动物毛发石蜡切片制作

第17卷第2期:49生 物 技 术Vol 17, No 2:49

2007年4月BIOTECHNOLOGY Apr 2007准确性, 这是指示管另一个重要作用。

参考文献:

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动物毛发石蜡切片的制作

张艺, 陈蓉, 于恩艳, 马合木提 哈力克

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(1. 新疆大学生命科学与技术学院, 新疆乌鲁木齐830046; 2新疆医科大学基础医学院科研中心, 新疆乌鲁木齐830054) 摘要:目的:探讨哺乳动物针毛横断面的快速简易的制作方法, 从毛发横断面上观察毛发微观结构。方法:取新疆部分哺乳动物(马鹿塔里木亚种Cervus elaphus yarkan densis , 藏羚羊Pantholop s hodgsoni , 野双峰驼Camelus bactrianus , 狍子Ca preolus ca preolus ) 的毛发, 先将其清洗然后经浸蜡、包埋、切片、染色、封片等一系列过程的研究, 得发毛横断面。结果:各动物毛发微观结构差异显著:马鹿塔里木亚种, 毛皮质极薄, 毛髓质占大多数; 藏羚羊, 由若干多边行空囊组成, 内部中空; 野双峰驼, 毛皮质与毛髓质所占比例相当; 狍子, 毛皮质约占2 3, 毛髓质约占1 3。结论:为利用哺乳动物毛发进行种属鉴定奠定一定科学理论基础。

关键词:动物毛发; 微观结构; 石蜡切片

中图分类号:Q954. 3; R446 文献标识码:A 文章编号:1004-311X(2007) 02-0049-03

Manu faction of Paraffin Section on Hairs of Mammal

Z HANG Yi , C HE N Rong , YU En-yan , Mahmut HALIK1

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(1.College of Li fe Science and Technology, Xi njiang Uni versity, Urumqi 830046; 2. Insititute of basic medicine, Xinjiang Medical Universi ty, Urumqi 830054, Chi na)

Abstract :Objective :The research ai med to induce the rapid and si mple methods for hairs transverse section of mammal, and the hair microstruc ture would be accelerated by the discoveries of more detailed information of the hai rs transverse section. Methods :In this experi ment, the hairs of some mammals in Xinjiang (Tari m Red Deer, T ibetan antelope, Wlid two-humped camel and Roe deer) were studied. Based on the research of cleanin g , saturated paraffin, embedding, section and dye of hairs of those mammals, the paper presented the methods of paraffin section on i t. Results :There did existed dramatic di fferences in the microstructure of those mammalian hairs:Tari m Red Deer, the cortex layer were very thin and the medullary layer were in the majority ; Tibetan an telope, the hairs were composed of some polygonal vacuole and were hollow inside; Wlid two-hu mped camel, the cortex layer and the medullary layer had the same proportion; Roe deer , the cortex layer were about two thirds of the transverse section, the medullary layer was about one third. C onclusion :The foundation of the species identification could be buil t by using the microstructure of the mammalian hairs.

Key words :hairs; microsturcture; Paraffin section

毛发是哺乳动物皮肤表皮部角质层的衍生物, 也是哺乳动物的三大特征之一, 所有动物的毛都有其基本的形态和结构, 而不同的动物在毛的形态上(如长短、粗细以及色泽等) 又

[1]

表现出很多的差异。毛的形态差异必定与其微观结构有着紧密的联系, 毛的微观结构主要取决于动物的先天遗传, 具有物种的特异性, 因此毛发微观结构也是人们多年来研究的重点。

动物毛发微观结构一般由毛鳞片层, 毛皮质层和毛髓质层构成(少数除外) 。毛鳞片层很薄, 位于毛发的最外面, 不同动物毛鳞片层的形态和排列各异。毛皮质层是由退化的死细胞致密排列而成, 呈无结构的均质状, 不同的动物皮质层的厚薄不同。毛髓质层是由气腔和气腔壁构成, 不同的动物气腔的大小、气腔壁的厚薄及髓质中大小气腔的比例等方面有所不同, 即毛髓质的形态各异[2]。不同动物毛干的毛皮质层和髓质层所占比例不同。因此毛发微观形态结构及毛发横断面特征是进行物种同一认定和种属鉴定的依据[2,3]。

从1933年开始研究毛发横切结构以来, 已经有70多年的研究历史[2]。由于毛发存在有角原蛋白构成的致密的皮质层, 采用传统切片方法均难以获得较好的结果[4]; 直到20世纪80年代, 随着电子显微技术的广泛应用, 对动物毛发横断面特征研究才有了进一步的完善与发展[5]。虽然电子显微镜分辨率高, 图像立体感强, 可以从不同的角度进行观察拍照。但在

