无菌及微生物限度检查实验室管理

无菌及微生物限度检查实验室管理

一、 实验室设施

开展无菌检查及微生物限度检查工作，首先要按照《药品检验所实验室质量管理规范》及《药品生产质量管理规范》的要求，建立一个布局合理、使用方便、操作安全的无菌室，并且配有完善的实验设施和管理制度。无菌检查、微生物限度检查以及接种室（接种对照菌、菌种传代）均应严格分开，具有危险性的毒株、毒素如破伤风梭菌、黄曲霉毒素的实验室需单独使用，以便控制防止传播。

（一）无菌室

1结构与要求：无菌室不宜设在底层，防潮、防霉、采光好，远离交通干道，厕所及污染区，面积不超过10m2，高度不超过24m，由两个缓冲间、操作间组成。操作间缓冲间之间应有样品传递窗，出入操作间和缓冲间的门不应直对。无菌室内应六面光滑平整，无缝隙，不起灰，不落尘，耐腐蚀，易清洗，墙壁与地面、墙壁与天花板连接处应呈凹弧形，操作间不得安装下水道。

无菌室内的照明灯应嵌装在天花板内，采光面积要大，光照应分布均匀，光照度不低于300勒克斯。缓冲间和操作间应装有紫外线杀菌灯（2－25w/m3）''用于空气消毒。紫外线波长200－300nm者具有杀菌作用，其中以265－266nm杀菌作用最强，这与DNA的吸收光谱范围一致，其杀菌机理可能是在细菌细胞DNA中引起胸腺嘧啶双聚体形成，从而干扰细菌细胞DNA复制，导致细菌变异死亡。紫外线杀菌灯1m以内距离杀菌效果最佳，每次开灯照射时间为30min。应定期检查紫外线灯辐射强度，不得低于70μW·cm-21m距离。其缺点是穿透力弱，一张纸板可以阻碍光的透过，不能穿透固体物，故只能用作表面消毒及一些不耐热或化学消毒剂物品的消毒。

2温度、湿度

无菌室内温度和相对湿度直接影响紫外杀菌灯的杀菌效果，故温度应控制在25±2℃，相对湿度40－60％。操作间或净化工作台的洁净空气应保持对环境形成正压，不低于49Pa。

3操作间

无菌室内应安装空气除菌过滤层流装置及调温装置。洁净度要求：净化工作台洁净度为100级，无菌室应为10000级。

操作间应准备乙醇灯（或煤气灯），火柴，2％碘酊棉球及75％乙醇棉球、试管架、大小橡皮乳头、砂轮、记号笔、无菌剪刀、镊子、注射器等。微生物限度检查无菌室操作间内还应有电子称（感觉为01g，最大称量为300g为宜），电动匀浆仪等。

4．缓冲间

缓冲间内应有洗手盆，消毒液，无菌衣，帽，口罩，拖鞋等，缓冲间内不应放置培养箱和其他杂物。

物流缓冲操作台

人流缓冲无菌室

ⅠⅡ操

缓缓无菌室作

冲冲台

操Ⅱ

作无菌室缓

台冲

Ⅰ缓冲

（二）洁净级别及检查方法

98年国家药监局颁布药品生产质量管理规范，把药品生产洁净区空气洁净度划分为四个级别：

空气洁净度级别表

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尘埃数／立方米活微生物数（个）

洁净级别──────────────────────────────

≥05μm≥5μm浮游菌／立方米沉降菌／皿

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100级≤3500≤0≤5≤1

10000级≤35万≤2000≤100≤3

100000级≤350万≤2万≤500≤10

300000级≤1050万≤6万－≤15

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洁净级别的检查方法通常采用尘埃数及浮游菌数或沉降菌数测定法。

