转基因食品的论文转基因玉米论文
农业生物技术学报，2010年，第18卷，第6期，第1208~1214页JournalofAgriculturalBiotechnology,2010,Vol.18,No.6,1208~1214
技术改进
UpdatedTechnology
转基因玉米MON88017转化事件特异性定性PCR检测方法及其标准化
2
瞿勇1，武玉花1吴刚1曹应龙1卢长明1*
1中国农业科学院油料作物研究所，农业部油料作物生物学重点开放实验室，武汉430062；2江西农业大学农学院，南昌330045*通讯作者,[email protected]
摘要转基因玉米(Zeamays)MON88017是美国孟山都公司通过DNA重组技术开发的具有抗玉米根叶
甲虫(Diabroticavirgifera)和抗草甘膦类除草剂特性的玉米品系,本研究的目的是建立该品系的转化事件特异性定性检测方法的标准。根据转基因玉米MON88017的旁侧序列信息，在左边界的结合位点处设计一系列引物组合，在筛选出最佳引物组合后，优化了该引物组合的反应体系，建立了转基因玉米MON88017转化事件特异性定性PCR检测方法。全国7家实验室的验证结果表明，该方法能够特异性检测样品中MON88017转化事件，检测灵敏度均达到0.10%以上，且检测结果具有良好的可重复性、可重现性。本方法符合标准检测特异性强、灵敏度高、重复性好的要求，为我国抗虫耐除草剂玉米MON88017检测和转基因生物安全管理制度的实施提供了相应的技术支撑。关键词
转基因玉米，MON88017，左边界，旁侧序列，定性PCR，循环验证
Event-specificPCRDetectionMethodofTransgenicMaizeLineMON88017andItsStandardization
QuYong1,2WuYuhua1WuGang1CaoYinglong1
LuChangming1*
1OilcropsResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,KeyLaboratoryofOilCropBiology,MinistryofAgriculture,Wuhan430062,China；2CollegeofAgronomy,JiangxiAgriculturalUniversity,Nanchang330045,China*Correspondingauthor,[email protected]:10.3969/j.issn.1674-7968.2010.06.027
AbstractGeneticallymodifiedcorn(Zeamays)MON88017isdevelopedbyU.S.MonsantoCompanythrough
recombinantDNAtechnology,whichischaracterizedbyresistancestomaizebeetles(Diabroticavirgifera)andtoglyphosateherbicide.Thepurposeofthisstudyistodevelopandstandardizetheevent-specificqualitativedetectionmethodofthislineinChina.BasedontheinformationoftheflankingsequencesGMmaizeMON88017,aseriesofprimercombinationsweredesignedintheleftmarginofthebindingsite.Thebestprimerpairwasselectedandthereactionsystemwasoptimizedwiththebestprimerpair.ThemaizeMON88017events-specificqualitativePCRdetectionmethodwasestablished.Aftervalidatedby7externallaboratories,resultsshowedthatthismethodcouldspecificallydetectthesamplesofMON88017eventwiththedetectionsensitivityabout0.1%,andhadagoodrepeatabilityandreproducibility，thussuitablefordetectionofthecornMON88017andatechnicalsupportfortheimplementationofthebiosafetymanagementregulationsinChina.Keywords
Geneticallymodifiedcorn,MON88017,Leftborder,Flankingsequence,QualitativePCR,Validation
