信号肽功能化二氧化硅纳米颗粒的线粒体靶向作用研究
Vo.l30
2009年12月高等学校化学学报 CHEMICALJOURNALOFCHINESEUNIVERSITIES No.122376~2380
信号肽功能化二氧化硅纳米颗粒的
线粒体靶向作用研究
何晓晓,袁 媛,石 慧,王柯敏,何定庚,秦迪岚
(湖南大学生物医学工程中心,化学生物传感与计量学国家重点实验室,化学化工学院,
生命科学与技术研究院,生物纳米与分子工程湖南省重点实验室,长沙410082)
摘要 以N-(p-Maleimidophenyl)isocyanate(PMPI)为交联剂,将线粒体信号肽分子共价修饰到二氧化硅荧光纳米颗粒表面,构建线粒体信号肽功能化二氧化硅荧光纳米颗粒.采用荧光分光光度计、Zeta电位仪以及透射电子显微镜对修饰前后的二氧化硅纳米颗粒进行了表征.结果表明,信号肽可被成功修饰在纳米颗粒表面,并且纳米颗粒粒径在信号肽分子修饰前后没有发生明显变化.以分离纯化的细胞核作为对照,采用流式细胞术考察了信号肽功能化二氧化硅荧光纳米颗粒与分离纯化后的线粒体的相互作用.结果表明,线粒体信号肽修饰到二氧化硅纳米颗粒表面后依然保持良好的生物活性,能够介导二氧化硅纳米颗粒特异性识别及结合分离纯化的线粒体,从而为线粒体监测及其功能调控研究提供了新的思路.
关键词 二氧化硅纳米颗粒,线粒体信号肽,线粒体
中图分类号 O657 文献标识码 A 文章编号 0251-0790(2009)12-2376-05
线粒体是细胞能量储存和供给的场所,在细胞生命活动中起着非常重要的作用
多疾病的发生与线粒体功能紊乱密切相关,如帕金森氏病[2][1],现已发现,许[4]、心血管疾病[3]、糖尿病及癌症[5]等.因此,线粒体功能监测与调控对于线粒体相关疾病的预防与治疗具有非常重要的意义,但此类监测和调控都有赖于活性物质或药物的线粒体靶向输送.目前较常采用的方式是将活性物质或药物与线粒体靶向分子直接连接后进行靶向运输[2,3],该方法一方面可能会改变物质的生物活性,另一方面在运输
[6~8]到线粒体的过程中可能会发生降解.近年来,基于纳米技术发展的功能化纳米材料在生物医学研究中得到了广泛应用
体生物活性物质的靶向输送中得到了初步应用,如Boddapati等[9]
[10],也在线粒利用三苯基膦修饰脂质体实现了向线粒体输送神经酰胺分子,提高了诱导凋亡的效率;Yamada等利用八聚精氨酸修饰脂质体并将其
[11]用于向线粒体输送绿色荧光蛋白;DcSouza等利用具有线粒体聚集特性的地喹氯铵聚合成纳米颗粒
并用于向线粒体输送DNA分子.这些功能化纳米颗粒主要以脂质体或有机高分子材料为主,存在稳定性差、在血液中易于膨胀和装载药物易泄漏等缺点
[13~15][12].与脂质体及有机高分子纳米颗粒相比,二氧化[16]硅纳米颗粒在血液中稳定性高,能更好地运载物质,并且还具有生物相容性好及易于修饰等优点;此外,有研究表明最容易进入细胞的颗粒粒径为50nm左右,本文所采用的二氧化硅纳
[17]米颗粒的粒径在50nm左右,且已有研究证明该颗粒很容易进入细胞,因此有望在线粒体功能监测
与调控中发挥重要作用,但目前有关二氧化硅纳米颗粒与线粒体相互作用的研究尚未见报道.本文以N-(p-Maleimidophenyl)isocyanate(PMPI)为交联剂,将具有线粒体靶向作用的信号肽分子共价修饰在二氧化硅荧光纳米颗粒表面,获得信号肽功能化二氧化硅荧光纳米颗粒,以分离纯化的细胞核作为对照,采用流式细胞术考察了信号肽功能化二氧化硅荧光纳米颗粒与分离纯化后的线粒体的相互作用.
