微生物胞外聚合物对重金属镉的解毒作用及红外光谱分析
第３３卷，第１１期 光谱学与光谱分析２０１３年１１月 ＳｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙａｎｄＳｐｅｃｔｒａｌＡｎａｌｙｓｉｓＶｏｌ畅３３，Ｎｏ畅１１，ｐｐ３０４１‐３０４３
Ｎｏｖｅｍｂｅｒ，２０１３
微生物胞外聚合物对重金属镉的解毒作用及红外光谱分析
张海欧１，周维芝１，２倡，马玉洪１，赵海霞１，张玉忠２
１畅山东大学环境科学与工程学院，山东济南 ２５０１００ ２畅山东大学生命与科学学院国家重点实验室，山东济南 ２５０１００
摘 要 为探索微生物胞外物在微生物对重金属的抗性和去除过程中的作用，比较分析了对重金属镉具有不同抗性和去除率的菌株ＳＣＳＥ４２５‐７和ＳＣＳＥ７０９‐６胞外物的产生情况和菌株的红外光谱谱图。结果表明，在含镉条件培养时，菌株ＳＣＳＥ４２５‐７表现了较高的镉抗性，分泌了相对较多的可溶性胞外多糖；而菌株ＳＣＳＥ７０９‐６镉抗性较ＳＣＳＥ４２５‐７低，但镉的生物去除性能较好，分泌了更多不可溶胞外聚合物。这说明，在重金属毒性胁迫下，微生物分泌的可溶性胞外多糖可能有助于提高微生物对重金属的抗性，而不可溶性胞外聚合物有助于重金属的微生物吸附。菌株红外光谱分析结果表明不可溶胞外聚合物上的酰胺基和羧基是其吸附镉离子的主要官能团。
关键词 胞外聚合物；红外光谱；吸附
中图分类号：Ｏ６５７畅３；Ｏ６３６畅１ 文献标识码：Ａ ＤＯＩ：１０畅３９６４／ｊ畅ｉｓｓｎ畅１０００‐０５９３（２０１３）１１‐３０４１‐０３
组成，包括杂多糖和同聚多糖。可溶性胞外多糖能够有效抵抗干燥及毒性环境；不可溶性ＥＰＳ（ｉｎｓｏｌｕｂｌｅＥＰＳ）主要包括不可溶性胞外蛋白（ｐｒｏｔｅｉｎｓ）和不可溶多糖（ｉｎｓｏｌｕｂｌｅｐｏｌｙ‐ｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）中的荚膜多糖及粘多糖［５，６］。研究表明某些分离纯化的微生物ＥＰＳ可以螯合沉淀重金属，从而使重金属离子从水体中去除［７］。但是在活菌培养过程中，微生物胞外物对重金属的解毒作用及其相互作用的了解还十分有限，对可溶性和不可溶性ＥＰＳ在水环境重金属离子的去除和微生物的解毒作用国内外很少报道。
本文研究两株对重金属镉具有不同抗性和去除率的深海菌株ＳＣＳＥ４２５‐７和ＳＣＳＥ７０９‐６在不同镉浓度下产生的可溶性胞外多糖和不可溶性ＥＰＳ对菌株生长和镉去除的影响，并通过菌株红外光谱谱图分析菌株去除重金属离子的主要作用方式。
引 言
重金属污染修复一直是环境领域研究的难点和热点，其中镉是一种广泛应用的、污染面积最广、危害最大的重金属元素之一，因而镉污染及其治理受到高度关注［１］。微生物对水体中重金属的解毒作用包括两方面，一是通过分泌胞外物阻隔重金属离子与菌体的近距离接触，使微生物对重金属具有高耐受性或高抗性；二是微生物菌体可与重金属离子近距离接触，并可通过胞外物分泌和／或特殊代谢途径经细胞表面吸附、内部累积和外部沉淀卷积重金属离子将重金属离子从水体中去除［２］。具有重金属去除作用的微生物应用于重金属污染水体和土壤的修复技术近年来得到了广泛关注。微生物修复技术由于成本低、无二次污染，使其在重金属污染治理领域具有潜在的应用价值，是重金属污染治理的重要研究方向之一［１］。
ｐｏｌｙｍｅｒｉｃｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ：ＥＰＳ）对重金属的去除起着重要作用［３，４］。ＥＰＳ是一定环境条件下微生物分泌于体外的高分子聚合物，有两种形式，分泌到培养基中的可溶性ＥＰＳ（ｓｏｌｕｂｌｅＥＰＳ）和与细胞紧密结合的不可溶性ＥＰＳ（ｉｎｓｏｌｕｂｌｅＥＰＳ）［３］。可溶性ＥＰＳ主要由可溶性胞外多糖（ｓｏｌｕｂｌｅｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ） 收稿日期：２０１３‐０１‐３０，修订日期：２０１３‐０４‐１０
大量研究表明微生物分泌的胞外聚合物（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕａｒ
１ 实验部分
１畅１ 仪器
