磺酸化磁珠富集鱼塘水中的孔雀石绿
第39卷2011年5月
分析化学（FENXIHUAXUE）研究简报第5期753～756
DOI：10．3724/SP．J．1096．2011．00753
ChineseJournalofAnalyticalChemistry
磺酸化磁珠富集鱼塘水中的孔雀石绿
张建文
2
1
熊勇华
1
1
陈雪岚
2
李雪
3
3
林晓丽
1
李怀明
1
郭亮
*1
（南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，南昌330047）
（无锡中德伯尔生物技术有限公司，无锡214174）
（江西师范大学生命科学学院，南昌330022）
摘要（3-采用1-乙基-二甲氨基丙基）碳酰二亚胺及N-羟基硫代琥珀酰亚胺活化磁珠表面羧基，将对氨基苯磺
酸偶联在磁珠表面，获得磺酸化磁珠。以此磺酸化磁珠为吸附剂，建立了分散固相萃取富集鱼塘水中孔雀石绿的新方法，并对水体样本的最佳吸附pH值及解吸附条件进行了考察。结果表明：当水体样本pH值在3．0～6．0之间，磺酸化磁珠对水体中孔雀石绿有较好的吸附，在pH=4．0时，孔雀石绿的吸附效率达到最高，为82．4%±5．5%；乙pH4．0时，磺酸化磁珠吸附孔雀石绿的等温吸附符合腈可有效洗脱吸附在磺酸化磁珠表面的孔雀石绿。在25℃，
Langmuir模型。磁珠的最大吸附容量为66．7μg/g，Langmuir吸附平衡常数为0．375L/μg。关键词
磁珠；孔雀石绿；分散固相萃取；鱼塘水
1引言
MG）属碱性三苯甲烷类染料，孔雀石绿（Malachitegreen，由于抗菌、抗寄生虫效力较强且价格便宜，被
［1］
广泛用于池塘水的水体消毒和防治鱼类的水霉病、烂鳃病以及寄生虫病。MG易被鱼体吸收并迅速代谢为脂溶性的隐色孔雀石绿（LMG），具有致癌、致畸、致突变等副作用。许多国家都禁止将其用于水产养［2］
殖。因此，严格监控鱼塘水孔雀石绿残留量对于建立无公害水产养殖，保证食用者健康具有重要意义。目前，含MG样品的前处理一般采用液-液萃取法，然后通过强阳离子型固相萃取柱富集、净化。整
［3，4］
。分散固相萃取方法是近年来发展较快的样本前处理技术，耗时，有机溶剂使用量大个过程繁琐、
［5］
具有快速、简便、廉价、高效、稳定、安全且可直接用于浑浊样本的前处理等优点。然而，分散固相萃取采用的吸附剂粒径均为几十微米，材料比表面积较小，且不能在溶液中悬浮。纳米级超顺磁性材料因［6］［7］其良好的磁响应性以及溶液分散性，在分子生物学、生物医学以及环境科学等领域得到了广泛应
［8，9］
。用。近年来，有关表面功能化磁珠在食品安全样本前处理方面的报道逐渐增多
本研究将纳米至亚微米级磺酸化磁珠应用于水样中孔雀石绿的富集，有效地简化了孔雀石绿样本
前处理步骤，缩短了前处理时间。建立了针对含痕量孔雀石绿鱼塘水样品的分散固相萃取前处理方法。
2
2．1
实验方法
仪器与试剂
Waters2489高效液色谱仪（Waters公司）；磁架（无锡中德伯尔公司）；FS-1200超声波处理器（上海
1200EX透射电镜生析超声仪器有限公司）；PSANANO2590Zeta电位分析仪（英国马尔文公司）；JEM-（日本电子公司）；FTIRNicolet5700傅里叶变换红外光谱仪（美国热电尼高力公司）；离心机（Sigma公
司）；纯水仪（Milipore公司）。
（3-N-孔雀石绿（MG），1-乙基-二甲氨基丙基）碳酰二亚胺（EDC）、羟基硫代琥珀酰亚胺（Sulfo-NHS）、FeCl3·6H2O、FeCl2·4H2O（分析纯，Sigma公司）；苯乙烯、丙烯酸、对氨基苯磺酸（分析纯，上海
国药集团化学试剂有限公司）；其它试剂均为分析纯。实验用水为超纯水。池塘水，取自当地鱼塘。
2．2磁珠的制备方法2．2．1
羧基化磁珠的合成
10］参照文献［方法，采用化学共沉淀法合成超顺磁性Fe3O4纳米颗粒，再
2010-08-13-12-15接受收稿；2010-本文系2009年江西省留学人员科技活动基金（No．Z04925）和江西省教育厅科学技术研究基金（No．09155）资助项目
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分析化学第39卷
V/V）混合液悬将Fe3O4纳米颗粒表面油酸化，无水乙醇洗涤后用氮气吹干。用苯乙烯-环己烷（10∶1，
浮Fe3O4纳米颗粒，超声5min，将有机相转入SDS和NaHCO3溶液悬浮，继续超声15min，乳化形成微
95%乙醇洗涤磁继续反应10h。磁架吸附磁珠，乳液。加K2S2O8，于70℃反应30min后加入丙烯酸，珠表面至溶液无泡沫产生。
2．2．2磺酸化磁珠的合成及预处理
取500mg羧基化磁珠（表面羧基密度为2．5mmol/g），分散于
15mL0．1mol/L硼酸盐缓冲液（pH5．0）中，Sulfo-NHS摩尔比为1∶2∶2按磁珠表面羧基密度与EDC、