种最多，有44个。在中国玉米是最重要的作物之一，
种植面积和总产均居第2位。
随着人口的增加和经
玉米是全球分布最广的粮食作物，目前获准商业化生产的144个转基因品种中，转基因玉米的品
DOI:10.3969/j.issn.1674-7968.2010.06.027基金项目：本研究由转基因生物新品种培育重大专项（No.2008ZX08012-003，No.2008ZX08012-005）和农业部农业行业标准制定和修订项目计划（农财发〔2008〕128号）共同资助收稿日期：2010-03-18接受日期：2010-05-24
转基因玉米MON88017转化事件特异性定性PCR检测方法及其标准化
1209Event-specificPCRDetectionMethodofTransgenicMaizeLineMON88017andItsStandardization
济的发展，中国粮食的进口特别是饲料的进口呈增加趋势，
2006年以来，中国玉米出口极显著下降，而进口增加，有趋势表明中国未来会增加饲料粮食的进口(王关林等,2002)。
转基因玉米MON88017是美国孟山都公司通过DNA重组技术开发的具有抗玉米根叶甲虫和抗草甘膦类除草剂特性的玉米品系。其含有两个外源基因(Cry13Bb1和Cp4epsps)表达盒，插入序列大小为7.1kb。Cry13Bb1基因表达盒含有35S启动子、小麦叶绿体A/B结合蛋白的非翻译前导链序列、actin1内含子和来源于土壤杆菌的基因Cry13Bb1、小麦HSP17蛋白的末端非翻译区编码序列，该表达盒产生玉米根叶甲虫抗性；
Cp4epsps基因表达盒则含有actin1启动子、actin1内含子、拟南芥叶绿体转移肽CPT2，Cp4epsps基因和NOS终止子，来源于农杆菌CP4菌株的Cp4epsps基因及其表达盒产生草甘膦除草剂抗性。
目前转基因玉米MON88017已在美国、加拿大、阿根廷和智利进行商业化种植，孟山都公司于2007年向我国递交申请《转Cry13Bb1和Cp4epsps基因抗虫和抗草甘膦玉米MON88017作为加工原料进口安全证书》
。由于该品种已经大面积商业化生产，其产品很可能已经出现在我国进口玉米及其产品之中，但是目前国际上尚未公布抗虫耐除草剂玉米MON88017及其衍生品种转化事件特异性定性检测方法的标准，相关检测方法的研究也尚未标准化(袁磊等,2010)，制约了对该品种的监管，建立该品种的检测方法势在必行。
PCR技术是进行转基因产品检测时应用得最广泛的检测方法，包括筛选检测、基因特异性检测、载体特异性检测和事件特异性检测(Xuetal.,2005；许文涛等,2008)。筛选检测主要用于检测是否转基因，是以转基因产品的通用元件和标记基因为特异性扩
增片段，常见的筛选元件有CaMV35S启动子、CaMV35S终止子、Nos终止子、OCS终止子、Bar、NPTII等(聂淑晶等,2008）；基因特异性检测是对目的基因进行检测，检测转的是什么基因；载体特异性检测是在转化载体中具有完整表达能力的目的基因的基因盒(genecassette)上设计引物，
是确定转基因品种来自什么转化载体(金芜军等,2004)；转化事件特异性检测则是检测外源基因在受体基因组的插入位点，由于插入位点的唯一性特征，转化事件特异性检测可以准确判断转基因品种是来自哪个转化事件，因此可以区分来自相同转化载体的不同转化事
件(Yangetal.,2005；
Wuetal.,2008)。本研究的目的是根据转基因玉米MON88017的旁侧序列，建立抗虫耐除草剂转基因玉米MON88017及其衍生品种的定性PCR检测方法。
1结果与分析
1.1旁侧序列的确立
MON88017旁侧序列的左边界旁测序列长为1461bp，其中1~1112bp为玉米基因组序列，1113~1461bp为载体序列；右边界旁测序列长为3525bp，其中1~453bp为载体序454~3525bp为玉米基因组序列(图1A)。1.2MON88017检测体系建立1.2.1引物的设计及筛选
对MON88017的左右边界设计引物进行分析得出，MON88017左边界设计的引物质量更好，故本实验选用MON88017左边界来建立相关的检测体系，在结合位点处各设计4条正、反单向引物(表1)，然后两两间组合，共16个组合。扩增外源插入载体和玉米基因组连接区的序列，扩增产物的大小均在200bp左右。应用通用的PCR反应条件，用组合的引物同时进行PCR扩增，
设置3个重复，重复3次实验，选择重现性最好、灵敏度最高、扩增条带最亮的引物。最后选定针对左边界旁侧序列设计的引物组合,扩增片段的大小为198bp(图1B)：
MON88017-LF1：
5'-TTGTCCTGAACCCCTAAAATCC-3'；MON88017-LR3：
5'-CCCGGACATGAAGCCATTTA-3'。为了进一步确定引物对MON88017-LF1/MON88017-LR3的扩增稳定性，对选定的引物对用SYBRGreen1染料法进行荧光定量反应进行验证。4
