丛枝菌根真菌系统分类及群落研究技术进展

应用生态学报 2010年6月 第21卷 第6期 Ch i nese Journa l of A pp lied E co logy , Jun . 2010, 21(6):1573-1580

丛枝菌根真菌系统分类及群落研究技术进展

刘永俊 冯虎元

1, 2

2**

*

(1西北民族大学生命科学与工程学院, 兰州730030; 州730000)

2

兰州大学生命科学学院, 干旱与草地农业生态教育部重点实验室, 兰

摘 要 丛枝菌根真菌(AMF) 是自然生态系统重要的组成部分, 能与植物根系形成互惠共生

体. 传统的AMF 分类主要依赖于对土壤无性孢子的形态鉴定, 具有一定的局限性. 近年来基于核酸分析的分子鉴定技术使AMF 的分类更具科学性和准确性, 补充和完善了基于孢子形态鉴定所建立的分类系统. AM F 群落研究依赖于AMF 的分类鉴定, 主要包括孢子形态鉴定和分子生物学分析两类研究法. 本文综述了AMF 的分类系统和群落研究方法, 着重介绍了近年来应用较多的AM F 群落研究的分子生物学技术. 作者认为, 采取形态与分子相结合的办法将有助于推动AMF 群落研究和AM F 自然分类系统的建立和完善. 关键词 丛枝菌根真菌 分类 孢子 分子技术 群落

文章编号 1001-9332(2010) 06-1573-08 中图分类号 Q938. 1 文献标识码 A Syste m atic classification and comm unity research techni q ues of arbuscular m ycorrhizal

1, 221

fung:i A revie w . LI U Yong j u n , FENG H u yuan (C ollege of L i f e Science and Engineering,

2

N orthw est University for N ationalities , Lanzhou 730030, Ch i n a; M i n istry of Educa tion K ey Labora tory o f A ri d and Grassland Agroeco logy, S chool of L i f e Sciences , Lanzhou University , Lanzhou 730000, China ). Chin. J. App l . E col . , 2010, 21(6):1573-1580. A bstract :A r buscular m ycorr h izal f u ng i (AMF) are an i m portant co m ponen t o f natural ecosyste m , being able to for m sy m biont w ith plan t roo ts . The trad iti o na lAMF classification ism ainly based on the m or pholog i c al identification of so il asexual spores , w hich has so m e li m itati o ns in the taxono m y o f AMF . Advanced m o lecu lar techniquesm ake the c lassification ofAM F m ore accurate and scientific , and can i m pr ove the taxono m y o fAMF estab lished on the basi s ofm orpho log ica l identification . The co mm un ity research of AMF is m ainly based on spec ies classificati o n , and has t w o k i n ds o f investi gation m ethods , i . e . , spores m orpho log ica l identifi c ation and m o lecu lar ana l y sis . This paper re v ie w ed t h e research progress i n the syste m atic classificati o n and co mm un ity researc h techn i q ues o f AMF , w it h the focus on the m olecular techn i q ues i n co mm unity analysis o fAMF . Itw as considered tha t using m o r pholog ical and m olecular m ethods together would redound to the acc urate i n vesti g ation o fAMF co mm un ity , and also , fac ilitate the i m pr ove m ent ofAM F taxono m y . K ey words :arbuscular m ycorr h izal fung; i taxono m y ; spore ; m o lecu lar techn i q ue ; co mm un ity .

丛枝菌根真菌(arbuscu lar m ycorrh iza l fung , i AM F) 能与绝大部分植物的根系形成互惠共生体, 是与植物关系最密切的微生物之一, 它对植物群落乃至整个生态系统的重要作用越来越受科学家的关注

[1]

类等工作存在很大的困难, 从而进一步影响了AMF 群落组成及多样性等研究. 虽然如此, 经过一百多年的发展, AM F 的研究已经取得一定的进展, 包括AMF 种类鉴定、分类系统的建立以及群落多样性的研究等. 近年来, 分子技术已广泛应用于AM F 的种类鉴定以及群落研究, 这使得目前的AMF 分类系统有较大的调整和改变, 群落研究技术也日新月异; 因此, 系统地总结目前AM F 分类系统和群落研究技术的进展有助于今后我们更好地开展AMF 基础研究. AM F 是专性营养共生的土壤微生物, 目前还

不能进行纯培养, 这使得AMF 的种类鉴定及系统分

*国家自然科学基金项目(30870438, 40930533) 、教育部新世纪人才

计划项目(NCET 07 0390) 和高等学校博士点基金项目([1**********]) 资助. **通讯作者. E m ai:l fenghy @lzu . edu . cn 10 .