尘埃数的测定：用尘埃粒子计数仪测定，取样高度离地面1米，间距05-2米，每个测试点连续采样3－5次，仪器显示测定结果。

浮游菌数的测定，采用浮游菌测定仪。

沉降菌数测定：方法：无菌室及净化工作台面消毒擦拭后，打开层流净化装置及净化工作台开关30min，将营养琼脂平板3个及玫瑰红钠琼脂平板3个（直径9cm），置净化工作台左、中、右各1个，开盖暴露30min后将盖盖上，分别放在30－35℃培养箱内培养48h及25－28℃培养箱内培养72h，细菌和真菌平均菌落数小于等于1个为100级。实验室一旦被污染，洁净度达不到要求，可以清洗或更换净化工作台过滤器，用甲醛或丙二醇、乳酸熏蒸消毒，方法：在支架上放一个烧杯（内装少许甲醛，8ml／平方米），下面放一个装有少许乙醇的乙醇灯，点燃后，关闭门窗，乙醇用尽后灯自灭，甲醛蒸气充满无菌室，密闭24h。 缺点：甲醛蒸气易锈蚀仪器，对人有刺激，可用氨水喷雾中和，减少对人眼的刺激。

二、实验室管理制度：

为保证实验工作有序进行，实验室必须制定一系列实验室管理制度。

（一） 实验室要求：

1实验室环境应清洁、卫生、安静，实验室内严禁吸烟和饮食。

2实验人员必须穿戴工作衣帽，工作服经常洗涤、消毒、保持清洁。

3操作前后或离开实验室必须用肥皂或消毒液洗手。

4发生菌液污染台面或地面，应立即用3％甲醛或5％碳酸等消毒液由外向内倾覆其上，1小时后再擦拭，

如为破伤风梭菌，则应隔夜后再擦洗。

5工作衣、帽、口罩受到菌液污染时，应立即脱下使污染部位包裹在内部，高压灭菌后再清洗。

6如有传染性培养物污染手部，应先用75％乙醇棉球擦拭，再浸入01新洁尔灭消毒液内泡手，然后再用肥皂及清水彻底洗干净。

7接种环（针），每次使用前后，必须通过火焰灭菌，冷却后方可接种培养物，接种带有蜡质、油质的培养物或菌苔残留多时，不应立即在火焰上灼烧，应先在内焰里将油质培养物烘干后再移至火焰上灭菌，以免活菌外溅污染环境及感染操作者。

8带菌的吸管应浸泡在5％甲酚消毒液内24h后取出清洗，带菌的试管或培养物应在121℃高压灭菌后再取出清洗。

9在接种霉菌、放线菌时应在铺有浸过消毒液的纱布上操作，防止孢子散落传播。

10凡带活菌的物品，必须消毒后才能清洗，严禁污染下水道。

（二） 无菌操作要求：

无菌操作是指在无菌的环境条件下，使用无菌器材，防止微生物污染的操作技术。即保持待检样品在操作时不被污染，又要防止被检的微生物及阳性对照菌在操作中污染环境或感染操作人员。从事无菌及微生物操作的工作人员必须经过无菌技术及基础微生物学专业知识的学习及培训才具备上岗操作的资格，微生物专业检验人员也不应该频繁地变换工作岗位。

1无菌室应每次使用前后用01新洁尔灭消毒液或2％甲醛液擦拭工作台面及可能污染的死角，湿拖地面，打开无菌空气过滤器及超净工作台的开关30分钟，紫外线杀菌灯照射1小时。

2操作人员用肥皂洗手后进入缓冲间换拖鞋，用75％乙醇棉球擦手，穿戴工作衣帽、口罩。将所需物品剥去牛皮纸及外包装，从传递窗移入操作间，再用01新洁尔灭泡手后进入操作间，在乙醇（或煤气灯）火焰区（火焰高度3－5cm）操作。

3供试品表面消毒，如为安瓿先用砂轮划痕后用2％碘酒棉球擦拭，再用75％乙醇棉球擦拭、待干，也可以用消毒液浸泡消毒。

4操作者勿用嘴直接吸吹吸管，防止致病菌感染操作人员及口中的杂菌污染供试品。

5在无菌操作中切勿大幅度或快速动作、拖行，以免搅动空气中尘埃微粒。

6注射器如需回抽时，应对着火焰吸入无菌空气。

7所用的器材如培养基、稀释剂配制后经湿热灭菌121℃20分钟，吸管培养皿等均应洗涤，干燥，包扎后经干热灭菌160℃2小时才能使用。

（三）仪器设备

实验室所用的各种仪器，如培养箱、电热恒温水浴瓶、电热恒温干燥箱等，均应严格按照仪器说明书操作，均应按计量要求定期检测，并做好检测与维修记录，以保证其正常使用。无菌操作净化工作台要定期检测洁净度，应达到百级。净化工作台的高效过滤器应根据使用情况（如使用年限太久，吹出的风太弱，无菌室被污染），可以取下来清洗，必要时以更换处理。高压蒸汽灭菌器除定期检验表压或温度外，使用时要进行灭菌效果检查。