表1引物及碱基组成Table1Oligonucleotideprimers引物名称引物序列(5'~3')PrimernameSequence(5'~3')
Mon88017LF1TTGTCCTGAACCCCTAAAATCCMon88017LF2CTAAGCAGCAGAATCGTGTGACAMon88017LF3CTTCTAAATACCCGATCGAGCGMon88017LF4CTAGCACTCTCCTCCAACACAMon88017LR1CGCCTATAAATACGACGGATCGMon88017LR2AATAACGCTGCGGACATCTACAMon88017LR3CCCGGACATGAAGCCATTTAMon88017LR4
GCTGCGGACATCTACATTTTTG
1210JournalofAgriculturalBiotechnology
玉米基因组序列MaizeDNAsequence
F
bpbp
1112
198
349
453
3072
A
R
插入基因序列
InsertDNAsequence
玉米基因组序列MaizeDNAsequence
农业生物技术学报
947
1145
B
图1转基因玉米MON88017旁侧序列图示
A：MON88017旁侧序列载体图及引物设计位置，加粗箭头代表最佳引物的设计位置和方向；B：MON88017左边界旁侧序列，大写字母代表植物基因组序列，小写字母代表插入的基因组序列，箭头代表最佳引物的设计位置和方向Figure1JunctionfragmentofthetransgenicmaizeeventMON88017
SchematicdiagramoftheinsertedT-DNAregionofgeneconstructforeventMON88017.AdjacentsolidlinesrepresentrapeseedA：
genome，Theadjacentsolidarrowsshowthelocationandorientationoftheoptimalprimers;B：Characterisationofthetransgeniccornthep1antDNAsequenceincapitals，eventMON88017leftborderjunctionsite.TheinsertDNAsequenceisdepictedinlowercase，Thearrowsshowthelocationandorientationoftheoptimalprimers
0.5
荧光
Fluorescence
0.4荧光Fluorescence
0.30.20.100
10
20
循环数Cycle
30
40
A
75
80
T/℃
85
90
B
图2引物对MON88017-LF1/MON88017-LR3定量扩增曲线(A)及熔解曲线(B)
Figure2Real-timePCRamplificationplots(A)andmeltingcurves(B)forprimerpairMON88017-LF1/MON88017-LR3
个重复的实验结果表明，用MON88017-LF/MON88017-LR引物组合进行的扩增，有明显的扩增其溶解曲线也只有一个特曲线(图2A)且重复性好，
异的峰值(图2B)，实验进一步证明该引物组合具有良好的扩增稳定性。1.2.2Mg2+浓度的优化
PCR反应体系中，Mg2+的浓度尤为重要，其直接影响着引物的退火的特异性，产物的特异性，以及酶1.50、2.00、2.50和3.00mmol/L6个浓度梯度进行PCR分析，结果显示，当Mg2+浓度低于1.50mmol/L
时，没有预期片段的扩增，高于2.00mmol/L时，均有目的片段的出现，但在2.50mmol/L时，效果最佳(图3)。
1.2.3引物浓度的优化
再对PCR反应体确立体系中最佳Mg2+浓度后，
系中引物的终浓度进行优化。对0.10、0.15、0.20、0.25、0.50和1.00μmol/L6个浓度梯度的PCR分析，结果表明，6个浓度梯度均能扩增出预期目的片带增加，当引物终浓度为0.20μmol/L时扩增效果最好(图4)。
1.00、段，的催化能力的准确性(王关林等,2002)。对0、低浓度时扩增的条带不亮，浓度过高时，非特异条
转基因玉米MON88017转化事件特异性定性PCR检测方法及其标准化
1211Event-specificPCRDetectionMethodofTransgenicMaizeLineMON88017andItsStandardization
1.2.4退火温度的优化
在体系中Mg2+终浓度和引物终浓度确立的基础
上，根据引物设计时所设置的Tm值范围，共设计了54、56、58和60℃4个退火温度，对反应体系进行PCR反应的扩增，结果表明4个温度梯度下均能获得预期的目的片段(图5)，但在58℃时PCR反应效果最优。1.3实验验证1.3.1特异性检测
参照上述优化的体系，用转化事件特异性引物
MON88017-LF1/MON88017-LR3扩增6个转基因玉
