发酵工艺学原理思考题参考答案

发酵工艺学原理思考题参考答案

吴凤池 [1**********]5

第二章

1. 比较固体培养与液体培养的优缺点。

固体培养 优点：（1）酶活力高。（因为菌丝体密度大）（2）生产过程中无菌程度要求不是很严格。（3）对于固体培养，通常用于固体发酵，由于产物浓度大，易于分离，可以有效的降低产品分离成本。

缺点：（1）生产劳动强度较大，占地面积大，不宜自动化生产。（2）周期长。

（3）培养过程中环境条件控制较难。（4）生产过程中，由于无菌程度较低，其菌种菌类不纯。

液体培养 优点：（1）生产效率高，便于自动化管理。（2）生产过程中温度、溶氧、pH 值等参数可以实现全面控制。（3）通常生产液体种子，整个生产周期较短。

缺点：（1）无菌程度要求高，相对生产设备投资较大。（2）对于某些种类的发酵，液体培养因投资大、生产密度大而难以实现。

2. 说明菌种扩大培养的条件。

菌种扩大培养条件因不同的菌种差异是非常大的，通常是与菌种的性质有关的，也与后续的发酵工艺有关。但是，与发酵工艺却有着很大的差别。

1. 培养基：种子培养基因不同的微生物种类差别是很大的，同一种微生物因不同的扩大培养过程（一级、二级）其培养基往往也有较大差异。通常，对于种子用的培养基，摇瓶与种子罐用的培养基也不相同，摇瓶要求培养基用的原材料精细，碳源浓度较低而且是用微生物较易利用的碳源；对于种子罐用培养基，要求使用接近大生产用的原材料，氮源浓度较高，有利于菌体的增殖。

2. 温度 种子扩大培养的温度，从试管到三角瓶到种子罐，其温度也应逐步调整，最后接近大生产的温度，目的在于使菌种逐渐适应。

需要指出的是：

（1）许多微生物其最适生长温度与最适发酵温度往往有差异的，例如：谷氨酸发酵，谷氨酸产生菌的最适合生长温度为：30℃，而产物合成温度为32-34℃

（2）种子扩大培养的温度的选择，应该考虑的是菌体的快速增殖上，一方面可以缩短周期，另一方面有利于抑制其他杂菌的生长。

3. 氧的供给 菌种扩大培养的目的就是提供大量的强壮的菌体，因此在扩培过程要求菌体增殖速度越快越好，增殖期消耗的底物葡萄糖越少越好，从这个意义上讲，扩培过程中应提供足够的氧气，无论是厌氧发酵还是好氧发酵。

足够的溶氧取决于：搅拌转速、通气量、搅拌轴功率等

4.pH 值 菌种扩大培养的pH 值很重要，直接影响到菌体的正常生长，需要注意以下两点：（1）扩培选择的pH 值是菌体的最适生长pH 值，往往与发酵最适pH 值不同。（2）培养基灭菌后，通常其pH 值要下降0.5——1.0个单位

3. 菌种扩大培养的目的和意义是什么？

1. 提供大量而新鲜的、具有较高活力的菌种。（此举目的是：a 、缩短发酵周期，降低能耗、减少染菌的机会（空气过滤设备有效时间是有限的）b 、为了使培养菌在数量上取