收稿日期:2009-07-15.
基金项目:国家/九七三0计划项目(批准号:2002CB513100-10)、教育部科学技术重点项目(批准号:107084)、新世纪优秀人才支持计划(批准号:NCET-06-0697)和国家自然科学基金(批准号:90606003,20775021)资助.
联系人简介:王柯敏,男,博士,教授,博士生导师,主要从事化学生物传感技术及在纳米尺度和分子水平上获取生物化学信息的研究.E-mai:[email protected]
No.12 何晓晓等:信号肽功能化二氧化硅纳米颗粒的线粒体靶向作用研究23771 实验部分
1.1 试剂与仪器
线粒体信号肽[NH2-MLSLRQSIRFFKGC-COOH,吉尔生化(上海)有限公司];N-(B-氨乙基)-C-氨丙基三乙氧基硅烷(AEAPS,武汉大学有机硅材料研究所);正硅酸乙酯(TEOS,汕头市西陇化工厂);N-(p-马来酰亚胺基苯基)异氰酸酯(PMPI,Pierce公司);二甲基亚砜(DMSO,南京化学试剂有限公司);天冬氨酸(Sigma-Aldrich公司);MitoTrackerDeepRed633FM(Invitrogen公司);5-羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯(5-TAMRA,SE,广州长瑞生物技术有限公司);RSB缓冲液(10mmol/LNaC,l215mmol/LMgCl-HC,lpH=715);MS缓冲液(210mmol/L甘露糖,70mmol/L蔗糖,2,10mmol/LTris
5mmol/LTris-HC,l1mmol/LEDTA,pH=715);PBS缓冲液(8g/LNaC,l012g/LKC,l1144g/LNa2HPO4,0124g/LKH2PO4,pH=712);Hela细胞.
FACScalibur流式细胞仪(美国BD公司);F2500荧光分光光度计(日本Hitachi公司);Nano-ZS纳米粒度仪及Zeta电位仪(英国Malvern公司);JEOL-1230透射电子显微镜(日本电子公司).
1.2 线粒体信号肽功能化二氧化硅荧光纳米颗粒的制备及表征
二氧化硅荧光纳米颗粒的制备参照文献[13]方法,具体步骤如下:将荧光染料5-TAMRA,SE与氨基硅烷化试剂AEAPS以摩尔比2B1在011mol/LNaHCO3溶液中反应过夜以制备染料前体.将环己烷、TritonX-100和正己醇按体积比412B1B1混合均匀,加入480LL水搅拌使之形成反相微乳液,加入染料前体,然后加入TEOS及氨水,搅拌24h后形成二氧化硅荧光纳米颗粒.
二氧化硅荧光纳米颗粒的线粒体信号肽修饰步骤如下:将5mg二氧化硅荧光纳米颗粒分散于无水DMSO中,加入25LL交联剂PMPI(015mg/mL),于37e反应1h,离心收集颗粒并用PBS重新分散,然后加入一定量的信号肽分子于37e反应2h,再将颗粒重新分散于011mol/LNaHCO3溶液中,并加入过量的天冬氨酸于4e摇床封闭过夜.离心收集颗粒并分散于PBS中,于4e储存备用.同时,采用FITC标记的肽段分子进行相同的交联实验用于验证交联方法的有效性.采用透射电镜和纳米粒度仪及Zeta电位仪对修饰前后颗粒的粒径及表面电势进行表征.
1.3 线粒体信号肽功能化二氧化硅荧光纳米颗粒的线粒体靶向作用
1.3.1 线粒体和细胞核的分离纯化 线粒体及对照细胞器细胞核的分离纯化参照文献[18]方法进行.具体步骤如下:将生长良好的Hela细胞消化后收集,用3mL冰上预冷的RSB缓冲液分散后置于冰上,待细胞完全膨胀后转移至玻璃匀浆器中破碎细胞.将匀浆液转移至离心管中,于1000g离心3min,获得的沉淀即为细胞核,收集上清液并加入2mL215倍MS缓冲液至终浓度为1倍MS,在10000g离心15min,获得的沉淀即为线粒体.采用上述方法分离得到的线粒体和细胞核均分别用PBS重新分散,置于冰上待用.
