石墨烯及氧化石墨烯在蛋白质检测中的应用

石墨烯及氧化石墨烯在蛋白质检测中的应用

张爱红1，张 姣2,3，林虹君2,3*

1

2

中国人民解放军防化学院，北京 102205;

北京蛋白质组研究中心，蛋白质组学国家重点实验室，北京 102206;

3

军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京 100850

摘要：近年来，随着石墨烯的问世，石墨烯及其氧化物——氧化石墨烯在生命科学领域，尤其是蛋白质检测研究中的应用日趋增多。石墨烯以其大的比表面积、优异的生化性能使其发挥了传统材料不可替代的作用。本文综述了石墨烯及氧化石墨烯在电免疫检测、生物质谱分析以及western blotting分析中的应用，并对其应用前景做一展望。 关键词：石墨烯，氧化石墨烯，蛋白质检测

The application of graphene and graphene oxide in the detection of protein

ZHANG Ai-Hong1, ZHANG Jiao2,3, LIN Hong-Jun2,3

1Institute of Chemical Defense, Beijing 102205, China

2State Key Laboratory of Proteomics, Beijing Proteome Research Center, Beijing 102206, China;

3Beijing Institute of Radiation Medicine, Beijing 100850, China

Abstract: In recent years, with the advent of graphene, the application of graphene and graphene oxide in the field of life sciences, particularly in the study of protein detection is increasing. Graphene, with its large specific surface area, excellent biochemical properties, has played an irreplaceable role of traditional materials. This paper reviews the application of graphene and graphene oxide in electricity immunity detection, biological mass spectrometry and western blotting analysis, and presents its application prospect.

Key words: graphene, graphene oxide, detection of protein

石墨烯(graphene)是单原子厚度的二维碳原子晶体，被认为是富勒烯、碳纳米管和石墨的基本结构单元。早在60年前人们就在理论上对石墨烯进行了研究，然而，直到本世纪初才获得独立的单层石墨。石墨烯因具有大的比表面积、优异的生物化学性能等一系列独特性质，引起了广大科研人员的极大兴趣[1,2]。然而，由于石墨烯表面功能基团较少，不易与生物分子结合，因此，首先将石墨烯氧化生成氧化石墨烯(graphene oxide, GO)，在其表面产生较多的羧基等功能基团，大大提高了其应用范围

[3,4]

1 GO的制备

GO是高结晶度的石墨经强力氧化、水解得到的产物。GO的合成方法主要有Brodie法、Staudenmaier法和Hummers法[5]。这三大化学氧化方法都是用强质子酸处理石墨，形成石墨层间化合物，然后加入强氧化剂对其进行氧化。随着研究的发展，又出现了电化学氧化法[6]，以及对以上三种化学氧化法的改进，从而缩短了氧化时间，提高了制备效率[7-10]。图1为氧化石墨烯的结构模型图。

。

1

2.2 石墨烯与氧化锆结合对含磷基团试剂进行检测

2011年Du研究组[12]又提出，将ZrO2与石墨烯结合形成graphene-ZrO2纳米复合材料(GZr)，并将GZr作为电极，用于对含磷酸基团试剂的检测(图3)。本

图1 GO的结构模型[2]

方法对甲基对磷酸的检测线性范围是0.5~100 ng mL-1, 检测限是0.1 ng mL-1。因此，该方法可用于对有机磷试剂的监测和检测。

2 石墨烯在蛋白质检测中的应用

2.1 石墨烯在质谱检测方法中的应用

石墨烯与抗体结合，扩大单位检测体系中可检测到的信号密度，可对痕量、甚至超痕量生物标志物进行检测。在2010年Dong研究组[11]首次将石墨烯应用于基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)，具体操作如下：首先将石墨烯溶为基质，然后将待测小分子溶在石墨烯基质中，并对其进行检测。由于石墨烯对非极性分子的解析和离子化效率更好，因此可以提高被检测物在检测器中的响应信号。图2是MALDI-TOF MS对小分子的检测结果对比图。 从图中我们可以看出，用石墨烯作为基质时，可以大幅提高目标信号的响应度，而对干扰信号进行了规避。同时，即使目标检测物的浓度低至0.2µM时，仍能检测到明显的信号。

图3 GZr纳米电极及其对甲基对磷酸的检测示意图[12]

该方法用于对含磷酸基团试剂的检测的几个优点：1. GZr对磷酸基有强有力的结合力；2. GZr作为电极拥有快速的电子转移性能和优异的电催化性能；3. 通过电学方法可以控制待测物在GZr上的吸附量等。我们相信该方法能在磷酸肽及蛋白质的检测领域发挥重要作用。

2.3 石墨烯用于电免疫传感器对生物分子进行检测

将石墨烯应用于电免疫传感器在生物检测领域得到了较多的研究[13-16]。2010年Wang等[13]发展了一种利用石墨烯和纳米金对辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记物的固定新方法(图4)。在本策略中，石墨烯首先被固定在玻碳电极上(glassy carbon electrode, GCE)，然后将L半胱氨酸(L-cysteine, L-cys)电沉积在石墨烯上。实验结果表明，石墨烯可以诱导L-cys在其表面有规律的生长，