1574应 用 生 态 学 报 21卷

1 AMF 分类系统

从Tu lasne 兄弟1844年第一次基于土壤孢子形态特征描述G lo mus 属至今, 许多学者在AM F 的分

[1]

类研究上做了大量的工作. 常规的AMF 分类鉴定主要是依赖于土壤中AM F 无性孢子的形态特征. 在此基础上, 1990年M orton 和Benny 提出球囊霉目(G lo m ales) 的分类系统; 他们把AMF 列为接合菌纲(Zygo m ycetes) 中的1个目, 下设2亚目3科6属. 这一分类系统总结了以往的研究结果, 并在20世纪90年代盛行. 然而, 有部分AM F 种类很难划分到上

[3]

述这一分类系统中; 因此, M orton 和R edecker 于2001年利用分子和形态双重证据对旧的分类系统进行了部分修正, 增加了原囊霉科(Archaeosporace ae) 和类球囊霉科(Parag lo m aceae).

进入21世纪后, 基于分子生物学的技术应用于AM F 的分类研究, 使得目前的AM F 分类系统更具可靠性和科学性, 并导致AMF 的分类系统发生突破

[4]

性的改变. 2001年, 德国Sch ler 等对69种AM F 的18S r DNA 序列进行分析, 发现AMF 与接合菌门、子囊菌门和担子菌门中的真菌具有共同的起源, 据此他们把AMF 的分类地位提升至门, 并命名为球囊菌门(G lo m ero m ycota ), 下设1个纲(球囊霉纲G l o m ero m ycetes), 4个目(球囊霉目G lo m era les 、类球囊霉目Parag lo m erales 、原囊霉目A rchaeospora les 、多孢囊霉目D iversi s pora les), 7个科(球囊霉科G l o m eraceae 、类球囊霉科Parag l o m eraceae 、原囊霉科A rchaeosporaceae 、地管囊霉科Geosiphonaceae 、无梗囊霉科A cau losporaceae 、多孢囊霉科D i v ersisporace

[5]

ae 、巨孢囊霉科G i g asporaceae). 2004年W al k er 等

表1 最新AM F 分类列表[8]Tab . 1 Updated c l assification list of A M F [8]

目O rder G lo m eral es Divers i sporales

科Fa m il y G l o m eraceae G i gasporaceae Scu t ellos poraceae Racocetraceae Den tiscutataceae Acaulos poraceae En trophosporaceae Paci sporaceae D i versis poraceae

Paraglo m era l es A rchaeos porales

Parag l o m eraceae Geos i phonaceae Amb is poraceae Archaeosporaceae

属Genus G lo mu s G i ga s pora

[2]

从分子、形态和细胞学特征上发现G lo m us sci n tillans (现名为P acis p ora scintill a ns ) 与巨孢囊霉科亲缘关系更近, 因此提出多孢囊霉目下出现一个新的科, 名为G er de m ann i a ceae , 后被更名为Pac isporaceae .

