见于G Ⅲ临床菌株, 而cbl G Ⅲ具有。在英国的贝尔法CF 患者BCC 感染中, cbl A 和BCES M 仅于G Ⅲ菌株中检出, 尽管在散发感染的G Ⅲ菌株中BCES M 阳性, 但缺乏cbl A 基因; 此外, 发生交叉感染的G Ⅱ菌株传播性标记物阴性。由此认为, cbl A 和BCES M 不能作为判定G Ⅲ或其他
[18]
BCC 是否具有传播性的绝对的标志物。G Ⅲ的起源具有高异质性(heter ogeneous ) , 依据rec A 基因的多态性, 至少由4个系统发育亚群(phyl ogenetic lineage ) 组成, 即ⅢA 、ⅢB 、ⅢC
[19][20]
和ⅢD 。Manno 等报道, 在G Ⅲ的4个rec A 亚群(rec A lineages ) 中, 大多数流行株(p ide m ic strains ) 属于ⅢA 和ⅢD, 仅几个患者含有ⅢB 菌株。BCC 感染CF 患者的死亡率明显高于未感染BCC 的CF 患者, 除G Ⅰ感染外, 所有死亡病例与G Ⅲ的出现相关。在G Ⅲ中, 属于ⅢA 和ⅢD 流行株感染患者的死亡率明显高于ⅢB 菌株感染者。但在ⅢA 与ⅢD 感染患者之间, 其肺功能、体重和死亡率没有明显差异。
BCC 感染很少发生在免疫功能正常的患者中, 但假流行(p seudoep ide m ics ) 和医院感染已见报道。自从1996年首次报道做膀胱镜时使用污染的水进行膀胱冲洗引起泌尿道BCC 感染暴发流行之后, 又多次报道因BCC 污染蒸馏水、医疗器械等引起呼吸道、泌尿道等部位的医院感染大流行。在我国, CF 的发病率较低, 引起BCC 感染的病例也相对较少。1996～2000年中国医科大学烧伤感染病原菌的分布显示, 前5年BCC 的检出率为0, 而后5年上升到8. 9%(67/749) 。孙仁华[22]报道, I C U 内86例机械辅助呼吸患者均存在严重的基础疾病, 共分离104株BCC, 主要来自呼吸道(77. 0%) 和血液(12. 5%) 标本; 连续3年观察发现, BCC 的菌株数呈逐年增加的趋势。吕火祥等[8]报道, BCC 的分离率从1997年的0. 08%上升至2003年的0. 51%。从病区分布来看, 其分离率以I CU 最高(48. 3%, 143/296) ; 主要来自呼吸道标本(65. 9%) , 其次为血液(12. 2%) 、尿液和引流液(4. 7%) 。可见, BCC 在我国主要引起抵抗力低下、非CF 患者的
[21]
临床检验杂志2008年第26卷第3期 Chinese Journal of Clinical Laborat ory Science, 2008, Vol 126, No 13 院内感染, 以I C U 为著。
应该引起注意的是, BCC 菌株作为生物防治(bi ocontr ol ) 和生物除污剂(bi ore mediati on agents ) , 可用于土壤传播植物致病菌的拮抗物(antagonists of s oil 2borne p lant pathogens ) 、植物生长促进剂(p lant gr owth 2p r omoting agents ) 以及对各种难以处理的生物异源物(recalcitrant xenobi otics ) 的生物除污, 这些菌株对CF 患者或免疫力低下人群感染的潜在危险尚不清楚[1]。此外, 由于BCC 菌株具有多重耐药性, 且对多类抗生素天然耐药, 一旦感染则很难根除。因此, BCC 菌种/基因种的正确鉴定以及加强对感染控制、临床转归、细菌毒力和易感宿主的研究, 对制定和落实严格的感染控制措施是至关重要的。参考文献:
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(本文编辑:杨林)