将线粒体悬浮于PBS中,加入MitoTrackerDeepRed633FM至终浓度为300nmol/L,在37e染色15min后于10000g离心15min以沉淀线粒体,除去未与线粒体结合的染料,用PBS重悬线粒体,置于冰上待用.
1.3.2 线粒体信号肽功能化二氧化硅荧光纳米颗粒与线粒体相互作用的考察 (1)线粒体信号肽分子与离体线粒体相互作用.为了验证合成的信号肽分子能否有效地靶向识别与结合离体线粒体,考察了信号肽与离体线粒体间的相互作用,具体步骤如下:将染色后的线粒体与FITC标记的信号肽于37e培育5min后,采用流式细胞仪分析.FITC荧光用488nm激光器激发,FL1检测器收集相应荧光信号;线粒体荧光染料用633nm激光器激发,采用FL4检测器收集信号.
(2)线粒体信号肽功能化二氧化硅荧光纳米颗粒与离体线粒体间相互作用.将染色后的线粒体与修饰了线粒体信号肽的二氧化硅荧光纳米颗粒于37e培育5min,采用流式细胞仪分析.用488nm激光器激发荧光二氧化硅纳米颗粒,并用FL2检测器收集相应荧光信号.
1.3.3 线粒体信号肽功能化二氧化硅荧光纳米颗粒与离体细胞核间的相互作用 制备线粒体或细胞核的PBS悬液,调节细胞器浓度使2份溶液中细胞器的个数相同,加入信号肽修饰的纳米颗粒,并于
2378高等学校化学学报 Vo.l30 37e培育5min,采用流式细胞仪分析.细胞核的群落通过调节前向角光散射信号与侧向角光散射信号确定.
2 结果与讨论
2.1 纳米颗粒的表征
采用荧光分光光度计检测经FITC标记肽段修饰前后纳米颗粒的荧光发射光谱,结果见图1.谱线a为修饰前纳米颗粒的荧光光谱;谱线b为经FITC标记信号肽分子修饰后纳米颗粒的荧光光谱,其在525nm处出现明显的峰,表明利用交联剂PMPI能够将信号肽分子修饰到二氧化硅纳米颗粒表面.纳米粒度仪及Zeta电位仪对颗粒表面电势的表征结果见图2,可见,修饰交联剂后直接用天冬氨酸封闭的颗粒(Asp-SiNP)的表面电势为-2615mV,比未经任何修饰的颗粒(SiNP)的表面电势(-2216mV)偏负,这是由天冬氨酸末端带有2个羧基所致;而修饰了信号肽分子的颗粒(PSiNP)表面电势为-1613mV,比未修饰的二氧化硅纳米颗粒及天冬氨酸封闭的颗粒的表面电势稍微偏正,这是由肽段带有一定的正电荷所致,但是修饰前后颗粒表面电势都为负值且差别不大,因此在后续实验中可以排除由于表面电势对颗粒和线粒体结合的影响.采用透射电镜对颗粒的粒径进行表征,结果表明,SiNP,Asp-SiNP以及PSiNP的粒径分别为(57?6),(55?4)和(54?4)nm,表明颗粒在修饰前后粒径没有发生明显变化
.
Fig.1 Fluorescencespectraofsilicananoparticles(a)and
FITC-peptidemodifiedsilicananoparticles(b
)Fig.2 ZetapotentialofSiNP(a),Asp-SiNP(b)andPSiNP(c)
2.2 信号肽功能化二氧化硅荧光纳米颗粒生物功能
2.2.1 信号肽功能化二氧化硅荧光纳米颗粒与离体线粒体的相互作用 线粒体大小仅为014~215Lm,在检测过程中如果仅利用散射光信号对线粒体群落进行判定,溶液中的纳米颗粒团聚体会导致假阳性信号的产生,因此先利用线粒体特异性染料MitoTrackerDeepRed633FM对离体线粒体进行染色,再借助线粒体染料和纳米颗粒两种荧光信号的双色流式细胞术对颗粒与线粒体的结合进行测定.
