微波萃取-气相色谱法测定血液中甲基苯丙胺
浏览次数:184 日期:2010年2月27日 14:35
孙洪锋,谷学新1,王继芬2,倪为贵1,李文君2,李瑛2
( 1. 首都师范大学化学系,北京100037;2. 中国人民公安大学,北京 100038 )
摘 要:建立了人体血液中甲基苯丙胺的微波萃取-气相色谱(GC)测定方法。分别考察萃取溶剂种类、用量、pH值以及萃取温度、时间等因素对萃取率的影响。并与液-液萃取法进行比较。结果表明,在相同条件下,微波萃取率高于液-液萃取。甲基苯丙胺的最佳提取条件为:调血样pH为13,乙酸乙酯为萃取溶剂,微波控温 30 ℃保持 8 min,通过气相色谱-氢火焰离子化检测器(GC-FID)进行检测,平均萃取率达到 81.42%,相对标准偏差(RSD%)为6.4% ( n=5 ),仪器对甲基苯丙胺标准品的检测限为20 ng/mL。该方法对血液中甲基苯丙胺的最低检测限为 220 ng/mL。甲基苯丙胺和基体得到了很好的分离,该方法未对甲基苯丙胺进行衍生化,是一种快速,准确,灵敏度高的测定血液中甲基苯丙胺的方法。
关键词:微波萃取 气相色谱 甲基苯丙胺 血液
Determination of Methamphetamine of Blood by Microwave Extraction-Gas Chromatography
SUN Hongfeng1, GU Xuexin1, NI Weigui1, WANG Jifen2, LI Wenjun2, LI Ying2
( 1.Dpartment of chemistry, Capital Normal University, Beijing 100037, China; 2. Chinese People’s Public Security University, Beijing 100038, China )
Abstract: A method was developed for the determination of methamphetamine (MAM) in human blood with microwave extraction followed by gas chromatography (GC) analysis. In order to improve the extraction efficiency, experimental parameters on the extraction included such as extraction solvent and its amount, solution pH, extraction time and extraction temperature were investigated. Compared with conventional liquid-liquid extraction method, the microwave extraction showed better efficiency under the optimal conditions: acetic ether (pH 13) was used as extraction solvent, and extraction was performed at 30 ℃ for 8 min, after extraction the samples were detected with gas chromatography system. The average recovery of the developed extraction method was 81.42%, the RSD was 6.4%, respectively, and the limitation of detection was 20 ng/mL for MAM standard solution, the limitation of detection was 220 ng/mL for MAM in the blood solution. In our study MAM need not be derivatized and can be separated from matrix. Our results indicated that the developed method was rapid, accurate and sensitive, and can be used for the determination of MAM in blood samples.
Key words: microwave extraction; gas chromatography; methamphetamine; blood
甲基苯丙胺(methamphetamine, MAM)俗称冰毒。属于苯丙胺类兴奋剂的一种。其代谢产物为苯丙胺,大约有 45% 的甲基苯丙胺是以原体形式存在。近年来随着非法生产的急剧增加,滥用在全国迅速蔓延,给人类的身心健康和社会稳定带来了严重的影响。生物样品中甲基苯丙胺的提取方法基本上停留在液液萃取[1]、超声萃取以及加热回流等传统的方式上。近年来固相萃取[2],固相微萃取[3]和微波萃取技术[4],已经广泛应用于法庭和法医科学。其中微波辅助萃取技术是近年来发展起来的一种快速、高效、安全的萃取方法。
微波辅助萃取技术是基于不同物质对微波能的吸收程度不同,使基体物质中的某些区域和萃取体系中的某些组分被选择性加热,从而使被萃取物质从基体或体系中分离出来,进入到微波吸收能力较弱的萃取剂中[5]。微波辅助萃取已被广泛应用于生物[6],环境[7],食品[8]等样品的前处理。Franke等[4]利用微波辐射-气相色谱法(GC)测定了血液样品中利多卡因等药物的含量,国内也有利用微波衍生化-气相色谱-质谱法(GC-MS)测定毛发中苯丙胺类药物的报道[9],但目前关于生物样品中甲基苯丙胺的微波萃取方法还未见报道。本方法采用微波萃取技术,直接对人体血液中的甲基苯丙胺进行气相色谱法测定。为检测甲基苯丙胺中毒甚至死亡的案例提供科学的检测方法。