[7]

2007年W alker 等又在原囊霉目中增加1个科Am b ispo raceae . 2009年, Sch ler 对AMF 的分类系统进行了总结, 共有4个目13个科19个属214个种(表1). 其中, 球囊霉科(G l o m eraceae) 是种类最多的1个科, 下设1属, 包括105种; 而多孢囊霉目(D iversispora les) 包括8个科, 其中Racocetraceae 和Dentiscutataceae 这两个新科包括5个属共20多种. 许多新科、新属的出现, 将大大冲击AM F 群落多样性的研究. 2 A M F 的种质资源

AMF 在地球上至少存在了4 6亿年之久

[9]

[8]

[6]

, 伴

随了植物的整个进化历程. 目前报道的AM F 种类数量200余种, 而高等植物近30万种之多. 如此少量的AM F 是如何与数量庞大的植物产生共生体呢? 重要的原因可能要归咎于AMF 不具有严格的宿主专一性, 然而现在越来越多的研究证明AMF 与

[11-12]

宿主之间具有选择偏好性, 这在一定意义上说明不同种植物根系的AMF 群落是具有差异的. 假如AMF 的宿主专一性是一种普遍存在的现象, 那么可以推测还有许多难以培养和鉴定的AMF 新种等待我们去发现, 或者是我们没有把在生理、功能上具有显著差异的一些AM F 种类区分开来

[11]

2

[10]

[10]

. B ever

等以1hm 面积的农田撂荒地为样地, 经过长达5年时间的调查研究, 发现的AMF 种类从第一年的11种上升至第五年的37种, 其中三分之一为从未

种数Species num ber

1059109&57&4&134&2274&13181&1

S c u tellospora

Racocetra &C etra s pora

Dentisc u t a t a &Fusc u t a t a &Qua t un ic a Acau los pora &Ku kl ospora En troph ospora Pac is pora

Diversispora &O t os p ora Parag lo mu s G e osi ph on Am bispora

Arc haeos pora &Intra s pora

6期 刘永俊等:丛枝菌根真菌系统分类及群落研究技术进展 1575

描述过的新种. 如此多的AMF 新种未被揭示, 表明AM F 的真正种类数量可能要比我们目前已知的多得多; 甚至有人提出在任何一个生态系统中, AM F 的种类数量可能与该系统中植物的种类数量相[13]

当. 我们可以预见, 随着AMF 研究的深入, 特别是对不同生态系统、不同宿主的AM F 群落长期的研究将会进一步探明AMF 种类数量这一问题, 届时现有的AMF 分类系统也将会面临全面的修正和挑战. 3 AMF 的群落研究

针对AMF 的研究历史至少有100多年, 但迄今为止我们对这种广泛存在的真菌还未有比较详细的了解, 对它在自然生态系统中的分布情况更是所知甚少

[1]

孢子的病变或感染、孢子的不同发育阶段等因素严重影响了孢子的准确鉴定, 因此, 对AMF 孢子进行扩繁是非常必要的, 这不仅可以增加孢子的数量, 而且可以得到便于鉴定的新生孢子. 然而, 扩繁策略也并不能完全准确地反映野外样品中的AMF 群落组成, 有时候在原初接种物中存在的AM F 种类在盆栽扩繁后却没有再出现, 也就是说有某种因素抑制了这类AMF 的萌发与繁殖, 这些因素可能包括AMF 的宿主特异性、季节性或者其他一些非生物因素

[11, 17]

.

无论是直接利用野外样品还是通过扩繁培养来进行AM F 群落研究都非常耗时耗力, 同时该方法对研究者的AMF 分类学知识要求很高; 虽然说AMF 分类学知识很容易理解和学习, 但是却很难掌握, 很大程度上依赖鉴定者的个人经验. 此外, 孢子作为AMF 的一种繁殖幸存体, 土壤中孢子的群落与植物根系中AM F 定殖情况大多时候是不一致的; 例如L i u 等在对黄土高原人工柠条林的AM F 群落进行研究时发现, S cutellos pora calos p ora 孢子在土壤中丰度很高, 但该种AMF 却未在柠条根系中定殖. 因此, 基于孢子形态的传统方法不能够准确地反映AMF 群落组成的变化及其在植物根系中的定殖情

[19-20]

况, 该方法具有一定的局限性. 3 2 分子生物学方法

目前, 许多新的技术在AMF 群落研究中得到大量的应用, 其中基于核酸分析的分子生物学技术被认为是很有前途的一种分析方法

[21-22]

[18]