得绝对的优势，抑制杂菌的生长。）

2. 让菌种从固试管、液体试管„„，逐步适应

3. 菌种经过扩大培养，可以提高生产的成功率，减少“倒罐现象。

4. 工业生产用菌种的基本要求有什么？

1. 具有稳定的遗传学特性

2. 微生物生长和产物的合成对于基质没有严格的要求

3. 生长条件易于满足（“临界溶氧浓度”pH 值等）

4. 对于细菌，希望具有抗噬菌体的能力。

5. 具有较高的各种酶活力，可以在一定的范围内提高生长速率和反应速度，进而

可以缩短发酵周期，降低生产成本。

6. 对于胞外产品，细胞膜具有良好的渗透性，或者细胞膜的渗透性可以调节，细

胞不易发生菌体自溶。对于胞内产品，要求菌体易分离和收集，菌体易破碎；

对于基因工程菌，通常目的产物存在于包含体 内，对于包含体，要求在细胞破碎时不易破碎，而在目的产物的分离提出时，则易破碎。

第三章

1. 微生物发酵培养基的碳源主要有哪几种？

①淀粉及其水解糖液

②含有淀粉及其水解产物的废弃物：味精废水、粉丝生产废水等

③化工石油产品：醋酸、甲醇、乙醇、甲烷等

2. 微生物发酵培养基的氮源主要有哪几种？

①氨水、尿素（有脲酶微生物），以流加形式使用的(NH4)2SO4、NH4NO3、NH4CL 等 ②豆粕、玉米浆、酵母粉、酵母浸出物、鱼粉、菌体蛋白、 玉米蛋白粉等

3. 淀粉的水解方法主要有什么？试进行优缺点比较？

淀粉的水解方法主要有酸法、酶法以及介于这两者之间的酸酶法、酶酸法。

酸法与双酶法的优缺点比较：

（1）酶促反应条件温和，水解产生的副产物少，对微生物的生长有利。

双酶法淀粉水解首先使用耐高α-淀粉酶进行淀粉的液化，此时水解液中的葡萄糖很少，不具备生成副产物的物质条件。

（2）正因为上述原因，淀粉水解产率较高，通常糖的转化率可以提高10%以上。

（3）可以直接使用粮食进行双酶法水解，因为双酶法水解的条件温和，对于粮食中的蛋白质等其他物质的破坏较少。

（4）双酶法水解使用的淀粉乳浓度较高，可以达到20Be 以上，而采用酸法水解，淀粉乳的浓度通常只有12Be

4. 双酶法淀粉的水解通常使用哪2种酶？其作用特点分别是什么？

α-淀粉酶 ：又称为淀粉液化酶，只作用于淀粉α-1，4葡萄糖苷健，其作用特点是可以快速将长链的淀粉水解成短链糊精，其水解速度随着淀粉链长度的降低而变得越来越慢，换言之，该酶不可能将淀粉完全水解成葡萄糖，因此该酶的淀粉水解产物中以短链

的糊精为主，含有少量的葡萄糖。

淀粉α-1，4；1，6葡萄糖苷酶，又称糖化酶，可以水解淀粉分子的α-1，4；或α-1，6葡萄糖苷健，其作用特点是，淀粉的分子链越短水解速度越快，水解产物为葡萄糖。

5. 培养基工业灭菌的方法主要是采用蒸汽灭菌，其灭菌的原理是什么？ 灭菌过程符合对数残留定律，写出理论灭菌时间的计算公式。

答：所谓灭菌就是杀死一切微生物，包括微生物的营养体和芽孢，在工业生产中，对于培养基、管道、设备的灭菌，通常采用蒸汽加热到一定的温度，并保温一段时间的灭菌方法，称之为湿热灭菌。借助蒸汽释放的热能使微生物细胞内蛋白质、酶、核酸分子内部的化学键特别是氢键受到破坏，引起不可逆的变性，致使微生物死亡的过程。在有水分存在的情况下蛋白质更易受热而凝固变性。湿热灭菌的显著优点是：使用方便，无污染，而且其冷凝水可以直接冷凝在培养基中，也可以通过管道排出。

6. 生物反应器灭菌的操作要点有什么？

将配置好培养基打入生物反应器内进行实消，操作要点如下：

1. 定期检查设备、管道有无渗漏，主要是：冷却管道，夹套。

2. 培养基升温时，打开所有的排气阀门，排掉空气，当培养基的温度升到灭菌温度时，进入保温操作阶段，此时要求与反应器相连的所有管道出于两个状态：进汽或出汽，目的是对管道进行灭菌。

3. 培养基升温时开动搅拌系统，以使培养基内部传热均匀，当温度升温到100℃时，停止搅拌，一方面是为了保护轴承，另一方面，当培养基的温度升温到100℃时，培养基的沸腾，可以起到搅拌作用。