ＲＨ‐Ｑ型全温振荡器（江苏荣华），５８０４Ｒ型高速冷冻离心机（德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ），ＴＡＳ‐９９０原子吸收分光光度计（北京普析通用），７５２型紫外‐可见分光光度计（上海菁华），２０ＳＸ型ＦＴＩＲ光谱仪（美国Ｎｉｃｏｌｅｔ）。ＬＤＺＸ‐５０ＫＢ立式压力蒸汽
基金项目：国家自然科学基金项目（５１１７８２５５，３１２９０２３１），国际海域资源调查与开发“十二五”计划项目（ＤＹ１２５‐１５‐Ｔ‐０５）资助 作者简介：张海欧，女，１９８８年生，山东大学环境科学与工程学院硕士研究生 ｅ‐ｍａｉｌ：ｓｅａｇｕｌｌ８８０６１３＠１６３畅ｃｏｍ
倡通讯联系人 ｅ‐ｍａｉｌ：ｗｚｚｈｏｕ＠ｓｄｕ畅ｅｄｕ畅ｃｎ
灭菌器（上海申安医疗器械厂），ＳＷ‐ＣＪ‐ＦＤ洁净工作台（苏州苏净安泰）。
１畅２ 菌株生长量及除镉效率测定
将具有抗镉水平和除镉水平的菌株活化２４ｈ后，以３％的接种量接种到含不同浓度镉的１００ｍＬ液体ＬＢ培养基中，２５℃，２００ｒ・ｍｉｎ－１摇床培养至稳定期后测定６００ｎｍ波长下吸光度并记为ＯＤ６００，ＯＤ６００表示菌体的细胞密度，能反应细菌的生长量。菌液１００００ｒ・ｍｉｎ－１离心分离后，利用原子吸收分光法测定上清液中剩余的镉浓度。１畅３ 胞外聚合物的测定
菌株培养至稳定期后，菌液１００００ｒ・ｍｉｎ－１离心，上清液过０畅４５μ多糖含量［８］ｍ。不能透过膜的菌团用去离子水洗三次的膜，采用苯酚‐硫酸法测量滤液中的可溶性，再用同体积１０ｍｍｏｌ・Ｌ－１１３０００ｒ・ｍｉｎ－１离心分离提取不可溶胞外聚合物ＥＤＴＡ重新悬浮，振荡５ｈ后将悬浮液。分别采用苯酚‐硫酸法和Ｆｏｌｉｎ‐酚法测量上清液中的不可透过膜多糖和蛋白含量［８］。
１畅４ 红外光谱表征
将分别在无镉和含镉条件培养的两菌株用去离子水清洗两遍ＫＢｒ，洗去可溶性多糖成分ｃｍ－１压片后的分辨率在２０，扫描ＳＸ型６０ＦＴＩＲ，带有不可溶次，扫描范围为光谱仪上４００进ＥＰＳ行的干燥菌体用～测４０００定，ｃｍ采用－１。
２２ 结果与讨论
２畅１ 菌株胞外聚合物的解毒作用
图１（ａ）表明，在含镉培养基培养时两菌株均产生较多的可溶性多糖，其中菌株ＳＣＳＥ４２５‐７产生的可溶性多糖高于菌株ＳＣＳＥ７０９‐６。两菌株可溶性胞外多糖的产量随着培养液中镉浓度的升高而增大。这说明可溶性多糖可能螯合镉离子，阻止镉离子接近细胞从而减小镉离子对菌株的毒害。由此可见，可溶性多糖对提高重金属的抗性水平起着一定的作用。
由图１（ｂ）可知，不可溶性ＥＰＳ中胞外多糖产量均不高。镉的加入明显促进了两菌株胞外蛋白的产生，随着镉浓度增加ＳＣＳＥ，菌株ＳＣＳＥ７０９‐６胞外蛋白产量迅速升的刺激下４２５‐７，。ＥＰＳ关于红假单胞菌属的研究中也表明高中蛋白的产量提高［９］，进一步证实了胞外蛋，在重金属并超越白在重金属去除过程中起到的关键性作用。菌株ＳＣＳＥ７０９‐６在镉ＳＣＳＥ大于５０ｍｇ・Ｌ－１的浓度下去除率有必然相关关系４２５‐７。可见仍明显高于菌株，，这也反映菌株的抗性机理和除镉机理存在重金属抗性水平与重金属的去除之间没较大差异，两株菌的胞外物在重金属解毒过程中贡献不同。图１（ｂ）说明，在重金属抗性浓度范围内，细菌分泌的不可溶性胞外蛋白有助于镉的去除，超出抗性浓度范围后，重金属毒性显著，分泌更多的不可溶性胞外蛋白仍无助于重金属去除。
２畅２ 红外光谱谱图分析
两菌株的红外光谱如图２所示。图中３３０１～３４１９ｃｍ－１
处的谱峰可归属为细胞表面蛋白质Ｎ—Ｈ键的伸缩振动和碳水化合物中结合水的Ｏ—Ｈ键的伸缩振动。１６５１和１
５５５
Ｆｉｇ畅１ ＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＥＰＳ，ＯＤ６００ＳｔｒａｉｎＣｄＳＣＳＥ７０９‐６ａｎｄＳｔｒａｉｎａｎｄｃａｄｍｉｕｍＳＣＳＥ４２５‐ｒｅｍｏｖａｌ７ｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｒａｔｅｏｆ
２＋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ
（ａ）：ＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｓｏｌｕｂｌｅＥＰＳａｎｄＯＤ６００；（ｂ）：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｉｎｓｏｌｕ‐ｂｌｅＥＰＳａｎｄｃａｄｍｉｕｍｒｅｍｏｖａｌ