. AMF 在不同生态系统、不同宿主和不同时

空阶段的群落组成到底是种什么样的情况, 这个问

题一直是菌根学界所关心的命题, 人们希望通过对AM F 群落的广泛研究去探究AM F 在自然界中的真实情况以及其对生态系统的重要作用. 目前, AM F 群落的研究方法多种多样, 但主要包括孢子形态鉴定、免疫化学法、脂肪酸法以及基于DNA 分析的分子生物学法

[14]

. 其中, 孢子形态鉴定和分子生物学

法是两种常见的AM F 群落研究方法; 这两类研究法各具优缺点, 但相对来说, 目前分子生物学法更广泛地应用于AMF 的群落研究.

3 1 传统形态学方法

AM F 群落的研究, 很长一段时间都是依赖于对土壤中无性孢子的分离鉴定与孢子计数. 这种方法主要包括以下几个步骤

[15]

. 这种方法直

:1) 收集有代表性的土壤接以样品中提取的核酸为模板, 利用特异性引物对特定基因区域进行扩增, 通过结合其他的分子标记技术或直接克隆测序进行AMF 群落结构分析, 这在很大程度上避免了基于孢子培养和形态鉴定以及其他生化方法的局限性

[19, 22-23]

样品(在野外, 大部分的AMF 孢子存在于表层土壤中(0~30c m ), 但也有部分种类的AM F 孢子在深层的土壤中存在, 甚至在50~70c m 土壤中仍然具有很高的AMF 多样性, 并且是与表层土壤中完全不同的AMF 种类); 2) 利用湿筛法和蔗糖密度梯度离心法分离土壤中的孢子; 3) 在体视镜下对分离得到的孢子混合物进行归类整理, 将外形相似的孢子归为一类; 4) 对每一类孢子进行观察鉴定并计数(孢子的鉴定可参考最新的一些分类标准和信息; 国际丛枝菌根真菌保藏中心(I N VAM; http ://i n va m. ca. f wvu . edu) 和波兰的Janusz B laszko w ski(ht tp ://www. agro . ar . szczeci n . pl/~j b laszko w ski) 在这方面做了大量的工作, 他们对AMF 不同种属的孢子特征等作了详细的描述, 对AM F 孢子分类鉴定具有非常重要的参考价值).

, [16]

.

3 2 1AM F r DNA 基因与特异性扩增引物 目前应用于AM F 群落研究的分子技术主要是基于对AMF r DNA 基因的序列分析, 这种技术在AMF 分子鉴定及群落研究等方面均取得很大的成功. r DNA 基因不仅含有高度保守区域, 还含有变异区域; 高度保守区域便于设计扩增引物, 而通过对变异区域的碱基突变分析可以在不同分类水平上对AM F 进行区分. 因此, 在对AM F 进行群落研究时, r DNA

[21]

基因是非常理想的目标基因. S i m on 等最早从事这方面工作, 他们通过设计特异性引物成功地从G lo mus intrarad ices 和G igas p ora margarita 孢子样品G lo [22]

[22-24]

1576应 用 生 态 学 报 21卷

AM F 18S r D NA 部分基因片段. 迄今为止, 针对于AM F r DNA 基因已经发展出许多对引物(图1), 主要包括对r D NA 编码区(5 8S r DNA, 18S r DNA, 28S r DNA ) 和内转录间隔区(I n ter nal transcri b ed space ,

[22]

I T S) 部分片段的特异性扩增.

对于AMF 群落研究来说, 我们所需要的是能够特异性扩增所有AM F 种类, 但不能扩增宿主植物和其他真菌DNA 的引物对. 1998年, H e l g ason 等设计了一个AMF 特异性引物AM 1, 并且利用AM 1/NS31这一对引物进行了AM F 群落分析; 其中NS31是真核通用引物, 而AM 1是只能特异性扩增AM F 18S r DNA 的引物(图1). AM 1/NS31是近十年来AM F 群落研究中使用最多的引物对之一, 利用这对引物同时结合其他的分子技术已对各种各样生态系统中的AM F 群落进行了广泛研究. 然而, 随着研究的深入, 特别是许多新的AMF 种类的发现以及r DNA 序列的测定, AM 1的局限性开始显露. 首先, AM 1并不能扩增所有科属的AMF ; 其次, AM 1能够扩增出部分非AM F 真菌甚至植物基因组的r DNA 序列范围, San tos 等