收稿日期:2006-10-27; 修回日期:2007-01-05

基金项目:日本国文部科学省(中日国际合作) 项目(15405007) ; 国家自然基金项目(30660025) 资助

作者简介:张艺(1981-) , 女, 在读硕士, 研究方向:资源动物学, E-mail:yzhang_xju@yahoo. c om. cn; *通讯作者:马合木提 哈力克(1959-) , 男, 博士, 教授, 博士生导师, 研究方向:珍稀濒危动物保护遗传学和分子系统地理学, 发表论文30余篇、论著2部, E -mail:yarkanden sis17@电子显微镜下制备毛发样品较复杂, 需一定技术, 方法不易掌握; 同时利用电子显微镜观察毛发形态结构投资较大, 目前在国内野生动物种类较多, 野生动物保护区聚居的一些边远地区尚无法普及甚至采用该技术。本文试图用改进的石蜡切片技术来找寻一种快速、简便、易行的毛发横断面切片制作方法。目前国内针对动物毛发的石蜡切片技术尚未见系统报道, 本文在此做一报告。

1 材料与方法

1. 1 材料

1. 1. 1 实验材料

取由新疆维吾尔自治区林业局提供的野生动物马鹿塔里木亚种(Cervus ela phus yarkandensis Blan f ord 1892) 、藏羚羊(Pan tholops hodgsoni ) 、野双峰驼(Camelus bactrianus ) 、狍子(Capreolus capreolus ) 的毛发作为实验材料。1. 1. 2 试剂

高效切片石蜡为上海华灵康复器械厂产品, 苏木色精为上海化学试剂厂(Fluka 进口分装) 产品, 伊红为天津市天新精细化工开发中心产品, 其余试剂如乙醚、二甲苯、乙醇、盐酸、氨水等均为国产分析纯试剂。1. 1. 3 仪器

徕卡RM2126型轮转式切片机(上海徕卡仪器有限公司) , MoticAE31倒置数码显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司) 。1. 2 方法

1. 2. 1 毛发样本预处理

将毛发样本用60 左右的温水清洗、凉干后, 置于95%乙醇和乙醚(1! 1) 的混合液中脱脂10min, 取出后用蒸馏水漂洗, 然后再用滤纸吸干毛发或将其自然干燥。1. 2. 2 浸蜡与包埋

将预处理好的毛发样本直接置于58~60 蜡液中浸没, 20min , 更换2, 石蜡法

50 生 物 技 术 第17卷第2期制成石蜡块。1. 2. 3 切片

修正石蜡块, 使用徕卡RM2126型轮转式切片机常规切片, 切取8~10 m 厚的蜡片, 进行对比观察。选取最佳厚度的蜡片, 浸蘸40~50%酒精片刻即放入50 左右温水中展片[6,7], 待蜡带完全展开后用洁净载玻片捞出, 倾去多余水分后置于50 烘箱中烤片至完全干燥。1. 2. 4 染色与封片

实验采用改良的苏木素∀∀∀伊红染色法。将烤好的蜡片经二甲苯#、∃、%脱蜡各15min, 用无水乙醇、95%乙醇逐级复水1min 后, 进苏木素液染色10min, 1%盐酸酒精分化5s, 0. 5%氨水溶液反蓝5s, 再用0. 5%伊红水溶液染色5mi n, 最后经75%、80%、85%、90%、95%乙醇和无水乙醇完全脱水后放入二甲苯#、∃中透明各5min, 用中性树胶封片制成永久装片。

行常规石蜡切片步骤则很难透入蜡液, 必须将毛发进行预处

理, 置入95%乙醇和乙醚(1! 1) 的混合液中脱脂, 使交错重叠的闭合细胞散乱排列, 易于透蜡。

2 结果与分析

采用改良后的石蜡切片技术可获得上述几种野生哺乳动物的毛发横断面切片。(图1~图4) 。从其横断面来看, 各动物毛发除藏羚羊外由外向内均由鳞片层, 皮质层和髓质层构成, 且各动物毛发的毛皮质与毛髓质所占比例也不同。

(1) 马鹿塔里木亚种:横断面呈圆形, 毛皮质极薄, 毛髓质占大多数, 毛髓质为粗细网格交叉排列(图1)

。

图3 野双峰驼毛发石蜡切片(&40)

Fig. 3 Paraffin secti on on hai rs of Camelus bac trianus (&40)

图1 马鹿塔里木亚种毛发石蜡切片(&40)