1 实验部分
1.1仪器、材料和试剂
Agilent 6890N气相色谱仪(美国安捷伦科技公司)配氢火焰离子化检测器(FID); MSP系列 微波萃取仪;氮吹仪;日立 20PR-520自动高速冷冻离心机(日本),最大转速 20000 r/min;HZS-D水浴振荡器(哈尔滨东联电子技术开发有限公司)
空白血(北京市血液中心)。甲基苯丙胺纯品(国家麻醉药品实验室),
甲醇(色谱纯)
乙酸乙酯,环己烷,氯仿,异丙醇,浓盐酸,无水甲醇,碳酸钠,碳酸氢钠,氢氧化钠均为分析纯
1.2色谱分析条件
色谱柱:HP-5 毛细管柱(30 m× 0.32 mm i. d. × 0.5 μm);柱温采用程序升温:120 ℃保持 3 min,以 10 ℃/min 升高到 180 ℃,再以 30 ℃/min 升高到 280 ℃ 保持 5 min;进样口温度 280 ℃;检测器温度 300 ℃。FID 检测器,载气:氮气,流速:2.0 mL/min, 分流比 15:1, 进样体积 1 μL。
1.3 标准溶液的配制
准确称取盐酸甲基苯丙胺 9.92 mg于 2.0 mL 容量瓶中,加 1 mL 色谱纯甲醇完全溶解后定容至2.0 mL,混匀、密封保存于 -20 ℃。将标准储备液稀释成1 mg/mL 和0.1 mg/mL 的标准溶液备用。
1.4样品前处理
1.4.1 微波萃取法
取 2 mL 血液于微波样品罐中,加 10 μL 1 mg/mL 的甲基苯丙胺的甲醇溶液。震荡摇匀,静置 2小时。加 1 mL NaCO3-NaHCO3 缓冲溶液(pH 10.83),滴加 2 滴1 mol/L NaOH。加入6 mL的有机溶剂,微波功率 85W按设定温度(30 ℃)进行微波萃取8 min,取出密封罐,冷却至室温。把反应液转移到离心管中,9000 r/min离心 10 min. 取上清液加 2~3 滴盐酸甲醇溶液,用氮吹仪在常温下吹干,100 μL甲醇定容。用 10 μL注射器取 1 μL进行GC/FID测定。
1.4.2 液液萃取法
取 2 mL 血液于密封锥形瓶中,加 10 μL 1 mg/mL的甲基苯丙胺的甲醇溶液。震荡摇匀,静置 2 小时。加 1 mL NaCO3-NaHCO3 缓冲溶液(pH 10.83),滴加 2 滴 1 mol/L NaOH。加入 6 mL的有机溶剂,震荡一定时间(8 min),转移至离心管中,9000 r/min离心10 min. 取上清液加 2~3 滴盐酸甲醇溶液,用氮吹仪在常温下吹干,100 μL甲醇定容。用10 μL注射器取 1 μL进行GC/FID测定。
1.5标准曲线的绘制
取 1 mL 甲基苯丙胺的对照品溶液(1 mg/mL), 用甲醇分别配制 1, 2, 4, 6, 8, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140 μg/mL 的系列标准溶液,进行GC/FID分析。以峰面积与浓度绘制标准曲线。
2 结果与讨论
2.1色谱条件的优化
在微波萃取和液液萃取中均加入10 μL 1 mg/L甲基苯丙胺,分别按1.4.1和1.4.2的方法处理样品。取1 μL进行GC/FID测定。经过对色谱条件的优化,微波萃取血液样品中的甲基苯丙胺可以与基体干扰很好的分离。如图1
图1 甲基苯丙胺的对照品0.1 mg/L(a)、液液萃取甲基苯丙胺(b)和微波萃取甲基苯丙胺(c)的色谱图
Fig.1 Chromatography of methamphetamine standard 0.1 mg/L (a), methamphetamine from liquid-liquid extraction (b) and methamphetamine from microwave extraction (c)
2. 2 微波萃取条件的优化
2.2.1 不同溶剂对萃取率的影响
分别取 6 mL 乙酸乙酯、环己烷、氯仿和异丙醇的混合溶液(9:1)作为萃取溶剂。其余步骤按 1.4.1 的微波萃取方法处理样品。实验结果表明:乙酸乙酯的提取率最高,与基体干扰可以很好的分离。环己烷的萃取率最低。在用氯仿和异丙醇的混合溶液与环己烷作为萃取溶剂时,MAM不能与基体干扰分离。
用氯仿和异丙醇作为萃取溶剂的混合溶液中,异丙醇在血液中溶解度比较大,吸收微波的能力比较强(异丙醇有较大的介电常数和电导率),从而提高了溶剂的活性,使溶剂和样品之间的相互作用增大,在萃取率提高的情况下基体中的干扰相应的增大,这与 Ganzler [10] 等人的研究成果相符合。环己烷的提取率偏低,因为环己烷属于非极性溶剂,其对微波能没有吸收,降低了溶剂和样品间的相互作用。并且考虑到氯仿的毒性比较大,故选择乙酸乙酯作为萃取剂。
2.2.2 萃取温度对萃取率的影响
取 6 mL 乙酸乙酯作为萃取溶剂,分别在 20,30,40,50,60,70和80 ℃ 下进行微波萃取,其余步骤按 1.4.1 的微波萃取方法处理样品。结果表明,在30 ℃时萃取效率最高(图2)。30 ℃后随着温度的升高,萃取率明显下降,并且基体干扰明显增多,温度达到 60 ℃ 以上时,目标化合物已经不能和基体干扰分开。血液中的红细胞和蛋白质在较高的温度下容易变性凝固,降低了血液中的甲基苯丙胺分子和有机溶剂的相互作用,导致了萃取率的降低。故选择30 ℃作为最佳萃取温度。
图2 温度对萃取率的影响
Fig.2 Effect of temperature on extraction
2.2.3 萃取时间对萃取率的影响