ｒａｔｅ）
Ｆｉｇ畅２ ＩＲｗｉｔｈｓｐｅｃｔｒａｉｎｓｏｌｕｂｌｅｏｆＳＣＥＰＳ
ＳＥ４２５‐７ａｎｄＳＣＳＥ７０９‐６
ａ：ＳｔｒａｉｎｏｆＳＣＳＥ４２５‐７ｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎＣｄ（Ⅱ）；ｂ：ＳｔｒａｉｎｏｆＳＣＳＥ４２５‐７ｃｕｌｔｕｒｅｄｆｒｅｅ；ｄ：ｉｎＳｔｒａｉｎＣｄ（Ⅱｏｆ）ＳＣＳＥ‐ｆｒｅｅ７０９‐６；ｃ：ＳｔｒａｉｎｃｕｌｔｕｒｅｄｏｆＳＣＳＥｉｎＣｄ７０９‐６（Ⅱ）
ｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎＣｄ（Ⅱ）‐展振动ｃｍ－１处的谱峰来自典型的细胞蛋白质酰胺Ⅰ带（Ｃ—Ｏ的伸
）和酰胺Ⅱ带（Ｎ—Ｈ的弯曲振动与Ｃ—Ｎ伸展振动的
叠加）［１０］。１２３９ｃｍ－１处的谱峰为Ｃ—Ｏ与Ｏ—Ｈ的叠加吸收峰。比较图２中ｃ和ｄ可知，ＣＯ的吸收峰在１６５２ｃｍ－１由锐锋变成钝峰，Ｃ—Ｏ吸收峰在１４１６ｃｍ－１处发生红移，说明镉离子与多糖上的—ＣＯＯ结合减少了—ＣＯＯ的含量；酰胺基团的特征吸收峰在１５４１ｃｍ－１处发生移动，说明蛋白质上的官能团对镉的去除起重要作用。由此可见蛋白的酰胺基和羧基是ＳＣＳＥ７０９‐６吸附Ｃｄ２＋的主要官能团。比较图２中ａ和ｂ看出，ＳＣＳＥ４２５‐７吸附Ｃｄ２＋后—Ｏ—Ｈ的伸缩振动向低波数移动３１ｃｍ－１（峰位由３４１９～３３８８ｃｍ－１），说明在结合镉时，Ｏ原子参与络合Ｃｄ２＋，使Ｏ—Ｈ键的键长增加，振动峰红移。酰胺Ⅱ带发生移动（峰位由１５５５～１５４３ｃｍ－１），表明不可溶ＥＰＳ中胞外蛋白参与了Ｃｄ２＋的吸附。
３ 结 论
ＳＣＳＥ７０９‐６和ＳＣＳＥ４２５‐７对镉的抗性水平和去除水平不同可归结为：在重金属镉的胁迫下菌株ＳＣＳＥ４２５‐７形成大量可以透过膜的可溶性胞外多糖，能够使重金属离子无法接近菌体提高细菌的抗镉水平，但无益于镉的去除。ＳＣＳＥ７０９‐６产生大量不可溶性ＥＰＳ，能够有效螯合镉离子，将重金属镉去除。红外光谱也表明不可溶性胞外多糖和蛋白对重金属的去除起到重要作用，尤其是不可溶性胞外蛋白上的酰胺基和羧基是吸附镉离子的主要官能团。
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ
［１］ ＦＵＪｉｎ，ＸＩＥＸｕｅ‐ｈｕｉ，ＱＩＡＮＬｉｎ，ｅｔａｌ（付 瑾，谢学辉，钱 林，等）．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｂｉｏｌ．（应用与环境生物学报），２０１１，１７（５）：
７１７．
［２］ ＷｅｉＸ，ＦａｎｇＬＣ，ＣａｉＰｅｔａｌ．ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＰｏｌｌｕｔｉｏｎ，２０１１，１５９（５）：１３６９．［３］ ＳｈｅｎｇＧＰ，ＹｕＨＱ，ＬｉＸＹ．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＡｄｖａｎｃｅｓ，２０１０，２８（６）：８８２．［４］ ＬｅｄｉｎＭ．Ｅａｒｔｈ‐ＳｃｉｅｎｃｅＲｅｖｉｅｗｓ，２０００，５１（１）：１．
［５］ ＨｏｎｇｐａｔｔａｒａｋｅｒｅＴ，ＣｈｅｒｎｔｏｎｇＮ，ＷｉｃｈｉｅｎｃｈｏｔＳ．ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＰｏｌｙｍｅｒｓ，２０１２，８７（１）：８４６．［６］ ＤｏｎｏｔＦ，ＦｏｎｔａｎａＡ，ＢａｃｃｏｕＪＣ，ｅｔａｌ．ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＰｏｌｙｍｅｒｓ，２０１２，８７（２）：９５１．
［７］ ＸＩＮＸｉｎ，ＹＡＯＬｉ，ＣＵＩＫｅ，ｅｔａｌ（信 欣，姚 力，崔 钶，等）．ＴｈｅＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｏｎｆｅｒｒｏｕｓＭｅｔａｌｓ（中国有色金属学报），
２０１２，２２（９）：２６６７．