米品种(Bt176、Bt11、MON810、NK603、T25和GA21)、3个非转基因玉米品种(苏玉糯1号、苏玉糯2号和超甜玉米2018)及其他一些非玉米品种(油菜、棉花、大豆、小麦和水稻)。扩增结果表明，引物MON88017-LF1/LR3能特异的从MON88017样品中扩增出预期的产物，而在其他样品中没有预期扩增产物(图6)，表明该PCR扩增体系具有良好的扩增特异性。1.3.2灵敏度测试
将抗虫耐除草剂玉米MON88017的DNA和非转基因玉米DNA按不同比例(W/W)混合，MON88017DNA含量分别为10.00％、1.00％、0.10%、0.05%、0.01%和0%。用梯度稀释的MON88017DNA做模板，进行PCR扩增，检测方法的检测灵敏度。结果表明，在MON88017DNA含量大于0.10%时，均有明显的目标条带出现，在浓度为0.05%时，目标条带变得模糊，当DNA的浓度低于0.01%时，没有目标带的出现(图7)，说明检测引物MON88017-F/R的检测灵敏度能够达到0.10%。1.3.3重演性验证
对实验研制的转基因玉米MON88017转化事件特异性序列的检测方法，首先在实验室内不同人员间，对其特异性和灵敏度进行比对实验，结果与预期相同，说明该方法在实验内部具有很好的可重复性。
为了测试方法的重演性，在全国7家同行实验室中对方法的检测特异性和灵敏度进行测试。农业部转基因植物环境安全监督检验测试中心(北京)、农业部转基因植物用微生物环境安全监督检验测试中心(北京)、农业部转基因植物环境安全监督检验测试中心(长春)、农业部转基因植物环境安全监督检验测试中心(济南)、农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心(合肥)、农业部转基因植物环境安全监督检验测试中心(上海)和农业部农产品质量安全及转基
bp
M123456
[***********]00
图3MON88017检测体系中Mg2+浓度的优化
M：2000bpDNAmarker；1~6：Mg2+浓度分别为0、1.00、1.50、2.00、2.50和3.00mmol/L
Figure3OptimizationofMg2+concentrationinMON88017detectionsystem
M：2000bpDNAmarker;1~6：Mg2+correspondto0,1.00,1.50,
2.00,2.50and3.00mmol/L,respectively2000bpM123456
[**************]0
图4MON88017检测体系中引物浓度的优化
M：2000bpDNAmarker；1~6：引物浓度分别为0.10、0.15、0.20、0.25、0.50和1.00μmol/L
Figure4OptimizationofprimersconcentrationinMON88017detectionsystem
M：2000bpDNAmarker;1~6：Primerscorrespondto0.10,0.15,0.20,0.25,0.50and1.00μmol/L,respectively
M
1
2
3
4
2000bp[**************]0
图5MON88017检测体系中Tm的优化
M：2000bpDNAmarker；1~4：Tm分别为54、56、58和60℃Figure5OptimizationofTminMON88017detectionsystemM：2000bpDNAmarker;1~4：Tmcorrespondto54,56,58and60℃,respectively
因生物产品成分监督检验测试中心(杭州)共7家第三方检测机构对该检测方法的特异性和灵敏度进行复核验证实验。
在特异性检测中，7家验证单位仅从转基因玉米MON88017样品中扩增出预期产物，而在其他转基因玉米、转基因油菜、转基因大豆、转基因棉花样品
1212农业生物技术学报
JournalofAgriculturalBiotechnology
bpM[***********]41516
[***********]00
图6MON88017事件特异性定性PCR检测
M：2000bpDNAmarker；1~16：分别以MOn88017、H2O、Bt176、Bt11、MON810、NK603、T25、GA21、苏玉糯1号、苏玉糯2号、超甜玉米2018、中油821、中棉35、中豆29、中麦9号和BT63为模板
Figure6Detectionforevent-specificMON88017usingPCRM：2000bpDNAmarker;1~16：CorrespondtoMOn88017,H2O,Bt176,Bt11,MON810,NK603,T25,GA21,Suyunuo1,Suyunuo2,Chaotianyumi2018,Zhongyou821,Zhongmian5,
Zhongdou29,Zhongmai9,andBT63,respectively