NHS，分别加入47．9mgEDC以及54．3mgSulfo-混合液室温振荡反应0．5h。磁架回收磁珠，以10mL0．1mol/L硼酸盐缓冲液（pH5．0）洗涤磁珠两次。将10倍于磁珠表面羧基密度的对氨基苯磺酸溶液
加入活化磁珠体系，溶液调至pH8．0，室温下振荡反应2h。磁架回收磁珠，制备好的磺酸化磁珠采用3%NaOH以及3%HCl浸泡洗涤各2h，最后以0．01mol/L磷酸盐缓冲液（pH7．饱和食盐水浸泡1h、
0）洗涤磁珠至pH值为中性，并将磁珠重悬于0．01mol/L磷酸盐缓冲液（pH7．0）中，于4℃保存备用。2．3磺酸化磁珠富集水体中MG的检测流程
取10mL鱼塘水，加入适量磺酸化磁珠，振荡混匀，避光静置吸附10min，磁架分离磁珠，以0．01mol/L磷酸盐缓冲液（pH5．0）洗涤磁珠一次，200μL洗脱溶剂洗脱磁珠吸附的MG，洗脱液经0．45μm滤膜过滤后直接用高效液相色谱法检测。流动相为50mmol/L乙酸铵-V/乙腈缓冲液（4∶6，V，pH4．5），5mm），洗脱液流速为1．0mL/min；SunfireC18色谱柱（250mm×4．6mm，柱温25℃；二极检测波长618nm；样品进样量20mL。管阵列紫外检测器，
3
3．1
结果与讨论
磺酸化磁珠的表征
采用微乳法合成的磁珠经透射电镜分析（图1），粒径分布大致范围为70～150nm，大部分磁珠粒
NHS法将对氨基苯磺酸基修径为100～120nm。采用EDC/Sulfo-饰至羧基化磁珠表面，获得的磺酸化磁珠用傅立叶红外光谱仪扫
－1
在1174cm处出现了描分析。其红外图谱与羧基化磁珠相比，
［11］
一个新峰，该峰由磺酸基团中SO键的对称伸缩振动产生，说明磁珠表面存在磺酸基团。测得磺酸基修饰以及羧基修饰磁
存在一定的差珠的Zeta电位分别为－28．182和－21．932mV，
异。磺酸基与羧基相比，具有更低的pKa值。
表面的电位，，同时增强了磁珠对溶液中阳离子物质（如孔雀石绿）的吸附，且使富集过程不易受溶液pH值以及其它离子的干扰。
3．2磺酸化磁珠富集水体中MG的条件优化3．2．1
pH值对磁珠富集水体中MG的影响
图1Fig．1
磁珠电镜图
TEMimageofmagneticbeads
溶液中MG的电离度及磁珠表面的Zeta电位是影响磁
MS珠静电吸附MG的重要因素。因此，溶液的pH值是影响磁珠富集水体中MG的主要因素。取经LC-确证不含MG的鱼塘水10mL，分别加入MG至终浓度为0．5μg/L。用1mol/LNaOH或HCl调节鱼塘
4，5和6，水分别至pH3，再分别加入5mg磁珠富集溶液中的MG，用高效液相色谱法测定MG的富集
量，计算回收率，结果见表1。从表1可见，在pH3～6之间，磺酸化磁珠对水体中MG均有较好的吸附
效率（均大于69．3%）；在pH=4．0时，吸附效率达到最高82．4%±5．5%。MG的pKa=6．90，在pH4．0
［12］［12］
MG完全离子化，时，带正电荷；磺酸基的pKa=0．70，在pH4．0时，磺酸基的酸式解离几乎不受影响，MG。表1鱼塘水的pH值对MG回收率的影响
3．2．2
不同洗脱液对回收率的影响在不含MG的鱼塘水中添加MG至终浓度为0．5μg/L，调节pH至4．0。用磁架分离磁珠后分别用不同体积比的甲醇Table1EffectofpHvalueonmalachiteblue（MG）
recoveryinfishpondwater
pH3456
第5期张建文等：磺酸化磁珠富集鱼塘水中的孔雀石绿
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80∶20，70∶30，V/V）及纯乙腈4种洗脱溶剂洗脱磁珠上的MG，液（90∶10，洗脱溶剂用量为200μL。用
4种洗脱溶剂对回收率的影响差异不大，不同洗脱溶剂洗脱时的MG回收率见表2。从表2可见，为了本研究选择纯乙腈作为洗脱溶剂。便于液相色谱分析，
表2洗脱溶剂对MG回收率的影响
3．3
磺酸化磁珠吸附模式及饱和吸附容量的研究
pH4．0的条件下，在25℃，取2mg磺酸化磁珠富集10mL水体中MG，其中MG浓度为5～50μg/L。
依据MG浓度及磺酸化磁珠吸附量绘制吸附等温线（见图2）。通过拟合等温吸附方程分析磺酸化磁珠对MG的吸附机制，并推算磁珠的饱和吸附容量。
其吸附行为可用Langmuir吸附方程描述：
Ce/q=1/（Kqm）+Ce/qm
q为吸附达平衡时单位质量磁珠对MG的吸附量其中，（μg/g），Ce为吸附达平衡时MG的浓度（μg/L），qm为单位
K为Langmuir吸质量磁珠对MG的最大吸附容量（μg/g），
Ce/q为纵坐标作图，附平衡常数（L/μg）。以Ce为横坐标，
可得到一条直线。拟合得的线性方程为Y=0．015X+0．
2