（四）培养基的管理

培养基是人工配制的适合细菌生长繁殖的生物营养物质，培养基的管理在无菌及微生物限度检查工作中起着重要的作用。

1培养基购入后应记录名称、产地、批号，培养基配制记录应包括：名称、配制量、配制者、配制日期。

2干燥培养基的配制应先量入蒸馏水至容器中，再称取培养基干粉放入水中，摇匀，静置15分钟使其溶解，一般不要加热，避免某些营养成分被破坏。

3培养基配制后应立即灭菌，以防长菌使营养成分损耗，高压灭菌时应防止温度过高、时间过长，使营养成分破坏致使实验结果出现假阴性。灭菌时间：稀释剂121℃灭菌20分钟，含糖培养基115℃灭菌20分钟。 4配制好的培养基应保存在凉暗处（2－10℃）或置4℃冰箱内保存，一月左右使用。保存时间需视培养基中水分蒸发程度及有无污染而定，用硅胶塞，封入塑料袋，内可延长保存时间。培养基切勿反复加热使用。 5培养基的质量控制，应选用优质的蛋白胨，牛肉膏等营养成分，化学纯以上的化学试剂，调配成最适的pH值。配制后应按规定做无菌试验，如无菌检查用的培养基，需气菌、厌气菌培养基置30－35℃培养48小时，真菌培养基置20－25℃培养72小时，应无菌生长。除此以外，还需做培养基性能的质量控制，性能试验：即不同的培养基接种不同的已知标准菌株，培养24小时后，观察细菌生长情况，如无菌检查培养基需做培养基灵敏度试验，细菌生长良好，说明培养基性能可靠。

（四）实验菌种的保藏与管理

国内药品微生物检验所用的菌种菌号是CMCCB、CMCCF，B（Bacteria）代表细菌，FFungi代表真菌。由中国药品生物制品检定所提供。

1菌种保藏基本要求

菌种的保藏是微生物学基础工作中的一项重要内容，用人工方法低温、干燥、缺氧、缺营养等方法控制微生物的代谢，使细胞基本上处于休眠状态，繁殖受到抑制仍保持菌种原有的各种生物学特性，以达到保种的目的。菌种保藏的关键是不变异、不污染、不死亡。

菌种保藏分四个阶段：

①挑选特征典型的纯菌菌落，其方法是用接种环挑取少许菌苔，接种至2ml营养肉汤或09氯化钠溶液中制成菌液，再取一环菌液在营养琼脂平板上分区划线，培养后可见单个菌落生长。

②凡能产生孢子或芽胞的微生物都用孢子和芽孢进行保种

孢子和芽胞的代谢作用较弱，但对恶劣环境有很强的抵抗力，能保存微生物的全部生命活性，是某些微生物在不利环境条件下，自我保护而形成的一种特有功能，在适宜的条件下，芽胞可发芽成为繁殖体。如生孢梭菌（64941），在传代前，将菌液管放入80℃水浴中作用30分钟，杀死杂菌繁殖体后用芽孢传代。 ③定期对保藏菌种进行检查、分离、纯化，以防菌种变异及衰退，检查项目：菌落形态、染色、镜检、生化特性及血清学检查。

④选择适宜的培养基及方法

2常用菌种的保藏方法

①普通琼脂斜面：用于常用细菌的传代。在营养琼脂培养基内按05加入琼脂粉配制而成。接种培养后，将菌种管用硅胶塞塞紧，置4℃冰箱保存，每隔2－3个月传种一次。铜绿假单孢菌在冰箱中易发生菌体自溶而死亡，菌种可放25℃培养箱内保存。