[29]

[18]

[26]

[18, 20, 23, 25-28]

[25]

AMF 的混合引物(图1); 每一个混合引物分别由2~5个单独的引物按等摩尔比混合而成, 其中两个正向混合引物(SSUmA , f SSUm C f) 位于18S 区域, 两个反向混合引物(LSUmA r , LS Um Br) 位于28S 区域, 因此, 这几套引物涵盖了部分的18S 、28S 以及所有的I TS 和5 8S r DNA 区域, 具有更高的分辨率. 3 2 2聚合酶链反应(PCR ) PC R 技术使我们可以通过对AM F 样品(孢子、土样、根样) 中提取的核酸进行有效的目的片断扩增, 这种技术在对AM F 检测、鉴定以及群落研究中具有很大的应用价值. 然而, 在实际应用中, 特别是从根际土壤、根样中提取的DNA 样品, 经常含有一些抑制扩增的物质(例如腐殖质、多酚类化合物) 从而导致扩增效果不理想

[32]

. 针对这种情况, 目前已经发展了许多策略来

减弱这种抑制效果, 例如用交联聚乙烯比咯烷酮(polyviny l polypropy l e ne , PVPP) 对核酸样品进行纯化, 加入脱脂奶粉, 对样品进行稀释以及采用N es ted PCR 策略等. 另外, 值得注意的是, 在PCR 过程中, 有些模板会被优先退火和扩增, 也就是说不同模板在同样的扩增体系中扩增效率会有所差异. 此外, 不同DNA 聚合酶的扩增效率和错误掺入率也是不尽相同的, 具有高保真度的Pfu DNA 聚合酶在AMF 研究中是使用最多的一种聚合酶, 但是也有些人认为Taq DNA 聚合酶的错误掺入率不足以影响最后的研究结果.

近年来, 一种新的PCR 技术, 实时荧光定量PCR(quantitati v e rea l ti m e PCR, qRT PCR) 开始应用于AMF 的研究. A lkan 等

[36]

[35][33-34]

. 为了增加引物对AM F 的涵盖

在AM 1的基础上设计了一个混合

引物(AM1、AM 2和AM 3), 能够扩增以往AM 1匹配

较差的G lo m us group B 和D i v ersisporaceae . 除了AM 1/NS31以外, 针对于r DNA 的不同区域(包括I T S 、5 8S 、18S 、28S) 以及其他功能基因区域已经设

[22]

计并应用了多对引物, 许多新的引物也正不断地被设计和应用. 2008年, 英国York 大学的Lee 等

[30]

设计了一对应用于AMF 群落研究的新引物:AM L1/AML2(图1); 这对引物具有更高的特异性, 能覆盖除Archaeos pora trapp ei 以外的所有已知AM F. 最近, Kr ger 等

[31]

利用qRT PCR 对G. in

traradices 在植物根系中的定殖情况进行研究, 发现

该技术是一种非常迅速、灵敏并可定量测定AM F 在植物根系中定殖情况的方法. 虽然qRT PCR 技术目前未被用于AMF 的群落研究, 但该技术目前已经成功地应用于其他微生物群落结构研究; 因此, qRT PCR 技术今后很有可能成为AMF 群落研究中的一种有力工具.

3 2 3PCR 产物的分离技术 从根样或者土样中提取的AMF, 其DNA 是多种AM F 种类的混合基因组, 当我们利用PCR 对DNA 样品进行扩增后, 得到

[37-38]

也设计了4个能扩增

所有

图1 rDNA 和引物定位示意图

F i g . 1 D eta ils o f rDNA genes and locati on of pr i m ers .