［８］ ＴｚｏｕｍａｋｉＭＶ，ＭｏｓｃｈａｋｉｓＴ，ＢｉｌｉａｄｅｒｉｓＣＧ．ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＰｏｌｙｍｅｒｓ，２０１３，９５（１）：３２４．［９］ ＳｈｅｎｇＧＰ，ＹｕＨＱ，ＺｈｅｎｇＢＹ．ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００５，６９（２）：２１６．［１０］ ＫａｍｎｅｖＡ，ＡｎｔｏｎｙｕｋＬ，ＭａｔｏｒａＬＹ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｔｒｕｃｔｕｒｅ，１９９９，４８０，３８７．
ＦＴＩＲＳｐｅｃｔｒｕｍａｎｄＤｅｔｏｘｉｃａｔｉｏｎｏｆＥｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＰｏｌｙｍｅｒｉｃＳｕｂｓｔａｎｃｅｓＳｅｃｒｅｔｅｄｂｙＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ
ＺＨＡＮＧＨａｉ‐ｏｕ１，ＺＨＯＵＷｅｉ‐ｚｈｉ１，２倡，ＭＡＹｕ‐ｈｏｎｇ１，ＺＨＡＯＨａｉ‐ｘｉａ１，ＺＨＡＮＧＹｕ‐ｚｈｏｎｇ２
１．ＳｃｈｏｏｌｏｆＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＳｈａｎｄｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉ’ｎａｎ ２５０１００，Ｃｈｉｎａ２．ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｆＭｉｃｒｏｂｉａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＳｈａｎｄｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉ’ｎａｎ ２５０１００，Ｃｈｉｎａ
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｅｘｔｒａｃｅｌｌｕａｒｐｏｌｙｍｅｒｉｃｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ（ＥＰＳ）ｏｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｎｄｒｅｍｏｖａｌｏｆｈｅａｖｙｍｅｔａｌｓ，ｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＥＰＳ，ｓｅｃｒｅｔｅｄｂｙｃａｄｍｉｕｍ‐ｒｅｓｉｓｔａｎｔｓｔｒａｉｎ（ＳＣＳＥ４２５‐７）ａｎｄｃａｄｍｉｕｍ‐ｒｅｍｏｖａｌｓｔｒａｉｎ（ＳＣＳＥ７０９‐６）ｗａｓｉｎｖｅｓ‐ｔｉｇａｔｅｄｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈＦｏｕｒｉｅｒｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｆｒａｒｅｄｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（ＦＴＩＲ）．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｈｉｇｈｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｃａｄｍｉｕｍｏｆｓｔｒａｉｎＳＣＳＥ４２５‐７ｗａｓｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅｈｉｇｈｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｓｏｌｕｂｌｅＥＰＳ，ｗｈｅｒｅａｓＳＣＳＥ７０９‐６ｓｅｃｒｅｔｅｄｍｏｒｅｉｎｓｏｌｕｂｌｅＥＰＳｒｅｓｕｌ‐ｔｉｎｇｉｎｂｅｔｔｅｒｃａｄｍｉｕｍｒｅｍｏｖａｌｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ．ＩｔｗａｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｓｏｌｕｂｌｅｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓｍａｙｈｅｌｐｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｔｏｅｎｈａｎｃｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏＣｄ２＋，ａｎｄｉｎｓｏｌｕｂｌｅＥＰＳｃｏｕｌｄｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｔｏＣｄ２＋ｒｅｍｏｖａｌｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅＦＴＩＲｓｐｅｃｔｒａｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅ
２＋
ｐｅａｋｓｏｆａｍｉｄｅａｎｄｃａｒｂｏｘｙｌｗｅｒｅｍａｉｎｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｒｏｕｐｓｆｏｒＣｄａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕａｒｐｏｌｙｍｅｒｉｃｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ（ＥＰＳ）；Ｆｏｕｒｉｅｒｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｆｒａｒｅｄｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（ＦＴＩＲ）；Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ
（ＲｅｃｅｉｖｅｄＪａｎ．３０，２０１３；ａｃｃｅｐｔｅｄＡｐｒ．１０，２０１３）
倡Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ
微生物胞外聚合物对重金属镉的解毒作用及红外光谱分析
作者：作者单位：
张海欧， 周维芝， 马玉洪， 赵海霞， 张玉忠， ZHANG Haiou， ZHOU Weizhi， MAYuhong， ZHAO Haixia， ZHANG Yuzhong
张海欧,马玉洪,赵海霞,ZHANG Haiou,MA Yuhong,ZHAO Haixia(山东大学环境科学与工程学院,山东 济南,250100)， 周维芝,ZHOU Weizhi(山东大学环境科学与工程学院，山东 济南250100; 山东大学生命与科学学院国家重点实验室，山东 济南 250100)， 张玉忠,ZHANGYuzhong(山东大学生命与科学学院国家重点实验室,山东 济南,250100)光谱学与光谱分析
Spectroscopy and Spectral Analysis2013(11)
刊名：英文刊名：年，卷(期)：
参考文献(10条)
1.付瑾;谢学辉;钱林 查看详情 2011(05)2.Wei X;Fang L C;Cai P 查看详情 2011(05)3.Sheng G P;Yu H Q;Li X Y 查看详情 2010(06)4.Ledin M 查看详情 2000(01)
5.Hongpattarakere T;Cherntong N;Wichienchot S 查看详情 2012(01)6.Donot F;Fontana A;Baccou J C 查看详情 2012(02)7.信欣;姚力;崔钶 查看详情 2012(09)
8.Tzoumaki M V;Moschakis T;Biliaderis C G 查看详情 2013(01)9.Sheng G P;Yu H Q;Zheng B Y 查看详情 2005(02)10.Kamnev A;Antonyuk L;Matora L Y 查看详情 1999
引用本文格式：张海欧.周维芝.马玉洪.赵海霞.张玉忠.ZHANG Haiou.ZHOU Weizhi.MA Yuhong.ZHAO Haixia.ZHANGYuzhong 微生物胞外聚合物对重金属镉的解毒作用及红外光谱分析[期刊论文]-光谱学与光谱分析 2013(11)