FITC标记的线粒体信号肽与离体的线粒体间作用结果如图3(A)~(F)所示.图3(A)为未经染色的线粒体的结果图;图3(B)为染色后的线粒体结果图,可见其在FL4单阳区的荧光信号增大,因此用MitoTrackerDeepRed633FM能够成功地对离体线粒体进行染色;图3(C)为FITC标记的信号肽分子与染色后的线粒体相互作用的结果图,其在双阳区信号为39175%,由此可见,合成的线粒体信号肽分子具有生物活性,能够与离体的线粒体相互识别与结合.在此基础上,将修饰有肽段的颗粒与线粒体相互作用.图3(D)和(E)分别为未染色的线粒体及染色后的线粒体在FL2和FL4通道的荧光信号的分布图;图3(F)为功能化二氧化硅荧光纳米颗粒与染色后线粒体相互作用结果,其在双阳区信号为39109%,表明肽段修饰的纳米颗粒能与离体线粒体相互作用并结合在线粒体上.
为了证明信号肽功能化纳米颗粒与离体线粒体间的相互作用是由信号肽介导的,而不是由荧光纳米颗粒的聚集和非特异性吸附所致,实验进一步考察了未经修饰的二氧化硅纳米颗粒(SiNP)及修饰了交联剂后用天冬氨酸封闭(Asp-SiNP)的颗粒和线粒体的相互作用,并仅对具有MitoTrackerDeepRed633FM荧光信号的线粒体部分进行分析,结果见图4.图4(A)为与未经修饰的二氧化硅纳米颗粒作用后的线粒体结果图,图4(B)为与修饰了交联剂后用天冬氨酸封闭的颗粒作用后的线粒体结果图,
No.12 何晓晓等:信号肽功能化二氧化硅纳米颗粒的线粒体靶向作用研究2379Fig.3 InteractionsofisolatedmitochondriawithFITC-peptide[(A))(C)]andpeptide-SiNP[(D))(F)]
(A)and(D)Isolatedmitochondria;(B)and(E)isolatedmitochondriastainedbyMitoTrackerDeepRed;
(C)stainedmitochondriawiththeFITC-peptides;(F)stainedmitochondriawithpeptide-SiNP.
二者在双阳区的信号仅为6160%和5132%,而与信号肽功能化的颗粒作用后的线粒体在双阳区的信号为58195%[图4(C)].此结果表明,信号肽修饰二氧化硅纳米颗粒赋予了其与线粒体相互识别并结合的能力
.
Fig.4 InteractionsofisolatedmitochondriawithSiNP(A),Asp-SiNP(B)andpeptide-SiNP(C)
2.2.2 功能化二氧化硅纳米颗粒与线粒体作用的特异性 信号肽功能化二氧化硅纳米颗粒与线粒体之间的作用特异性考察结果如图5所示.图5(A)为离体线粒体与信号肽修饰前后的二氧化硅纳米颗粒相互作用的结果,图5(B)为离体细胞核与信号肽修饰前后的二氧化硅纳米颗粒相互作用的结果.由图5可见,信号肽功能化的纳米颗粒对离体的线粒体有明显的结合信号,而对于细胞核而言,信号肽修饰前后与细胞核的结合情况无明显变化
.
Fig.5 Specificinteractionsofsilicananoparticleswithisolatedmitochondria(A)andisolatednucleus(B)
由以上研究结果可知,线粒体信号肽修饰在纳米颗粒上后依然保持很好的生物学活性,能够特异性地识别和结合分离纯化后的线粒体,从而为基于二氧化硅纳米颗粒的细胞内线粒体研究奠定了较好的基础.