I GS :基因内间区Intergenic s p ace ; I TS :基因内转录间隔区In t ernal transcri bed space ; NS31/AM 1、A M L1/AML2、SSUmA f/LSUmAr 和SSUmC f/LSUmBr 为引物NS31/AM1, A M L1/AML2, SSUmA f/LSUmA r and SSUmC f/LSUmBr are pri m ers . 参考Reddy 等[22], H el gas on 等[25], Lee 等[30]和K r ger 等[31]绘制Adap t ed fro m R eddy et a l . [22], a [25], et l . [30]K r . [31]

的PCR 产物是大小相近但序列各异的多种目的片断的混合物; 因此, 需要对这些混合的DNA 片断进

行分离. 对PCR 产物的分离可以通过克隆筛选和电泳等技术来实现.

PCR 产物可以直接进行转化克隆, 然后利用限

6期 刘永俊等:丛枝菌根真菌系统分类及群落研究技术进展 1577

限制性片段长度多态性(restricti o n fragm ent leng th po l y m orph is m , RFLP) 的类群进行测序, 从而可以达到对混合PCR 产物的分离分辨效果. 目前利用这种技术已经在AMF 群落研究中得到了广泛的应[10, 12, 20, 25-26, 28, 39]用. 然而, 利用RFLP 来分析AMF 群落结构的方法比较繁琐, 需要对大量的克隆库进行筛选(例如H usband 等

[12]

[39]

的温度变性特征来达到分离目的. 理论上, DGGE /TGGE 图谱中的每一条带, 都是具有唯一序列组成的DNA 条带, 代表了一个种类; 但是在实际的应用过程中, 单一条带也可能是几种相近DNA 序列的混

[23]

合物. SSCP 是与上述两种梯度凝胶电泳完全不同的技术, 它是利用DNA 单链的构象差异来分离大小相同但序列不同的DNA 片段. SSCP 能够灵敏地对只有几个碱基差异的DNA 片段进行分离, 因此, 在AM F 群落研究中经常被用作为测序前对大量DNA 序列样品的分离筛选以及对AM F 群落的监控.

3 2 4DNA 序列测定与系统发育分析 通过特定的分子技术对混合的PCR 产物进行分离后可以部分地反映样品中的AM F 群落结构, 但单纯利用分子标记的遗传多样性来代表AMF 群落多样性具有一定的缺陷. 其一, 由于AMF 具有种内r DNA 异质性, 即对同一AMF 菌种(株) r DNA 特定区段进行PCR 扩增都可能产生多种DNA 序列; 其二, 在PCR 过程中, 由于引物特异性及其他的原因可能会产生一些非AMF 的序列和嵌合序列(chi m er ic se quence)

[18]

[54-55]

[51-53]

筛选了1300多个克隆;

V andenkoornhuyse 等筛选了2001个克隆). 近年

来, 在RFLP 分析基础之上发展了一种新的分析方法, 叫做末端限制性片段长度多态性(ter m ina l re striction frag m ent length po ly m or phis m s , T RFLP ). T RFLP 是一种高灵敏、重复性好的分子技术, 最早由L i u 等

[40]

引入微生物群落研究领域, 适合对大批量

的样品进行分析比较. T RFLP 的主要技术流程是:利用5 末端荧光标记的特异性引物对样品DNA 进行扩增, 扩增产物纯化后进行限制性酶切, 酶切产物直接上测序仪进行测序, T RF(标记的酶切片断) 片段大小以及信号差异可以利用电脑软件显示出来, 最后通过对T RF 片段大小及其相应的峰值分析来反映样品中的群落结构. 从创立至今, T RFLP 技术在微生物生态学研究中一直受到很高的评价, 并已在AMF 群落研究中得到大量的

[41, 45]

应用, 但是该技术也存在一定的技术缺陷, 容易产生虚假的结果

[46]

[42-44]

[40-41]

; 其三, 所有的分子技术均具有一定的缺

陷性; 因此, 通过各种分子技术分离出来的PCR 产

物, 应该进行DNA 序列的测定和系统发育分析, 只有这样才能最大限度地反映AM F 群落的真实情况. 值得一提的是, 目前有部分研究者在研究经费充足的情况下, 通过构建克隆文库并对所有克隆进行测序

[56]

. 此外, 进行T RFLP 分析需要

一套昂贵的测序仪及分析软件系统, 许多研究者并

不具备这样的条件, 这在一定程度上也限制了该方法的广泛应用. 总的来说, RFLP 和T RFLP 都是基于限制性酶切片段长度多态性的分析方法, 在使用时需注意限制性内切酶的选择, 最好选择几套内切

[43-44]

酶和DNA 区段的组合来进行分析.