bp
M[***********]415161718
[**************]0
图7MON88017事件特异性检测方法灵敏度检测
M：2000bpDNAmarker；1~3：MON88017DNA含量为10％；4~6：MON88017DNA为1％；7~9：MON88017DNA为0.1%；10~12：MON88017DNA为0.05%；13~15：MON88017DNA为0.01%；16~18：MON88017DNA为0%
Figure7SensitivitytestsoftheMON88017event-specificdetectionmethods
M：2000bpDNAmarker;1~3：10%;4~6：1%;7~9：0.10%;10~12：0.05%;13~15：0.01%;16~18：0%,respectively
及非转基因玉米样品中未扩增出预期产物，表明本研究建立的抗虫耐除草剂玉米MON88017及其衍生品种的定性PCR检测方法可以特异性地检出抗虫耐除草剂玉米MON88017，具有高度的特异性。
在灵敏度测试中，2家验证单位从MON88017含量为0.10%及以上的样品中检测出预期DNA片段，5家验证单位从MON88017含量为0.05%及以上的样品中检测出预期的DNA片段。表明该定性PCR检测方法具有高度的检测灵敏度，达到0.10%。
经重演性分析，7家验证单位的特异性检测结构和灵敏度测试结果非常吻合，表明我们研制的MON88017转化事件特异性PCR检测方法具有良好的重演性。
2讨论
为了防范农业转基因生物对人类、动植物、微生物和生态环境构成危险或潜在危险，依据《农业转基因生物安全管理条例》，对农业转基因生物的研究、试验、生产、加工、经营和进、出口活动要加强监管。孟山都公司研发的抗虫耐除草剂玉米MON88017已获准进口到我国用作加工原料(农基安证字(2007)第258号)，该品种在进口、运输、加工或销售过程中存在流散到环境中的可能性，因此要对其加强安全监管。而建立转基因玉米MON88017的检测标准是进行安全监管的前提。
袁磊等曾经建立了转基因玉米MON88017的事件特异性检测方法，扩增产物446bp(袁
磊等，
2010)。由于转基因产品在加工过程中，随着加热温度的升高和加热时间的延长，DNA会出现不同程度的降解，如，玉米样品121℃加热60min，DNA被严重降解，降解后的DNA片段短于329bp(Chiuehetal.，2002)。因此，用于PCR检测的PCR产物要尽可能的短，通常要求用于定性检测的PCR产物的长度在200bp左右，而定量检测的PCR产物的长度在60~150bp之间(ISO21569)。因此袁磊等人研制的方法，由于扩增产物过长，不适宜作为检测转基因玉米MON88017的标准方法，而且袁磊等人研制的方法的特异性、灵敏度和重复性还有待实验室间的循环验证实验。
本研究展现了研制转基因玉米MON88017检测标准的完整过程。首先以转基因玉米MON88017的左边界序列为检测靶标，设计多条正向引物和反向引物，将正向引物和反向引物两两组合进行PCR扩增，筛选出最佳引物组合MON88017LF1/MON88017LR3；然后优化了引物组合MON88017LF1/MON88017LR3的反应条件如Mg2+，引物浓度、退火温度等，从而确定了最佳引物对和最适反应条件。然后，采用优化的反应条件，对引物对MON88017LF1/MON88017LR3的扩增特异性、灵敏度和重复性进行了分析，分析结果满足标准方法的要求，从而初步建立了检测抗虫耐除草剂玉米MON88017的事件特异性定性PCR方法。最后，邀请7家国内具有资质的实验室对本研究建立的方法进行循环验证，循环验证结果表明，本研究建立的抗虫耐除草剂玉米MON88017及其衍生品种事件特异性定性检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好，
转基因玉米MON88017转化事件特异性定性PCR检测方法及其标准化
1213Event-specificPCRDetectionMethodofTransgenicMaizeLineMON88017andItsStandardization
具有合理性、准确性、可操作性的优点，因此本研究建立的定性PCR方法可以作为检测抗虫耐除草剂玉米MON88017的标准方法。
本研究建立的转基因玉米MON88017检测方法
形成国家标准后，可以作为我国转基因玉米MON88017及其衍生品种事件特异性定性检测的标准，利用该标准方法可以准确鉴定出利用MON88017作为亲本非法转育出的衍生品种，从而防止转基因玉米MON88017流散到环境中造成生态风险。因此，该标准方法的建立，不仅能够满足我国转基因生物安全管理的需要，而且可以进一步完善我国的转基因产品检测标准体系。
3材料与方法3.1材料
转基因玉米(Zeamays)MON88017及其受体品
种由孟山都公司提供，转基因玉米Bt176、Bt11、