图2 MALDI-TOF MS检测对比图

(a)胆固醇(m/z 369, [M - H2O + H]+)和鲨烯(m/z 433, [M + Na]+)并用CHCA做基质；(b)胆固醇(m/z 409, [M + Na]+)和鲨烯(m/z 433, [M + Na]+)并用石墨烯为基质；(c)石墨烯对鲨烯的吸附量为20 µM；(d)石墨烯对鲨烯的吸附量为0.2 µM

2

并进一步提高纳米金颗粒的稳定性，最终使得该电极负载更多的生物分子。该方法可以提高免疫传感器的灵敏度和稳定性。本传感器对人IgG的检测范围是0.2~320 ng mL-1，检测限是 70 ng mL-1，而且该结果与传统ELISA方法有较好的吻合。

图4 一抗的固定及免疫检测过程示意图[13]

对生物分子的负载量，进而达到增强检测信号的目的。早在2010年Du等[6]将GO与HRP结合，形成多酶扩增(即一个二抗对应多个HRP)，实现了对p53蛋白质的超灵敏检测(图6)。用GO改进后的方法对磷酸化修饰的p53蛋白质的检测限达到了0.01 nM，比不用GO时低了10倍，该方法的稳定性和重复性都较好，而且对人血浆中的的检测回收率达到92~103.8%。

将石墨烯用于电免疫传感器的还有Su等[14]，该研究组提出一种新的电化学免疫传感器并对人血清中的Alpha Fetoprotein (AFP)进行灵敏检测。该方法操作简便，一步即可完成免疫传感器的自组装。实验结果表明，该方法对AFP的检测动态范围是1.0~10 ng mL-1，检测限是0.7 ng mL-1。更重要的是该方法提供了一个对生物混合物检测的平台，并为其它电化学、生物化学传感器的提出及应用提供了参考。Wang等[17]利用氧化石墨烯处理过的电极，成功对小分子进行低浓度检测，体现了石墨烯优异的电学性能以及其在电化学中的应用优势。Liao等[18]也在此领域做了相关研究。

图6 HRP-p53392Ab2-GO的制备过程[6]

在同一年，该研究组又提出将石墨烯和碳纳米

球用于免疫传感器，实现双重信号放大[8]。该方法将功能化的石墨烯片用于传感器平台，增加其与初级抗体(Ab1)的结合能力，实现了对信号的放大。实验结果表明，改进后的方法对癌症标志物AFP检测信号提高了7倍，检测限可达0.02 ng mL-1，线性校正范围是0.05~6 ng mL-1。因此，该方法为临床筛查癌症生物标志物提供了新的选择。此外，Chen等[19]对石墨烯的制备、功能化修饰以及其在电化学方面的应用等做了很好的综述。 3.2 GO与磁性Fe3O4结合

He等[20]利用两步法完成了GO和表面修饰过

的Fe3O4的结合。具体步骤是：首先，用四乙基正[14]

图5 电化学免疫传感器的制备和检测过程示意图

硅酸盐和(3-氨丙基)三乙氧基硅烷在Fe3O4表面引

入氨基，然后，Fe3O4上的氨基与GO上的羧基反3 GO在蛋白质检测中的应用 应，生成GO-Fe3O4结合物，该结合物对亚甲基蓝

和中性红的阳离子染料的吸附量分别为190.14 mg GO由于具有较多的活化基团，易与生物分子

g-1 和140.79 mg g-1，而且GO-Fe3O4可以用NaBH4结合，然后与蛋白质检测方法连用，可大大提高检

还原得到graphene-Fe3O4。GO-Fe3O4的制备过程见测信号，减低现有方法的检测限(limit of detection,

图7。

LOD)，扩大其应用领域。

3.1 GO与电免疫化学结合对生物分子进行检测

GO由于具有大的比表面积，可作为载体提高

3

图7 GO-Fe3O4的制备过程示意图

[20]

除两步法外，Shen等[21]提出在高温下利用一步法将三乙酰丙酮铁磁性纳米材料附着在氧化石墨烯上，得到GO-Fe3O4复合物(图8)。

将磁性颗粒与GO结合是对后续蛋白质分析的第一步，在完成此步骤的基础上，按照前面的方法对蛋白质进行检测研究，有利于对蛋白质的分离和富集研究，大大缩短了时间，简化了操作步骤。

在制备GO-Fe3O4复合物的基础上，Yang等[22]

研究又对解离性质进行了探讨。在酸性条件下该复合物积聚，而且在外加磁场下有规律的移动。而在碱性条件下该凝聚体能重新分散形成稳定的悬浮液。

图8 GO-Fe3O4的一步合成法示意图[21]

图9 将Fe3O4和盐酸阿霉素（DXR）结合在GO上的流程示意图[22]

实验结果表明，GO-Fe3O4复合物对抗癌药盐酸阿霉素的负载量为1.08 mg mg-1，可通过调节酸碱度来使得GO-Fe3O4的聚集和分散，得到输送目标药的目的，我们相信该方法在生物医学、生物材料学和生物诊断学上将有广阔的应用前景。