②半固体琼脂：用于常用细菌的传代。在营养肉汤培养基内按05加入琼脂粉配制而成。穿刺接种培养后，置4℃冰箱保存，6个月传种一次。如在培养管内加少量无菌液体石蜡隔绝空气，减少水分蒸发，可延长菌种保藏期。

③真菌琼脂斜面：用于真菌的传代。在真菌培养基内按13加入琼脂粉配制而成。划线接种后，20－25℃培养24小时，置4℃冰箱保存，3－6个月传种一次。

④沙氏琼脂斜面：用于真菌的传代。配方：蛋白胨10g，葡萄糖10g，琼脂粉13g，水1000ml，待上述成分

溶化后，摇匀分装，115℃灭菌20分钟，趁热摆成斜面。培养、保存及传代同③。

⑤40％甘油水：用于细菌的传代。配制方法：甘油40ml加水至100ml即成。分装至试管内，每支2ml左右，121℃灭菌20分钟备用。接种细菌后直接放4℃冰箱保存，6－12个月传代一次。

⑥需气菌、厌气菌培养基：用于生孢梭菌的传代。取生孢梭菌CMCCB64941菌液01ml至需气菌、厌气菌培养基15ml内，30－35℃培养18－24h，置4℃冰箱内保存3－6个月传种一次。

⑦疱肉培养基：用于破伤风梭菌的传代。取破伤风梭菌CMCCB64067菌液01ml接种于疱肉培养基内，36℃±1℃厌氧培养3－4天，置4℃冰箱保存，6－12个月传代一次。

⑧液氮超低温保藏法：适用于各类微生物的保藏。液氮温度可达－196℃，此时菌种的新陈代谢活动已停止，但不会死亡。在配制好的菌液内加10％甘油作为保护剂，分装于安瓿中，置液氮罐内可保存10年之久。 ⑨冷冻真空干燥保藏法：本法广泛适用于各类微生物的保藏，包括病毒和噬菌体。将菌液混于有保护作用的介质内，分装于灭菌菌种管内，速冻后抽真空，使菌液很快变为疏松的干燥菌粉，最后在真空状态下密封管口，菌种保存期最长可达20年以上。

3菌种检查与复壮：菌种在传代保藏过程中，易发生衰退、变异、污染、死亡，因此必须定期检查。将菌种接种至液体培养基内使之复活，重新分离，纯化开成单个菌落，再作菌种检定，包括菌落形态、颜色，染色性、镜下观察菌体形态等，必要时可做生化试验及血清学反应。

菌种经人工传代保藏过程中，由于自发突变而引起特性变弱或消失往往为菌种衰退。使衰退的菌种重新恢复原来的优良特性，称为菌种复壮。常用方法有：

①分离纯化：将菌种接种至营养肉汤培养基培养24小时，取菌液在营养琼脂平板上分区划线，培养后挑取典型单个菌落。

②宿主复壮：将退化菌种接种到相应昆虫或动植物宿主体内，传种数代可恢复其原有的特性与毒力。 ③通过极端的逆境处理使那些退化的细菌死亡，选育健壮的传代保种。

4实验菌种的管理

实验用菌（毒）种应放入专用冰箱（带锁），专人保管，菌种应有购入记录，传代记录，使用销毁记录。菌种应定期检查、分离、纯化，以防菌种变异及衰退。

为了保持菌种原有的各种生物学特性保证实验菌种的质量，近年来国外提出了使用菌种不超过五代的要求。虽然目前我国药典对于菌种的传代次数未做要求，我们实验中所用的阳性对照菌可能已经传了无数代，存在着菌种衰退、老化变异、不敏感等隐患，对于使用菌种不超过五代给我们提出了更高的要求。我们可以用以下方式传代：