4. 注意辅助设备的灭菌：空气过滤器、计量罐、流加管道与流加液贮罐，空气流量计等。

5. 保温期间，要求罐压：0.09—0.10MPa ，温度：118—121℃，时间：30分钟。

6. 灭菌结束后，需要立即引入无菌空气，保证罐内压力后方可冷却，目的是防止培养基的冷却使罐内形成负压，易染菌。

7. 配制培养基时，应充分考虑培养基在灭菌时的稀释（体积的增加），通常体积可增加20%左右，灭菌时间越长，体积增加的越多。

7．以化学反应动力学为基础，说明高温短时灭菌可以减少培养基营养成分损失的原因。

培养基的灭菌过程实际上是营养成分破坏、菌体死亡的两个平行性反应，

对于平行性反应，反应温度的提高，其两个平行性反应的速度常数都增加，但增加的幅度（大小）却不同，其比值可以表示为：

lg(k2/k1)/lg(k,2/ k,1)= E / E, „„ (5)

实验证明：营养成分为破坏的反应的活化能E 的值为

E, = 8.36—83.6*103 J/mol

而菌体死亡的活化能E

芽孢：E = 418*103 J/mol

E =

E = 209—250*103 J/mol

显然，（5）式的比值 〉1，说明提高温度对于第二个平行反应，即菌体死亡的反应是有利的。提高温度，虽然两个平行性反应的反应速度常数都提高了，但是，达到同样的灭菌效果，所需要的时间却缩短了，由于第一个反应也就是营养成分破坏的反应速度常速增加的少，因此，有利于减少培养基在灭菌过程中营养成分的破坏。换言之，高温短时

灭菌对于培养基营养成分是有利的。

8．掌握以下几个概念：

理论灭菌时间：理论计算中培养基的灭菌过程所用的时间 t = 2.303/k * lnN0/NS 式中——N0，NS ： 分别表示灭菌前、灭菌后培养基中菌体的浓度（个/ml）

对数残留定律：即微生物的热致死规律，在一定温度下，微生物热死遵循分子反应速度理论，在微生物受热失活的过程中，微生物不断被杀死，活菌数不断减少，其减少速度随活菌残量的减少而降低。—dN/dt=K*N

实消：将配置好的培养基输送到生物反应器，在反应器内进行灭菌。优点：不需要特定的设备，操作、管理比较灵活。

空消：在生物反应器内没有物质时对其进行灭菌。意义：由于空消时反应器内的死角少，蒸汽的传热效率高，对于反应器灭菌效果好，通常在较长时间没有使用的反应器、染菌的反应器、更换菌种时都要进行空消。采用培养基连续灭菌的工艺，需要空消。

连消:培养基连续灭菌的工艺，即把发酵罐预先灭菌好，将培养基在发酵罐外采用高效设备连续不断地进行加热，保温灭菌和冷却，然后灭菌进入已灭菌好的发酵罐里。

波美度: 波美度（Be ）是表示液体浓度（比重）的一种方法，其和液体比重之间有下列关系： d = λ/λ- Be 式中d ：液体的比重 λ：模数

第四章

1. 基本概念：

能荷：生物体所具有的能量水平 。能荷 = （[ATP] +1/2[ADP]）/（[ATP] +[ADP] +[AMP]） 显然，能荷在0—1之间。

糖酵解：葡萄糖经过无氧分解成丙酮酸并生成ATP 的过程。其主要过程是：糖原或葡萄糖经磷酸化变成二磷酸果糖，进而分解成磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮，磷酸甘油醛脱氢生成丙酮酸，在糖酵解过程中净生成2分子A TP 。

TCA 循环: 丙酮酸在有氧的条件下，在丙酮酸氧化脱羧酶系（脱氢酶）的作用下，氧化脱羧生成乙酰辅酶A ，CH 3-CO-SCoA ，进入TCA 循环，彻底氧化成CO 2和H 2O 。