Fi g. 1 Paraffin s ection on hairs of c ervus elaphus yarkandensis (&40)

图4 狍子毛发石蜡切片(&40)

Fig. 4 Paraffin secti on on hai rs of Capreolus c apreolus (&40)

(2) 藏羚羊:横断面呈多边形, 由若干多边行空囊组成, 内部中空(图2)

。

图2 Pantholops hodgsoni 毛发石蜡切片(&40)

Fi g. 2 Paraffin s ection on hairs of Tibetan antelope (&40)

(3) 野双峰驼:横断面呈圆形, 毛皮质与毛髓质所占比例相当, 毛髓质无网格(图3) 。

(4)狍子:横断面呈近椭圆形, 毛皮质约占2 3, 毛髓质约占1 3, 呈细网状(图4) 。

3 讨论

3. 1 关于毛发样本的前处理

本实验方法省略了毛发的脱水、透明这两大步骤, 这种方法为假包埋石蜡切片法, 徐绥峻在1987年用此方法研究植物组织的形态结构, 但用来研究毛发横切面形态特征还是第一次用到。采用此方法不但节约了大量时间, 还解决了毛发不易透蜡和毛发有空气腔构成的髓质不易透明的难题[2]。这是因为毛发主要是由角蛋白分子组成的角质纤维通过螺旋式的组合相互缠绕而成, 其表面鳞片层由鳞片状或瓦状的扁平角质细胞交错重叠而成, 从毛根排列到毛梢包裹着内部的皮质。

, 制水3. 2 关于毛发样本的浸蜡与包埋

由于毛发的基本成份主要是角质蛋白, 其由氨基酸组成。氨基酸提供了毛发生长所需的营养与成份, 各种氨基酸原纤维通过螺旋式、弹簧式的结构相互缠绕交联, 形成角质蛋白的强度和柔韧, 故而毛发具有一定的刚韧性。针对毛发这种特性, 浸蜡时须使用熔点较高的硬蜡, 一般为58~60 , 且整个浸蜡过程要在恒温箱中进行。恒温箱的温度应高于石蜡熔点2~3 , 这样能使石蜡完全熔化, 均匀地渗透到毛发内部[8]。

浸蜡和包埋要一次完成, 防止操作过程中出现温差。包埋时也须使用熔点在58~60 的硬蜡, 且熔蜡温度不易过高, 以免烫伤组织[9]。用温热的吸管吸热石蜡, 注入纸盒内, 待底面石蜡稍微凝固时, 用温热的镊子夹取处理过的毛发放入到盒的中央位置。两手持纸盒两端, 轻轻移入冷水中, 使纸盒一半浸入冷水中, 闭口吸气, 使表面石蜡凝成一较厚层后, 将纸盒急速浸入冷水中, 待石蜡全部凝结变硬后方可取出(约浸30min 左右) [2]。

目前国内在临床医学上为了缩短石蜡切片的制片时间, 提高时效性, 多采用超声波或微波技术缩短检材组织固定、脱

[11]

水和透明的时间。本研究中对动物毛发检材也尝试使用超声波法, 但效果不显著。主要是因为毛发检材采用假包埋法, 已省略较长的固定、脱水和透明时间, 故超声波法的优越性表现不明显。

3. 3 关于毛发样本的切片与贴片

切片时切片机要放稳不能震动, 用力要均匀, 切片刀要放置好, 倾斜角要大小适宜。一般4~8∋为适当, 此处倾斜角指的是刀锋的下面和水平面所成的角, 如果倾角过大则切片上, [2,10]

第17卷第2期:51生 物 技 术Vol 17, No 2:51

2007年4月BIOTECHNOLOGY Apr 2007由于毛发样本的硬度较高, 高于其它检材, 浸蜡和包埋时又使用58~60 的硬蜡, 以至于切片后蜡带有时易卷不易展开, 因此本文采用改良的贴片, 展片方法[6,12]。贴片时首先将水浴锅预热至45 , 用小镊子轻轻夹起切好的蜡带放入预先配制好的40%~50%的酒精中片刻, 用干净的载玻片从下面轻轻捞起, 这样在蜡带的下方就沾有薄薄一层酒精。之后将蜡带放入45 温水中, 酒精遇45 温水后迅速挥发, 借助酒精挥发的力量, 蜡带及中间的组织材料在温水中迅速展开, 约1~2s 即可完全展开。然后把洁净的载玻片插入水中, 从下方轻轻将蜡带捞起, 倾去载玻片上的水分即可烤片。用这种方法贴片速度快, 展片效果好, 而且一次所展蜡带较长, 可以从中选择最理想的材料, 选择余地大, 且不易脱片对于连续或不连续切片都适宜(表1) 。此外贴片时不用再往载玻片上涂抹蛋白甘油粘贴剂, 利于染色。制出的切片干净整洁, 易观察[13]。