2380高等学校化学学报 Vo.l30
参 考 文 献
[1] JosephineS.,NapolitanoaM.,AprillebJ.R..Adv.Drug.Delivery.Rev.[J],2001,49:63)70
[2] AsayamaS.,KawamuraE.,NagaokaS.,etal..MolecularPharmaceutics[J],2006,3(4):468)470
[3] AdlamV.J.,HarrisonJ.C.,PorteousC.M.,etal..TheFASEBJournal[J],2005,19:1088)1095
[4] GreenK.,BrandM.D.,MurphyM.P..Diabetes[J],2004,53:S110)118
[5] RichardW.,HorobinR.W.,TrappS.,etal..J.Contro.lRelease[J],2007,121:125)136
[6] DziublaT.D.,ShuvaevV.V.,HongN.K.,etal..Biomaterials[J],2008,29:215)227
[7] StoverT.C.,KimY.S.,LoweT.L.,etal..Biomaterials[J],2008,29:359)369
[8] SoppimathK.S.,AminabhaviT.M.,KulkarniA.R.,etal..J.Contro.lRelease[J],2001,70:1)20
[9] BoddapatiS.V.,DcSouzaG.G.M.,ErdoganS.,etal..NanoLett.[J],2008,8(8):2559)2563
[10] YamadaY.,AkitaH.,KamiyaH.,etal..BiochimicaetBiophysicaActa[J],2008,1778(2):423)432
[11] DcSouzaG.G.M.,RammohanR.,ChengS.M.,etal..J.Contro.lRelease[J],2003,92:189)197
[12] SoppimathaK.S.,AminabhaviaT.M.,KulkarniaA.R..J.Contro.lRelease[J],2001,70:1)20
[13] HeX.X.,WangK.M.,TanW.H.,etal..J.Am.Chem.Soc.[J],2003,125(24):7168)7169
[14] OhulchanskyyT.Y.,RoyI.,GoswamiL.N.,etal..NanoLett.[J],2007,7(9):2835)2842
[15] SHIHui(石慧),HEXiao-Xiao(何晓晓),WANGKe-Min(王柯敏),etal..Chem.J.ChineseUniversities(高等学校化学学报)
[J],2007,28(9):1690)1695
[16] OsakiF.,KanamoriT.,SandoS.,etal..J.Am.Chem.Soc.[J],2004,126:6520)6521
[17] XINGXin-Li(邢新丽),HEXiao-Xiao(何晓晓),WANGKe-Min(王柯敏),etal..Chem.J.ChineseUniversities(高等学校化学学
报)[J],2006,27(11):2076)2078
[18] SpectorD.L.,GoldmanR.D.,LeinwardL.A.;TranstatedbyHUANGPe-iTang(黄培堂).Cel:lALaboratoryManual(细胞实验指
南)[M],Beijing:SciencePress,2001:356
StudyontheTargetInteractionBetweenMitochondriaand
SignalPeptideFunctionalizedSilicaNanoparticles
HEXiao-Xiao,YUANYuan,SHIHu,iWANGKe-Min,HEDing-Gen,QIND-iLan
(BiomedicalEngineeringCenter,StateKeyLaboratoryofChemo/BiosensingandChemometrics,
CollegeofChemistryandChemicalEngineering,InstituteofLifeScienceandBiotechnology,KeyLaboratoryfor
Bio-NanotechnologyandMoleculeEngineeringofHunanProvince,HunanUniversity,Changsha410082,China)*
Abstract ThemitochondrialsignalpeptidefunctionalizedfluorescentsilicananoparticleswerepreparedbyconjugatedthemitochondrialsignalpeptidetothenanoparticlesthroughN-(p-maleimidophenyl)isocyanate(PMPI).Thefluorescencespectrophotometer,zetapotentialandTEMwereusedtocharacterizethefluores-centsilicananoparticles.Theresultsshowthatthesignalpeptidesaresuccessfullyconjugatedtothesurfaceoffluorescentsilicananoparticles,andthesizeofthefluorescentsilicananoparticlesdonotchangeobviouslybe-foreandaftermodification.Withtheisolatednucleusasacontro,lthetargetinteractionbetweenthemitochon-drialsignalpeptidesmodifiedfluorescentsilicananoparticlesandtheisolatedmitochondriawasinvestigatedbyflowcytometry.Itwasrevealedthatthebioactivityofthesignalpeptidewaswellremainedaftertheconjugationwiththesilicananoparticles,andthepeptidescouldfacilitatethespecificrecognitionandbindingbetweenthesilicananoparticlesandtheisolatedmitochondria,whichputforwardsanewideaforthemonitoringandfunc-tioncontrollingofthemitochondria.
Keywords Silicananoparticle;Mitochondrialsignalpeptide;Mitochondria
(Ed.:A,G)