细菌的生理生化实验
1 目的
1.1 了解细菌鉴定中常用的生理生化试验反应原理
1.2 掌握测定细菌生理生化反应的技术和方法
2 原理
各种微生物在代谢类型上表现了很大的差异。由于细菌特有的单细胞原核生物的特性，这种差异就表现的更加明显。不同细菌分解、利用糖类、脂肪类和蛋白类物质的能力不同，所以其发酵的类型和产物也不相同，也就是说，不同微生物具有不同的酶系统。即使在分子生物学技术和手段不断发展的今天，细菌的生理生化反应在菌株的分类鉴定中仍有很大作用。
3 材料
3.1 菌种
大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、产气肠杆菌
（Enterobacter aerogenes）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的斜面菌种
3.2 培养基
葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖或蔗糖）
3.3 试剂
40％NaOH 溶液、肌酸、甲基红试剂、吲哚试剂、乙醚、1.6%溴甲基酚紫指示剂。
3.4 器具
超净工作台、恒温培养箱、高压灭菌锅、试管、移液管、杜氏小套管。 4 流程
糖发酵试验→V-P 试验→甲基红试验→吲哚试验
5 步骤
(一) 糖类发酵试验
1 目的
了解不同细菌分解利用糖的能力及实验原理，并掌握其操作方法． 2 原理
可根据细菌分解利用糖能力的差异表现出是否产酸产气作为鉴定菌种的依据。是否产酸，可在糖发酵培养基中加入指示剂溴甲酚紫（即
B.C.P 指示剂，其pH 在5.2以下呈黄色，pH 在6.8以上呈紫色），经培养后根据指示剂的颜色变化来判断。是否产气，可在发酵培养基中放入倒置杜氏小管观察。
3 材料
3.2 菌种
大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、产气肠杆菌
（Enterobacter aerogenes）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）的斜面菌种
3. ３ 培养基
葡萄糖、蔗糖和乳糖发酵培养液试管
４ 流程
发酵液试管→标记→接种→培养→观察→记录
5 步骤
5.1 试管标记 图 9-1 糖发酵产气
取分别装有葡萄糖、蔗糖和乳糖发酵培养液试管各 Ａ 不产气；Ｂ 产气
4支，每种糖发酵试管中均分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌和空白对照。
5.2 接种培养
以无菌操作分别接种少量菌苔至以上各相应试管中，每种糖发酵培养液的空白对照均不接菌。将装有培养液的杜氏小管倒置放入试管中（图9-1），置37℃恒温箱中培养，分别在培养24h 、48h 、和72h 观察结果。
5.3 观察记录
与对照管比较，若接种培养液保持原有颜色，其反应结果为阴性，表明该菌不能利用该种糖，记录用“－”表示；如培养液呈黄色，反应结果为阳性，表明该菌能分解该种糖产酸，记录用“＋”表示。培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，表明该菌分解糖能产酸并产气，记录用“＋”表示；如杜氏小管内没有气泡为阴性反应，记录用“－”表示。
（二） 乙酰甲基甲醇试验(V．P 试验)
1 目的
了解鉴别不同肠杆菌科各菌属的乙酰甲基甲醇试验原理，并掌握其操作方法．
2 原理
某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养液中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧，氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V －P （+）反应。
3 材料
3.1 菌种
大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、产气肠杆菌
（Enterobacter aerogenes）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的斜面菌种
3.2 培养基
葡萄糖蛋白胨培养液的试管
４ 流程
培养液试管→标记→接种→培养→观察→记录
5 步骤
5.1 标记试管
取5支装有葡萄糖蛋白胨培养液的试管，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌、枯草芽孢杆菌和空白对照。
5.2 接种培养
以无菌操作分别接种少量菌苔至以上相应试管中，空白对照管不接菌，置37℃恒温箱中，培养24～48h 。
5.3 观察记录
取出以上试管，振荡2min 。另取5支空试管相应标记菌名，分别加
入3～5ml 以上对应管中的培养液，再加入40％NaOH 溶液10～20滴，并用牙签挑入约0.5～1mg 微量肌酸，振荡试管，以使空气中的氧溶入，置37℃恒温箱中保温15～30min 后，若培养液呈红色，记录为V.P. 试验阳性反应（用“＋”表示）；若不呈红色，记录为V.P. 试验阴性反应（用“－”表示）。