MON810、NK603、T25、GA21、非转基因玉米品种苏
玉糯1号、苏玉糯2号、超甜玉米2018、甘蓝型油菜
(Brassicanapus)品种中油821、棉花(Gossypiumhirsutum)品种中棉35、大豆(Glycinemax)品种中豆29、小麦(Triticumaestivum)品种中麦9号和转基因水稻品种BT63的种子由本实验室收集保存。3.2样品制备
用DNA试剂盒(TaKaRa)提取实验材料的DNA，
提取样品的纯度和浓度用荧光光度计VersafluorTmFluorometer(BIO-RAD)进行检测。
3.3转基因玉米MON88017外源基因插入位点旁侧序列的获得
建立转基因玉米MON88017转化事件特异性的检测方法，要获取MON88017外源基因插入位点旁侧序列。通过网络查阅了转基因玉米MON88017的专利文件(UnitedStatesPatentApplication[1**********])，通过该专利文件了解抗虫耐除草剂玉米MON88017的旁侧序列信息；然后搜索NCBI的核酸数据库，获取到MON88017的左边界旁侧序列(登录号DJ058150)和右边界旁侧序列(登录号DJ058151)的序列信息。3.4设计及筛选最佳引物组合
引物设计与合成：运用Primerpremier5.0在插入序列的左右边界分别设计单向引物，选择引物设
计最为合适的边界合成引物，引物由上海生工合成。引物筛选：对设计的引物进行筛选，以MON88017基因组为模板，引物每两两间相互组合进行扩增，筛选特异性强、灵敏度高、扩增稳定的引物组合。PCR在25μL的体系中进行，包括：40ngMON88017DNA1μL，10×PCRbuffer2.5μL，2.0mol/LMgCl22.0μL，200μmol/LdNTPS0.5μL,10
μmol/Lprimer0.25μL，0.5U的TaqDNA聚合酶(Fermentsa)，反应条件：94℃2min，1个循环；94℃20s，60℃30s，72℃30s，40个循环；72℃2min，1个循环。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
对定性筛选合适的引物组合，应用SYBRGreen1染料法进行荧光定量反应进行验证，反应在
20μL体系：SYBRGreenReal-timePCRMaster10
μL，l0μmol/LMon88017正反向引物各0.25μL，40ng基因组DNA1μL，ddH2O7.4μL。反应程序：94℃
2min；94℃15s，62℃15s，72℃30s，读板，78℃2s，
读板，82℃2s，读板；40个循环；72℃5min；从65℃
到95℃绘制溶解曲线，每3s读取0.1℃。
3.5建立转化事件MON88017特异性检测体系筛选出最佳扩增引物组合后，设置不同的Mg2+
浓度，引物浓度，退火温度梯度对反应体系进行优化，令引物对在优化的体系下扩增特异性、灵敏度、稳定性更好，实验设置阴性对照，重复3次，反应在25μL的体系中进行。
3.6比对及循环验证实验对实验所确立检测方法的特异性和灵敏度，先进行实验室内不同人员间的比对，再进行循环验证实验，保证检测方法的先进性、合理性、准确性。
致谢
农业部科技发展中心基因检定处组织了本方法的循环验证，农业部转基因植物环境安全监督检验测试中心(北京)，农业部转基因植物用微生物环境安全监督检验测试中心(北京)；农业部转基因植物环境安全监督检验测试中心(长春)，农业部转基因植物环境安全监督检验测试中心(济南)，农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心(合肥)；农业部转基因植物环境安全监督检验测试中心(上海)，农业部农产品质量安全及转基因生物产品成分监督检验测试中心(杭州)参加了本方法的循环验证试验，特此致谢。
1214农业生物技术学报
JournalofAgriculturalBiotechnology
参考文献
ChiuehL.C.,ChenY.L.,andShihD.Y.C.,2002,Studyonthe
detectionmethodofsixvarietiesofgeneticallymodifiedmaizeandprocessedfoods,JournalofFoodandDrugAnalysis,10:25~33
JinW.J.,JiaS.R.,andPengY.F.,2004,Comparisonoflabeling
policyofgeneticallymodifiedproductsindifferentcountriesandterritories,NongyeShengwuJishuXuebao(JournalofAgriculturalBiotechnology),12(1):1~7(金芜军,贾士荣,彭于发,2004,不同国家和地区转基因产品标识管理政策的比较,农业生物技术学报,12(1):1~7)NieS.J.,WuY.H.,WuG.,XiaoL.,andLuC.M.,2008,Junction