冻干菌种→营养肉汤→半固体琼脂或甘油水100支冰箱保存

（原代）（一代）（二代）

菌种的保藏条件及传种时间

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菌种名称培养基培养温度培养时间保存温度传种时间

金黄色葡萄球菌营养琼脂斜面培养基35～37℃18-24h4-6℃2－3个月

CMCCB26003

藤黄微球菌营养琼脂斜面培养基27～30℃24h4-6℃2－3个月

CMCCB28001

生孢梭菌需气菌、厌气菌培养基30～35℃18-24h4-6℃6个月

CMCCB64941

白色念珠菌真菌琼脂斜面培养基20～25℃24h4-6℃2-3个月

CMCCF98001

大肠杆菌营养琼脂斜面培养基35～37℃18-24h4-6℃2－3个月

CMCCB44102

沙门菌营养琼脂斜面培养基35～37℃18-24h4-6℃2－3个月

CMCCB50094

铜绿假单胞菌营养琼脂斜面培养基35～37℃18-24h25℃1个月

CMCCB10104

破伤风梭菌疱肉琼脂培养基37℃厌氧培养3－4天4－6℃6-12个月

CMCCB64067

枯草芽胞杆菌营养琼脂斜面培养基35～37℃18-24h4－6℃2－3个月

CMCCB63501

短小芽孢杆菌营养琼脂斜面培养基35～37℃18-24h4－6℃2－3个月

CMCCB63202

啤酒酵母菌真菌琼脂斜面培养基32～35℃24h4－6℃4－6个月

9763 或麦芽计酵母膏琼脂

三、检验记录及检验报告书书写

检验记录是出具检验报告书的依据，是进行科学研究和技术总结的原始资料，为保证药品检验工作的科学性和规范化，检验记录必须做到：记录原始、真实、内容完整、齐全，书写清晰、整洁。

药品检验报告书是对药品质量作出技术鉴定，是具有法律效力的技术文件。药检人员应本着严肃、负责的态度，根据检验记录，认真填写检验卡，要求做到；依据准确，数据无误，结论明确，文字简洁、书写清晰，格式规范，每一张药品检验报告书只针对一个批号。

1 检验记录的基本要求

①原始检验记录应用蓝黑墨水或碳素墨水书写，如用热敏纸打印的数据，为防止日久褪色难以识别，应将主要数据记录于记录纸上。

检验人员在检验前应注意检品标签与检验卡的内容是否相符，逐一查对检品的品名、规格、批号和效期、生产单位或产地以及样品的数量和封装情况。

②检验记录中应写明检验依据

③实验数据：计算和结果判断，均应及时、完整的记录，严禁事后补记或转抄。如发现记录有误，可用短

线划去，并保持原有的字迹可辨，不得擦沫涂改，并应在修改处签名或盖章，以示负责。检验或试验结果，无论成败（包括必要的复试）均应详细记录，保存。对废弃的数据或失败的实验，应及时分析其可能的原因，并在原始记录上注明。

④对无菌检查的要求：应记录培养基的名称和批号，对照用菌液的名称，供试品溶液的配制及预处理方法，供试品溶液的接种量，培养温度，培养期间逐日观察结果。

⑤对微生物限度检查的要求：应记录供试液的制备方法（如预处理方法），再分别记录：a细菌数、霉菌数和酵母菌在各培养基中各稀释级的菌落数、空白对照中有无细菌、霉菌、酵母菌生长。计算结果判断；b控制菌检查结果的记录，供试液与阳性对照菌增菌培养的条件及结果，分离培养时所用的培养基，培养条件和培养结果（菌落形态），纯培养所用的培养基和G染色结果，生化试验的项目，名称及结果，结果判断；必要时应记录疑似菌进一步鉴定的详细条件和结果。

⑥对检测项目的书写要求

无菌检查：在“标准规定”项下写“应符合规定”，在“检验结果”项下写“符合规定”或“不符合规定”。微生物限度检查：在“标准规定”项下写“应符合规定”，在“检验结果”项下写“符合规定”；检验不合格时，在“标准规定”与“检验结果”项下均应写具体，如化学片剂，细菌数“标准规定”为100个/g，“检验结果”200个/g，检验结论：不符合规定。

⑦检验报告书的结论：内容应包括检验依据和检验结论，全检合格，结论写本品按中国药典2000年版微生物限度检查法检验结果符合规定。只要有一项不符合规定，即判为不符合规定，结论写：本品按×××（同上）检验，结果不符合规定。如部分检验品种，合格的写：“本品按×××（同上）检验上述项目结果符合规定”，如有一项不合格时，则写“本品按×××（同上）检验上述项目，结果不符合规定。”