注意：原试管中留下的培养液用作甲基红试验。
（三） 甲基红试验（M.R. 试验）
1 目的
了解鉴别肠杆菌科各菌属的甲基红试验原理，并掌握其操作方法． 2 原理
肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH 值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。
3 材料
3.1 菌种
同V ．P 试验
3.2 培养基
同V ．P 试验
4 流程
培养液→指示剂→观察→记录结果
5 步骤
于V.P. 试验留下的培养液中，各加入2～3滴甲基红指示剂，注意沿管壁加入，仔细观察培养液上层，若培养液上层变成红色，即为阳性反应；若仍呈黄色，则为阴性反应，分别用“＋”或“－”表示。
（四）吲哚试验
1 目的
掌握吲哚试验(Ehrlich法) 的原理和方法
2 原理
有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚(靛基质) 。吲哚本身没有颜色，不能直接看见，但当加入对二甲基氨基苯甲醛试剂时，该试剂与吲哚作用，形成红色的玫瑰吲哚。 3 材料
3.1 菌种
测试菌株．
3.2培养基
蛋白胨水培养基
3.3 试剂
二甲基氨基苯甲醛溶液、乙醚。
4 流程
标记试管→接种→培养→观察→记录
5 步骤
5.1 试管标记
取装有蛋白胨水培养液的试管5支，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、
普通变形菌、枯草芽孢杆菌和空白对照。
5.2 接种培养
以无菌操作分别接种少量菌苔到以上相应试管中，第5管作空白对照不接种，置37℃恒温箱中培养24～48h 。
5.3 观察记录
在培养液中加入乙醚1～2ml ，经充分振荡使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入5～10滴吲哚试剂（加入吲哚试剂后切勿摇动试管，以防破坏乙醚层影响结果观察），如有吲哚存在，乙醚层呈现玫瑰红色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应，阳性用“＋”、阴性用“－”表示。
6 结果
记录生理生化反应测定结果．
细菌的生理生化实验
实验目的
巩固微生物无菌接种技术;
了解细菌鉴定中常用的生理生化实验的原理和方法
微生物的生理生化反应
微生物细胞在酶的催化下进行各种各样的生理生化反应
把微生物细胞在一定的条件下培养, 通过观察生理现象和检查代谢产物, 可以了解微生物的代谢过程和代谢的特点
由于不同的微生物可能具有不同的酶, 代谢途径和代谢产物可能也有不同, 生理生化反应是微生物分类鉴定的重要指标之一.
淀粉水解实验
淀粉培养基
+
淀粉培养基
+
接种
+
变色圈, 水解圈
培养24h
加卢哥氏碘液
I-KI
结果:
有水解圈—淀粉水解实验阳性, 用 + 表示;
无水解圈—淀粉水解实验阴性, 用 - 表示;
糖发酵实验
原理:
丙酮酸裂解生成乙酰CoA 与甲酸, 甲酸在酸性条件下在甲酸氢解酶作用下可进一步裂解生成H2和CO2——产酸产气
缺少甲酸氢解酶——产酸不产气
步骤:配制糖发酵培养基——接种——培养(约24h) ——观察结果 结果:
紫色无气泡, 既不产酸也不产气用 - 表示;
黄色无气泡, 产酸不产气, 用 + 表示;
黄色且有气泡, 产酸产气, 用 0 表示.
甲基红实验(M.R实验)
原理
微生物进行混合酸发酵, 产生各种有机酸——pH 下降——加入指示剂甲基红——红色
步骤:配制蛋白胨水培养基——接种——培养(约24h) ——加入指示剂甲基红1~2滴——观察结果
结果:
红色——M.R 实验阳性, 用 + 表示;
不变色——M.R 实验阴性, 用 - 表示;
V.P 实验
V.P 实验
步骤:配制蛋白胨水培养基——接种——培养(约24h) ——5~10d 40%KOH, 5~10d 5%a-奈酚和少量肌 醇 , 取出塞子, 用力震荡, 保温(37度15~30min)——观察结果
结果:
红色——V.P 实验阳性, 用 + 表示;
不变色——V.P 实验阴性, 用 - 表示.
实验内容
以组为单位进行淀粉水解实验, 糖发酵实验, V.P实验和M.R 实验. 实验菌种:
淀粉水解实验, 糖发酵实验:大肠杆菌, 苏云金芽孢杆菌
V.P 实验和M.R 实验:大肠杆菌, 产气杆菌
注意事项:
实验报告:
1, 列表记录实验结果
2, 思考题:第4小题
四大类细胞型微生物菌落的鉴定
初步鉴定
确证:显微镜观察
微生物菌落特征的记录和描述
菌落形态:形状, 边缘情况
大小:
表面状况:湿润, 粘稠或干燥, 隆起或扁平, 厚或薄, 是否粉末状 质地:致密或疏松
蔓延程度:
与培养基结合程度
颜色(正面, 反面, 边沿, 中心)
气味
示例
将菌株在查氏琼脂平板上25 ℃培养7d 后菌落直径18~19mm , 圆形, 边缘齐整不蔓延, 表面丝绒状并具放射状沟纹, 较厚, 中央稍凸起,, 菌丝
初为浅黄褐色近于淡粉红色, 老后颜色变深, 有黄色渗出液, 背面呈黄褐色.