sequenceofthetransgenicrapeseedeventRF1andthemethodsofqualitativePCRdetection,ZhongguoYouliaoZuowuXuebao(Chinesejournalofoilcropsciences),30(3):265~271(聂淑晶,武玉花,吴刚,肖玲,卢长明,2008,转基因油菜RF1的外源基因插入位点分析与事件特异性检测方法研究,中国油料作物学报,30(3):265~271WangG.L.,andFangH.J.,eds.,2002,PlantGeneEngineering,
ChinaSciencePress,Beijing,China（王关林,方宏筠,编著,2002,植物基因工程,科学出版社,中国,北京）WuG.,WuY.H.,XiaoL.,andLuC.M.,2007,Event-specific
qualitativeandquantitativePCRdetectionmethodsfortransgenicrapeseedhybridsMS1×RF1andMS1×RF2,JournalofAgriculturalFoodChemistry,55(21):8380~8389WuG.,WuY.H.,XiaoL.,andLuC.M,2008,Event-specific
qualitativeandquantitativePCRmethodsforthedetectionofgeneticallymodifiedrapeseedOxy-235,TransgenicResearch,17:851~862
WuG.,WuY.H.,XiaoL.,andLuC.M.,2008,Event-specific
qualitativeandquantitativePCRmethodsfordetectionof
geneticallymodifiedrapeseedMs8×Rf3basedontherightborderjunctions,JournalofAOACInternational,88:577~584
XuW.T.,BaiW.B.,LuoY.B.,YuanY.F.,andHuangK.L.,
2008,Researchprogressindetectiontechniqueforgeneticallymodifiedorganisms,NongyeShengwuJishuXuebao(JournalofAgriculturalBiotechnology),16(4):714~722(许文涛,白卫滨,罗云波,元延芳,黄昆仑,2008,转基因产品检测技术研究进展,农业生物技术学报,16(4)：714~722)
XuX.D.,LiY.C.,ZhaoH.,WenS.Y.,WangS.Q.,HuangJ.,
HuangK.L.,andLuoY.B.,2005,RapidandreliabledetectionandidentificationofGMeventsusingmultiplexPCRcoupledwitholigonucleotidemicroarray,JournalofAgricultureandFoodChemistry,53:3789~3794
YangL.T.,PanA.H.,ZhangK.W.,YinC.S.,QianB.J.,ChenJ.
X.,HuangC.,andZhangD.B.,2005,QualitativeandquantitativePCRmethodsforeventspecificdetectionofgeneti-callymodifiedcottonMON1445andMON531,TransgenicResearch,14:817~831
YuanL.,SunH.W.,ZhaoL.,YangC.L.,ShangY.F.,andLuX.B.,2010,
AnalysisofjunctionsequenceinthetransgenicmaizeMON88017andthemethodsofqualitativePCRdetection,ZuowuXuebao(ActaAgronomicaSinica),36(2):361~364(袁磊,孙红炜,赵蕾,杨崇良,尚佑芬,路兴波,2010,转基因玉米MON88017旁侧序列分析及定性PCR检测,作物学报,36(2):361~364)
ISO21569,2005,FoodstuffMethodsofAnalysisforTheDetection
ofGeneticallyModifiedOrganismsandDerivedProductsQualitativeNucleicAcidBasedMethods;InternationalStandardizationOrganization:Geneva,Switzerland