表1 不同贴片法对石蜡切片的影响(单位:张)

Table 1 Effect on paraffin section by treatment of di fferent paster(unit:piece)

组别常规方法改良方法

切片量

150150

5319

35. 3012. 70

96142

展片量63. 3094. 70

清晰清晰

贴片数脱片数脱片率(%) 展片数完整率(%) 染色效果

即可, 否则会影响染色效果。

复染时选用0. 5%伊红水溶液较0. 5%伊红酒精溶液效果好。染好的切片完全脱水后, 还需用二甲苯透明2次; 当载玻片从二甲苯中取出时, 立即封片。应强调切不可待二甲苯挥发后再进行滴树胶封片, 否则制成的切片模糊[18]。

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3. 4 关于毛发样本的染色

将贴好的蜡带立即放置于55 恒温温箱中烘烤, 充分烘烤后采用苏木素∀∀∀伊红切片染色法。染色前必须彻底脱腊, 不然会造成染色不良。同时由于切片经高温烤片析出的蛋白与载玻片之间可形成一定的粘合力, 使组织粘贴牢固不易脱落。因此必要时亦可适当延长烤片时间, 增强组织与载玻片之间的粘附作用[14]。

将烤干的切片染色前先投入二甲苯缸10~15min, 然后由高浓度向低浓度酒精梯度进水, 每级1~2min, 不能急速进水, 防止组织发生弥散性分裂[15]。

染色前, 最好过滤各染液。本文使用的苏木素液为Gill 改良配方[16], 配置1000ml Gill 改良苏木素液需要苏木色素精2g , 无水乙醇250ml, 硫酸铝17. 6g, 蒸馏水750ml, 碘酸钠0. 2g , 冰醋酸20ml 。此染液染色效果好, 且不易氧化可长期保存。染色时间夏季较短, 冬季时间适当的延长。

切片经苏木精染色后洗净, 时间不宜长, 否则染色质变蓝后, 盐酸酒精不易分化。一般用1%盐酸酒精分化5s, 冬季可适当延长时间[17]。0. 5%氨水溶液反蓝时间也不易过长, 数秒

开发与应用

DE VELOP ME NT AND APPLIC ATI ON

家蝇天然抗菌肽的分离纯化与活性分析

张先文, 张伟, 赵小凡, 王金星

1

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2*

(1. 湖南农业大学生物科学技术学院, 湖南长沙410128; 2. 山东大学生命科学学院, 山东济南250100)

摘要:目的:纯化得到有抗菌活性的家蝇天然抗菌肽。方法:以革兰氏阴性菌(大肠杆菌) 和革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌) 的混合菌液, 在未灭活的情况下对家蝇幼虫实施带菌针刺以诱导抗菌肽的大量表达。采用固相萃取(SPE) , 得到三个对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有强烈抑制作用的组分Sp1、Sp3和Sp8。用反相高效液相色谱(RP-HPLC) 对活性最强的Sp1进行了纯化, 液体生长抑制法证明其中的组分%具有最强活性。毛细管电泳(CE) 显示该组分由两种物质组成。结果和结论:家蝇血淋巴中存在大量有抗菌活性的物质。该研究利用SPE 和RP-HPLC 与CE 联用的方法, 得到了有较强抗菌活性和较宽抗菌谱的粗提物, 并获得一个推测由两种阳离子型抗菌肽组成的成分, 为后期研究打下了基础。

关键词:家蝇; 抗菌肽; 固相萃取; 反相高效液相色谱; 液体生长抑制; 毛细管电泳

中图分类号:Q966 文献标识码:A 文章编号:1004-311X(2007)02-0051-04

Purification and Activity Analysis of Antibacterial Peptide from House Fly

ZHANG Xian-wen, Z HANG Wei, ZHAO Xiao-fan, WANG Jin-xing

(1. College of Bi oscience &Technol ogy of Hunan Agricultural Universi ty, Changsha 410128; 2. College of Li fe Science of Shandong Uni versity, Jinan 250100, Chi na)

Abstract :Objective :To get the natural purified antibacterial peptides wi th the activity of antibacterium from house fly (Musca domestica ). Methods :To inject the instars with living bacteria mixture of Gram negative (Escherichia coli ) and Gram positive bacterium (Sta phylococcus au reus ) to