04，相关系数R=0．9978。说明磁珠对MG的模式为单分子层吸附。根据等温吸附方程推算，磁珠对MG的饱和吸K=0．375L/μg。附容量为66．67μg/g，
3．4水体中MG浓度对磺酸化磁珠吸附回收率的影响
pH4．0的条件下，在25℃，用5mg磺酸化磁珠富集
图2Fig．2beads
磁珠吸附鱼塘水中MG的吸附等温线AdsorptionisothermofMGonmagnetic
10mL鱼塘水中MG，其中MG浓度为0．05～10μg/L，用高效液相色谱法测定MG的富集量，计算回收率。不同MG浓度时的回收率见表3。结果显示，水体中MG浓度在0～10μg
/L之间吸附回收率无显著性差异，均大于80%。
表3水体中MG浓度对MG回收率的影响
3．5磁珠的重复使用性
磁珠的重复使用性在其实际应用中具有重要意义。本研究考察了磺酸化磁珠重复使用5次的平均
回收率。
pH4．0的条件下，在25℃，用5mg磺酸化磁珠，富集10mLMG浓度为1μg/L的鱼塘水中的MG。使用后的磁珠按2．2．2节进行活化预处理并重复使用5次，分别计算5次的MG回收率。结果表明，经过5次使用后，回收率未见明显下降，均大于80%。3．
756
分析化学第39卷
品，按3．2节优化后的方法富集其中的MG，采用高效液相色谱法检测MG含量。其中只有1份水样检出含孔雀石绿，含量为0．12μg/L，说明本方法可用于实际鱼塘水样品中MG的检测。References
[**************]13
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EnrichmentofMalachiteGreeninFishpondWaterby
Sulfo-FunctionalizedMagneticBeads
ZHANGJian-Wen1，XIONGYong-Hua1，CHENXue-Lan2，LIXue3，LINXiao-Li1，
LIHuai-Ming1，GUOLiang*1
1
（StateKeyLaboratoryofFoodScienceandTechnology，NanchangUniversity，Nanchang330047）；
2
（CollegeofLifeScience，JiangxiNormalUniversity；Nanchang330022）
3
（WuxiZodolabsBiotechCo．Ltd，Wuxi214174）
AbstractSulfo-functionalizedmagneticbeadswerepreparedbycovalentlyconjugatingaminobenzenesulfonic
acidontocarboxylsurfaceofmagneticbeadswith1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl）carbo-diimide（EDC）/N-hydroxysulfosuccinimide（Sulfo-NHS）method．Thosebeadswereusedasdispersivesolidphaseextractionsorbent，andhence，ahighefficientextractionprocedurewasdevelopedforenrichingtraceamountsofmala-chitegreen（MG）infishpondwater．ParametersofadsorptionanddesorptionofMGincludingpHvalueoffishpondwaterandelutionsolutionwereoptimized．Resultsshowedthatsulfo-functionalizedmagneticbeadsexhibitedthehighefficiencyonenrichmentofMGinfishpondwateratpH3．0－6．0andthehighestefficiencyachievedatpH4．0（82．4%±5．5%，n=3）．AcetonitrilewaseffectiveinelutingMGonthemagneticbeads．AtpH4．0and25℃，theadsorptionbehaviorfollowedLangmuiradsorptionisothermwithamaximumadsorptioncapacityof66．67μg/gandaLangmuiradsorptionequilibriumconstantof0．375L/μg．KeywordsMagneticbeads；Malachitegreen；Dispersivesolidphaseextraction；Fishpondwater
（Received2010；152010）