取 6 mL 乙酸乙酯作为萃取溶剂,在 30 ℃ 的萃取温度下,分别保持 2,4,6,8,10,12 min, 其余步骤按 1.4.1 的微波萃取方法处理样品。结果表明:随着时间的增加,萃取率明显增加,8 min 之后,萃取率增幅不大。故选择 8 min 作为萃取时间。
2.2.4 溶剂用量对萃取率的影响
分别取乙酸乙酯 2,4,6,8,10,12 mL作为萃取溶剂,在30 ℃的萃取温度下保持 8 min, 其余步骤按1.4.1 的微波萃取方法处理样品。结果表明:随着萃取溶剂用量的增加,萃取率明显增加,大于 6 mL 以后,萃取率变化不大。故乙酸乙酯用量选择 6 mL。
2.2.5 溶液pH值对提取率的影响
取 6 mL 乙酸乙酯作为萃取溶剂,在 30 ℃ 的萃取温度下保持 8 min,分别调节pH值为 9,10,11,12,13,13.4,13.7,其余步骤按 1.4.1 的微波萃取方法处理样品,结果表明:在溶液的pH值为13时,萃取率最佳(图3)。甲基苯丙胺在碱性环境下是以单体的分子形式存在,与萃取溶剂有较强的作用力,所以随着碱性的增强,萃取率升高。但在较高的碱性环境中(pH>13),血液中的红细胞和蛋白质变性,导致血液的粘稠度增加,回收率降低。故选择pH值为13。
图3 pH值对萃取率的影响
Fig.3 Effect of pH value on extraction
2.3 线性范围、回收率以及精密度的测定
以标准溶液的峰面积(y)对其进样浓度(x, μg/mL)作图,在 1~140 μg/mL 范围内呈良好的线性关系。Y=1.3757x-2.7946 , R2=0.9993 (n=5). 仪器对MAM标准品的最低检出限为20 ng/mL (S/N=3)。
取空白的血液2 mL 按1.4.1 的方法处理样品,从所得色谱图查出MAM 的保留时间处基线的噪音强度。根据工作曲线中最低浓度1 μg/mL色谱峰高和浓度的比值,计算出3倍基线噪音的血液中的MAM 的浓度。MAM微波萃取方法的最低检出限为220 ng/mL.
分别配制浓度为 5 μg/mL 的 MAM 全血溶液各 5 份,按 1.4.1 的最佳微波萃取条件和 1.4.2 液液萃取方法分别处理样品。样品的回收率按标准曲线计算。其回收率和精密度如表1
表1 甲基苯丙胺的回收率试验结果
Table.1 The results of recovery of methamphetamine
No.
added (μg)
measurement (μg)
recovery(%)
mean recovery(%)
RSD (%)
MWE
LLE
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
8.304
8.617
7.911
7.338
8.541
3.481
3.620
4.082
3.892
3.284
83.04
86.17
79.11
73.38
85.41
34.81
36.20
40.82
38.92
32.84
81.42
36.72
6.4
8.7
MWE: microwave extraction LLE: liquid-liquid extraction
3 结论
试验过程中,对微波萃取和液液萃取的方法进行了比较,结果表明:在相同时间内(8 min)微波萃取比液液萃取的提取率高,微波萃取也较少出现乳化现象。由于本实验是在密闭的聚四氟乙烯的密封罐中进行的,即使在较高的温度下,溶液也不会出现沸腾的现象,溶剂损失小。该方法安全,简单,快速,回收率高。为生物样品中苯丙胺类药物的前处理提供了一种快捷和实用的方法。
参考文献:
[1] Liu X Y, He X W, Wang J H. Modern Food Science and Technology (刘晓云,何小维,王继华. 现代食品科技), 2006, 22(1): 132
[2] Gong F J, Zhang R S. Journal of Forensic Medicine (龚飞君,张润生. 法医学杂志), 2006, 22(5): 353
[3] Fucci N, De Giovanni N, Chiarotti M. Forensic Science International, 2003, 134: 40
[4] Franke M, Winek C L, Kingston H M. Forensic Science International, 1996, 81: 51
[5] Pare J R J, Belanger J M R, Stafford S S. Trends in Anal Chem, 1994, 13 (4): 176
[6] Liu K L, Zhang C S, Zhou S G, Bai Y P, Shen W F, Li W J. Part B: Chemical Analysis(刘克林,张春水,周淑光,白燕平,沈伟峰,李文君.理化检验-化学分册), 2003, 39(1): 20
[7] Hao J Y, Huang R H, Wang P Y, Deng X. Pesticides(郝金玉,黄若华,王平艳,邓修.农药),2001, 40(8):15
[8] Zuloaga O, Etxebarria N, Fernández L A, Madariaga J M. Talanta, 1999, 50:345
[9] Zhu D, Meng P J, He H Y. Chinese Journal of Chromatography (朱丹,孟品佳,何洪源。色谱 ), 2007, 25(1): 16
[10] Ganzler K, Szinai I, Salgo A. Chromatogr, 1990, 520(1): 257
Nadia Fucci*, Nadia De Giovanni, Marcello Chiarotti