酵母菌形态观察及其子囊孢子观察

实验八、酵母菌形态观察及其子囊孢子观察 09生科三班一组 郜思齐 [1**********]6 2010-11-17

一、 实验目的

（1） 了解酵母菌形态及其出芽方式

（2） 学习区分酵母菌死、活、衰亡期细胞

（3） 掌握酵母菌子囊孢子的观察方法

二、 实验原理

酵母菌繁殖方式：单细胞的酵母菌个体是常见细菌的几倍甚至几十倍，大多数采取出芽方式（在PDF酵母合成培养基中）进行无性繁殖，也可以通过结合产生子囊孢子（麦氏培养基中）进行有性繁殖。

美蓝染色原理：由于细胞个体大，采取涂片的方法制片有可能损伤细胞，一般通过美蓝染液水浸片法或水-碘液浸片法来观察酵母菌形态及出芽生殖方式。同时，采用美蓝染液水浸片法还可以对酵母菌的死、活细胞进行鉴别。美蓝对细胞无毒，其氧化型呈蓝色，还原型无色。由于新陈代谢，活细胞胞内有较强还原能力，使美蓝由蓝色氧化型变成无色的还原型，染色后活细胞呈无色。死细胞或代谢能力微弱的衰老细胞还原能力弱，染色后细胞呈蓝色或淡蓝色。

孢子染色原理：孢子壁厚不易着色，但是一旦着色就很难被脱色。因此先用强染色剂（孔雀绿）下染色，使染料进入菌体和孢子，水洗时菌体中染色被洗脱而孢子中染料保留。在用对比度大的复染色剂染色后，菌体染上复染色剂的颜色而孢子保留原来颜色，这样可将两者区别开来。

三、 实验器材

（1） 菌种：酿酒酵母7d麦氏培琼脂（产孢培养基）斜面培养物，酿酒酵母2d YPD（酵

母合成培养基）液体培养物。

（2） 溶液和试剂：0.01%美蓝水溶液，5%孔雀绿水溶液，0.5%番红水溶液，95%乙醇，

蒸馏水等。

（3） 仪器：试管，锥形瓶，酒精灯，显微镜，擦镜纸，酒精灯，载玻片，盖玻片，双层

瓶，接种环，滴管，滤纸，镊子等。

四、 实验内容

（1） 两种培养基的配置

分别配置100ml麦氏培养基和200ml酵母合成培养基，其成分配比详见附录一。

（2） 接种培养

无菌操作下将麦氏培养基分装在十支试管中，倾斜排放待其冷却，挑取酿酒酵母斜面培养菌落，接种在十支斜面上，于27℃下培养7d；将酵母合成培养基分装于三个100ml锥形瓶中，从液体培养物中每次倾倒约3ml，倒入锥形瓶内的液体培养基中，于27℃下培养2d。

（3） 美蓝浸片法观察死、活菌体及出芽

① 取液：用滴管取一滴培养液在载玻片上，再滴加美蓝与之混合。

② 盖片：用镊子取一块盖玻片，将其一端与菌液接触，缓慢将盖玻片倾斜并覆盖在菌

液上，以避免有气泡产生。

③ 观察：将制片放置3min后，用低倍镜及高倍镜观察酵母菌形态和出芽情况，并根

据细胞颜色区分死活细胞。

④ 放置后观察：染色30min后再次观察，注意死活细胞比例的变化。

（4） 子囊孢子染色观察

① 制片：取在28℃培养7d斜面培养物涂片，并干燥固定。

② 染色：于涂片上滴加数滴5%孔雀绿水溶液覆盖图菌部位。开始计算时间约

1min-1.5min。

③ 脱色：用水冲去染液至孔雀绿不再褪色为止，用95%乙醇覆盖涂菌处约30s后水洗。 ④ 复染：用0.5%番红水溶液复染30s-1min，水洗干燥。

⑤ 镜检：制片干燥后用显微镜观察，观察分辨菌体及孢子。

五、 注意事项

（1） 锥形瓶中装入的液体培养基应不超过30%，避免加液量过多导致菌液内部缺氧。

（2） 培养时锥形瓶顶部不能用棉塞密封，应用纱布以保证更好的通透性。

（3） 从培养2d的液体培养基中取菌液前应先摇动锥形瓶，因为长时间培养后菌体会沉积

到锥形瓶底部。

（4） 用接种环将菌体与染液混合时不要剧烈涂抹，以免破坏细胞。

六、 实验结果

（1）菌落及菌体观察：固体培养基上菌落呈，白色，表面粘状；液体培养基中菌体聚集沉积在底部，为白色较浓液态。

（2）死活菌观察（实验照片见附录二中图2-1及图2-2）

结论：美蓝虽为温和染色剂，但长时间后菌体依然会被染色剂破坏或缺水导致大量死亡。

（3）子囊孢子染色

菌体和孢子囊呈红色，孢子呈绿色，多数孢子四个聚集在一起，由于视野角度问题，看到的孢子多为两个或三个在一起，由红色孢子囊包裹。

七、 思考题

P76（10）根据你的观察结果，美蓝染液浓度及作用时间与酵母菌死、活细胞比例变化是否有关系？试分析原因。

答：有关系，美蓝浓度越大，作用时间越长则视野中死菌比例越大。原因：一是虽然美蓝对细胞无毒，但浓度大时细胞外渗透压增大导致细胞失水，二者细胞还原能力有限，浓度高或时间较长都会对细胞结构构成破坏。

P76（11）你在实验中是否观察到酿酒酵母的子囊孢子？若未观察到，试分析原因（子囊孢子的形成与培养条件的关系）。

答：酵母菌有无性生殖（出芽）和有性生殖（产生子囊孢子）两种繁殖方式，不同的培养基会导致繁殖方式不同，在麦氏培养基中营养比较缺乏而易产孢子，而酵母合成培养基中营养丰富，利于菌体以出芽方式繁殖。

八、 附录

附录一、两种培养基的成分配比

麦氏琼脂培养基（产孢）

（自然pH）

酵母合成培养基

(自然pH)

附录二、实验图片

图表 2-1美蓝3min（10×40）

图表 2-2美蓝30min（10×40）

图表 2-3芽孢（10×100）

图表 2-4子囊孢子染色（10×100）