在变性梯度、温度梯度或者依据不同DNA 序列具有不同的单链分子构象从而具有不同的迁移率等原理可以把大小相同但序列组成不同的DNA 片段在凝胶电泳中进行分离, 这3种分离技术分别称为变性梯度凝胶电泳(denaturi n g gradient gel e lectro phoresis , DGGE ) 、温度梯度凝胶电泳(te m perature grad i e nt ge l e lectrophoresis , TGGE ) 和单链构象多态性(si n gle strand confor m ation poly m orphis m, SSCP). 其中, DGGE 是目前应用于微生物群落研究最广泛的一种技术, 它是利用化学变性对大小相同但序列不同的DNA 片段进行分离. DGGE 技术于1993年开始应用于环境微生物的群落研究

[47]

, 或者直接利用PCR 产物进行454测序

[57]

, 从

而不通过分子标记方法来进行PCR 产物筛选, 这种策略可以更准确地反映样品中AM F 群落结构的真实情况. AM F 的系统发育分析可参考德国Sch ler 研究组构建的模式系统发育树

[8]

, 选用一些不同科

属的AM F 代表菌种的DNA 序列作为参考序列, 可以很好地将我们新获取的DNA 序列进行系统发育分析, 从而便于划分AMF 分子种(例如文献[58]). 4 结 语

AMF 分类系统的建立对群落研究具有非常重要的作用, 在揭示群落结构方面具有不可替代的功能. 目前AMF 的系统分类工作已经取得很大的进展, 但随着研究的深入, 特别是对不同生态系统、不同宿主、不同时空阶段等的AMF 群落研究, 将反过来促进AMF 分类系统的补充和完善. AMF 作为自然生态系统的重要组成部分, 它在生态系统中的作, , 从1997年

开始广泛地应用于AM F 群落研究. , [18, 23, 27, 48-50]

1578应 用 生 态 学 报 21卷

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[2010 03 13].

http :

//www.

(2009 04 16)

co m,

a m f phy l ogeny .

们了解这种特殊的共生微生物, 进一步阐明其生态功能. 在AM F 群落研究中, 基于土壤孢子的传统形态学方法不能够准确地反映群落组成的变化及其在植物根系中的侵染情况, 但是这种方法可以使我们获得AMF 菌株, 从而为菌根技术的应用提供优质的

种质资源. 分子技术在一定程度上能够较快速且准确地反映AMF 的群落结构, 但该方法过分地依赖PC R 技术和DNA 序列分析, 特异性引物以及分子标记方法的局限性都很容易使AM F 群落研究得出许多片面的结论; 另外, 单纯地利用分子技术进行AM F 群落研究并不能获得AMF 菌株(只能得到分子种), 不利于发现AM F 新种以及进一步的应用研究. 目前大部分的AM F 群落研究都是采用成本较高的分子技术, 而往往忽视对土壤孢子的分离鉴定, 最终结果将是大量的DNA 序列堆积, 但分离鉴定的菌株却寥寥无几. 这种现象不利于我们探明和合理利用AM F 的种质资源, 对AMF 分类系统的完善也作用甚微, 毕竟AM F 的系统分类工作需要孢子形态鉴定和分子鉴定双重证据. 因此, 从长远角度来看, 采取形态与分子相结合的办法进行AMF 群落研究不仅有助于完善AM F 分类系统, 而且能够增强AM F 研究的可持续性.

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作者简介 刘永俊, 男, 1979年生, 博士研究生, 讲师. 主要

从事菌根生物学、微生物生态学研究. E m ai:l li uy j863@g m a i. l com 责任编辑 肖 红