3.3 GO用于Western blotting优化并对生物分子进行检测

Lin等[10]将GO应用于western blotting，对二抗进行高密度结合，扩大了二抗与一抗的结合比例，进而放大了检测信号，实现了对低浓度待测物的灵敏检测。具体操作步骤如下：首先将纳米金与一抗结

4

合，由于一个纳米金粒子能结合多个一抗，所以提高了一抗与抗原的比例，实现了信号的一次放大。其次将二抗与氧化石墨烯结合，由于石墨烯大的比表面积，在单位氧化石墨烯片上结合多个二抗，扩大了二抗与一抗的比例，实现了信号的第二次放大。通过信号逐级放大，能将western blotting的检测灵敏度提高32倍，扩大了该方法的适用领域(图10)。

鉴定和药物传递方面都有很好的应用。然而，探测石墨烯在分子内的监控和原位分子探测仍然刚刚开始。在这一方面，Wang等[25]设计了适体羧基荧光/氧化石墨烯纳米片复合物，研究了其在活体细胞内的稳定性。结果表明，获取该复合体以及细胞目标监控是成功的。氧化石墨烯在活体细胞内很好的传送、保护和感知能力表明氧化石墨烯在很多生物领

图10 氧化石墨烯用于Western blotting信号放大示意图

[10]

域，比如DNA和蛋白质分析、基因和药物传导分之内示踪都是一种很好的备选材料。此外Xu等[26]、Lin等[27]、Chang[28]等研究组也在此方面做了一定的研究。

5 石墨烯在掺杂方面的研究

石墨烯掺杂是通过物理或化学方法将其它元素(比如氮元素)添加到石墨烯的空隙中，以改善其形貌和结构，提高其导电、储蓄等性能。Wang等[29]通过化学方法对石墨烯进行氮处理，通过控制曝光时间，所制备的N掺杂石墨烯具有较高的催化活性。氮掺杂石墨还被进一步用于葡萄糖生物传感器，并在有干扰存在的情况下对浓度低至0.01 mM的被检测物进行有效检测。此外，Long等[30]和Reddy等[31]研究组也对N掺杂石墨烯的制备、表征及性能评价做了大量的工作，此方面的研究对我们有很大的借鉴意义。

6 石墨烯的组装体在生物分析方面的研究

近年来，氧化石墨烯基复合材料一直是科学研究的热点。氧化石墨烯表面含有大量的含氧官能团，如：羧基、羟基等，这些功能团使氧化石墨在水中具有很好的分散性，并使得利用层层组装技术(layer-by-layer assembly technique, LbL)制备有机物/氧化石墨烯复合物成为可能。

Yuan等[32]提出一种由氧化石墨烯片和溶菌酶自组装成抗菌复合膜的技术。该复合膜具有多层的有序结构，在相邻层之间填充有蛋白质分子，通过

3.4 GO与量子点结合对生物分子进行检测

Dong等

[23]

于2010年提出了一个新的平台，通过

荧光共振能量转移将生物分子从量子点有效传感到氧化石墨烯，分子信标(molecular beacon)和氧化石墨烯之间的强相互作用力导致量子点的荧光猝灭，一旦目标分子被识别，在量子点和氧化石墨烯之间的距离会扩大，同时被目标识别的分子信标和氧化石墨烯之间的作用力会变得微弱，这就严重的阻碍了荧光共振能量转移。荧光强度的变化为检测目标物提供了一种新的方法，而且，该方法工作量小、灵敏度高以及特异性好。若用适配体替代分子信标，该方法的适用范围将得到扩展，比如通过检测适配体和蛋白质之间的相互作用来测试生物分子等。此外，Wang等

[24]

对在此方面做了相关的研究。

控制该复合物在水中的释放度来控制夹层中蛋白质的量，从基质上剥落的薄层可作为自由且独立的抗菌包裹层，有很广的使用价值。该技术为发展多功能纳米复合材料提供了切实可行的参考。另外，Kotov等[33]、Tang等[34]和Wang等[35]研究组也在自组装方面做了大量研究工作，对于拓展石墨烯的应用

5

图11 GO诱导的分子信标和量子点荧光猝灭和生物传感机制示意图

[23]

4 石墨烯在细胞和成像方面的应用

石墨烯在生物纳米科技，包括DNA传感、蛋白

很有价值。

7 结语

石墨烯以其独特的结构、优异的生化性能及潜在的应用，越来越引起研究人员的广泛关注，现已成为材料、化学、生物等众多领域研究的热点。然而，目前的制备技术存在石墨烯尺寸小且分布不均、难以批量生产以及性能难以精确控制等瓶颈；而且，现有的表征手段耗时、容易破坏石墨烯的晶格结构，也制约着石墨烯的进一步研究。我们相信，通过业内人士的不断努力，设计和批量制备大尺寸、层数和性能可控的石墨烯在不久的将来即可实现。另外，石墨烯与现有生物技术结合，也将在蛋白质检测及分析研究中发挥越来越重要的作用。

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