油镜的使用
实验一 油镜的使用、革兰染色及特殊结构的观察
细菌个体微小,必须借助显微镜来观察其形态结构。但是活细菌为无色半透明状态,在普通光学显微镜下不易观察清楚,常用染色的方法使细菌着色,使之与背景形成鲜明对比,再在显微镜下观察,可清晰的看到细菌的形态、大小、排列和某些特殊结构。观察细菌的形态与结构是进行细菌鉴别的方法之一。
目的和要求:
1、熟悉显微镜油镜的使用方法。
2、学习使用显微镜油镜观察细菌的特殊结构
3、学习革兰染色法
实验材料:
标本片、显微镜、香柏油、擦镜纸、二甲苯。
实验原理:
使用油镜时,需在玻片上滴加香柏油。这是因为油镜的放大倍数较高,而透镜很小,光线通过不同密度的介质物体(玻片→空气→透镜)时,部分光线会发生折射而散失,进入镜筒的光线少,视野较暗,物体观察不清。如在透镜与玻片之间滴加和玻璃折射率(n=1.52)相仿的香柏油(n=1.515),则使进入油镜的光线增多,视野亮度增强,物象清晰。
实验方法及注意事项:
1、用油镜时,勿将镜臂弯曲倾斜,以免油滴或菌液流淌外溢,影响观察造成污染。
2、用低倍镜对光,自然光线用平面镜(光源不宜采用直射日光,因直射日光的强度太大容易刺激眼睛),人工光源用凹面镜,同时调节集光器和光圈以获得最适亮度。染色标本油镜检查时,应将光圈完全打开,集光器上升至载物台相平,使光亮度很强。
3、标本片放在载物台上,用标本推进器或压片夹固定。
4、低倍镜找出标本的范围,然后在待检部位上加一滴香柏油,转动镜头转换器,将油镜头置于工作位置,从侧面观察并缓慢转动粗调节器,使油镜头浸没在油滴内,当油镜头几乎接触玻片时停止转动,然后眼睛移至目镜,缓慢向上移动粗调节器(只应上升,不能下降,以免压碎标本和损坏镜头),待看到模糊物象时,再用细调节器转动至物象完全清晰为止。
5、观察完毕,取下标本片,立即用擦镜纸顺一个方向旋转擦拭镜头上的油。若油已干,应先用二甲苯滴在擦镜纸上擦净镜头,再用另一干净擦镜纸拭去镜头上沾有的二甲苯。
6、显微镜擦净后,降低物镜并将其转成八字形,集光器下降,反光镜推平,光圈关上,归还显微镜室。
革兰染色法(Gram stain ):革兰染色法是丹麦细菌学家革兰(Christain Gram)于1884年发明的。至今已逾百年,但仍在广泛使用,是细菌学中最为经典的染色法。
原理
革兰染色法的原理目前尚不完全清楚,主要有三种学说;
①等电点学说:革兰阳性菌等电点(pH2~3)比革兰阴性菌(pH4~
5)低,一般染色时染液的酸碱度在pH7.0左右,电离后阳性菌所带负电荷比阴性菌多,因此与带正电荷的结晶紫染料结合牢固,不易脱色。
②通透性学说:革兰阳性菌细胞壁结构比较致密,肽聚糖层厚,脂质含量少,乙醇不易透入,反而可使细胞壁脱水而形成一道屏障,阻止染料向细胞外渗。革兰阴性菌细胞壁疏松,肽聚糖层很薄,而外膜、脂蛋白、脂多糖均含有大量脂质,易被乙醇溶解,致使细胞壁通透性增加,细胞内的结晶紫一碘复合物容易被乙醇溶解而脱出。
③化学学说:革兰阳性菌细胞内含有某些特殊化学成分,一般认为是核糖核酸镁盐与多糖的复合物,它和染料与媒染剂复合物相互结合,使已着色的细菌不易脱色。
革兰染色的意义:将细菌染成两大类,即革兰阳性菌和革兰阴性菌,可用于鉴别细菌;研究细菌的致病性,革兰阳性菌可产生外毒素,革兰阴性菌可产生内毒素;选择敏感的抗生素,革兰阳性菌可使用青霉素等作用于细胞壁的抗生素,革兰阴性菌可使用红霉素、链霉
素等抑制蛋白质合成的抗生素。
材料
1、菌种:葡萄球菌、大肠杆菌培养物。
2、染液:结晶紫染液、碘液、95%酒精和稀释复红。
3、其他:玻片、接种环、酒精灯等。
方法
1、涂片:左手持菌液试管,右手持接种环,用接种环从试管培养液中取一环菌液,于载玻片中央涂成薄层(事先在背面做好标记圆圈)即可,或先滴一小滴无菌水于载玻片中央,用接种环从斜面上挑出少许,与载玻片上的水滴混合均匀,涂成一薄层。
注意:拔或塞试管塞时,应将试管口通过火焰略加烧灼,最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。
2、干燥:涂片后在室温下自然干燥,也可在酒精灯上略加温,使之迅速干燥,但勿靠近火焰。
3、固定:常用高温进行固定。即手持载玻片一端,标本面朝上,在灯的火焰外侧快速来回移动3~4次,共约3~4秒。要求玻片温度不超过60℃,以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜,放置待冷后染色。
固定的目的是:
①杀死微生物,固定其细胞结构;
②保证菌体能牢固地粘附在载玻片上,以免水洗时被水冲掉; ③改变菌体对染料的通透性,一般死细胞原生质容易着色。
4、染色
①初染:在已固定的细菌涂片上滴加结晶紫染液2~3滴,染1min,用水冲洗。
②媒染:滴加媒染剂碘液数滴,1min后用水冲洗。
③脱色:滴加95%酒精脱色,轻轻摇动玻片几秒钟,使均匀脱色,直至无紫色脱落为止(约30Sec),并立即用水冲洗。
④复染:滴加稀释复红复染约30Sec种后用水冲洗。
5、用显微镜的油镜观察染色结构,并写实验报告。
实验报告:
1. 革兰染色的步骤
2. 革兰染色结果绘图(注意细菌的大小、比例关系:葡萄球菌直径1μ,大肠杆菌0.45~0.75×1~3μ)。
3. 革兰染色的意义
某些细菌具有特殊结构,如荚膜、鞭毛、菌毛和芽孢。染色后,在显微镜油镜下,可清楚观察到荚膜、鞭毛及芽孢,菌毛必须使用电子显微镜才能观察清楚。
材料
1、破伤风梭菌示教片(示芽孢)
2、肺炎链球菌示教片(示荚膜)
3、伤寒杆菌示教片(示鞭毛)
方法
1、使用显微镜的油镜,观察细菌的芽孢、荚膜和鞭毛的示教片。
2、注意芽孢在菌体上的位置和大小;荚膜的大小及其与菌体的关系;注意鞭毛形态、数量及其位置。将所观察到的细菌特殊结构的形态特点记录于下表中。
结构记录
细菌 破伤风梭菌 肺炎链球菌 伤寒杆菌
特殊结构