反应式如下： C 6H 12O 6 = 6CO2 + 6H2O +38ATP+ 3 NAD(P)H

HMP 途径：6-磷酸葡萄糖在6-磷酸葡萄糖脱氢酶的作用下氧化生成6-磷酸葡萄糖酸，再生成5-磷酸戊糖，通过戊糖代谢分解成三碳化合物和二碳化合物，三碳化合物与EMP 途径联系，二碳化合物进入TCA 循环。是将葡萄糖彻底氧化成CO2和H2O ，并有35分子的ATP 生成的过程 反应式：C 6H 12O 6 = 6CO 2 + 6H2O +35ATP

甘油发酵： 在厌氧或好氧条件下培养酵母，利用糖分生成甘油的过程。

侧系呼吸链：NAD(P)H经过该呼吸链，可正常传递H+，将其氧化为H2O ，但是并没有氧化磷酸化生成ATP ，不能够正常产生A TP 的呼吸链称之为侧系呼吸链。

标准呼吸链：NAD(P)H经过该呼吸链，可正常传递H+，将其氧化为H2O ，但是并没有氧化磷酸化生成ATP ，能够正常产生ATP 的呼吸链称之为标准呼吸链。

二氧化碳固定化反应：二氧化碳在酶的作用下转化为还原性有机化合物的过程

初级代谢：是指微生物合成它们生长所必需的物质的诸如：糖、氨基酸等以及由这些化合物形成的高分子物质如：多糖、蛋白质、核酸等的代谢，称之为初级代谢。那么，这些化合物统称之为：初级代谢产物。

次级代谢：是指微生物在生长后期进行的与他们的生长无明显关系的代谢，这一类的物质统称之为：次级代谢产物。例如：抗生素、激素、某些酶制剂等。

分叉中间体：处于代谢的分叉点上的物质，既可以合成初级代谢产物，又可用来合成次级代谢产物。

发酵逆转：在正常的发酵过程中，微生物群体从完成了生长型到产物积累型的转变后，大量的产物开始生成，底物源源不断地转化成产物，但是当培养基中存在易引起分解代谢阻遏的物质时，菌体可能出现二次生长，微生物群体又回到了生长状态，称为发酵逆转。

反馈抑制：是指最终产物抑制作用，即在合成过程中有生物合成途径的终点产物对该途径的酶的活性调节，所引起的抑制作用。

阻遏：指基因的表达在信使RNA 合成（转录）阶段为特异的调节因子（阻遏物）所抑制。是指使细胞内特定的酶或酶系合成率降低的现象。

优先合成机制：某种特定的产物优先合成

同功酶：催化同一反应，但其活性受不同代谢产物体调节的酶。

协同反馈抑制：就是该酶有多个活性中心，抑制物可以分别和某一个特定的活性中心结合，但是并不影响该酶的活性，只有当该酶的所有的活性中心都被抑制物结合后，其活性才受到抑制。

营养缺陷型：某些菌株发生突变后，失去合成某些对该在菌株生长必不可少的物质的能力，必须从外界环境获得该物质才能生长繁殖，这种突变型菌株称为营养缺陷型。

抗性突变株：是指野生型菌株因发生基因突变，而产生的对某化学药物或致死物理因子的抗性变异类型。

分解代谢阻遏：当培养基中同时存在多种可供利用的底物时，分解利用某些底物的酶往往被最容易利用的底物所阻遏。

代谢控制发酵：是指利用生物的、物理的、化学的方法，人为的改变了微生物的生长代谢途径，使之合成、积累、分泌我们所需要的产品的过程。

R ——调节基因：能产生阻抑物的基因，通过阻抑物与操纵基因的结合与否来控制操纵基因 的关闭和开启。

P---启动子： 有与RNA 聚合酶结合的位点，可识别转录起始点的核苷酸序列。

O---操纵基因：对结构基因起着“开关”的作用的核苷酸序列，可直接控制结构基因的转录。 S---结构基因：直接编码乳糖分解代谢所需酶类的基因

2. 厌氧甘油发酵和好氧甘油发酵的优缺点比较。

甘油厌氧发酵的缺点：

a.菌体死亡率较高，碱性条件；无能量产生；

b.转化率较低，按照上述能量平衡计算，糖与甘油的转化率不可能超过50%，加上酵母增殖需要消耗一部分糖，发酵液中残留一部分糖，实际转化率远低于50%。这一转化率，导致了厌氧发酵生产甘油的成本较高。

好氧发酵：

优点：在适当（或者说有限的好氧）好氧的条件下，酵母细胞进行有限的好氧呼吸，糖酵解产生的丙酮酸可以通过TCA 循环来增加其产能水平，一方面减少3—磷酸甘油醛向乙醛方向进行，增加底物向产物转化的比例；另一方面，增加了细胞能量水平，减少了细胞的死亡率，有利于提高发酵的速率，缩短发酵周期。 缺点：这种有限的好氧发酵，使得丙酮酸进行TCA 循环的同时，也增加了TCA 循环过程中的许多中间性产物的产生，这对于甘油的提取带来了不利的影响

3. 柠檬酸发酵过程中有哪几个控制要点，如何控制？

C 6H 12O 6

（1）点：EMP 畅通无阻①控制Mn + NH 4+浓度，解除柠檬酸

读对PFK 的抑制 ②控制溶氧，防止侧系呼吸链失活

丙酮酸 + 丙酮酸 （2）点：通过CO 2固定反应生成C 4二羧酸，强化这

一反应的方法：添加辅酶生物素

乙酰辅酶A + C4二羧酸

（3）柠檬酸后述的酶的酶活性丧失或很低，控制培养基中的Fe 2+

的浓度

柠檬酸

4. 说明柠檬酸发酵过程中氧的重要性。

在柠檬酸产生菌体内存在一条侧系呼吸链，该侧系呼吸链中的酶系强烈需氧，如果在柠檬酸的发酵过程中，发酵液的溶氧浓度在很低的水平维持一段时间，或者在这期间中断供氧一段时间（20分钟，根据处理情况如：紧急保压等）则这一侧系呼吸链不可逆的失活，其结果是菌体不再产酸，而是产生了大量的菌体，因为，标准呼吸链的存在使得菌体在代谢过程中产生了大量的ATP ，用于菌体自身的生长上，这种现象，在生产上通常称之为：只长菌不产酸 ，大量的葡萄糖被消耗了，却没有生产出柠檬酸，是一种失败

5. 简述二氧化碳固定反映对于提高柠檬酸产率的意义。

葡萄糖经过EMP 途经生成丙酮酸后，丙酮酸在丙酮酸脱羧酶的作用下生成了乙酰辅酶A(CH3CO-CoA)，则合成一分子柠檬酸需要3分子的CH3CO-CoA ，也就是需要1.5分子的葡萄糖；试想，如果其中一分子的丙酮酸通过CO2固定反应生成一分子的C4二羧酸，那么合成一分子的柠檬酸需要1分子的葡萄糖，产率可以大大的提高。

6. 比较细菌发酵和酵母发酵的优缺点。

优点：（1）菌体体积较小，相对增殖所用的底物较少，产率高。

（2）细菌的繁殖速度快，在合适的生长条件下，其繁殖速度只有几分钟，而酵母的增殖速度最少在一个小时以上，这就为细菌发酵缩短发酵周期创造了条件。

（3）细菌的细胞膜的通透性易于调节，对于胞外产品，可以通过其细胞膜的通透性控制来促进产物的分泌，例如，GA 的发酵；对于胞内产物，其细胞壁比酵母的细胞壁易于破碎。

缺点：（1）细菌菌体较小，当需要从发酵液中把菌体分离出来（有利于产物的结晶提出，或产物就是菌体或菌体内的胞内物），细菌比酵母菌难以分离。（2）细菌发酵过程中的无菌程度要求非常严格，发酵过程中大部分的细菌对于溶氧的要求也很高，这就增加了细菌发酵的生产成本。（3）细菌发酵易感染噬菌体。 细菌赖氨酸发酵使用的菌种通常有两种类型，

7. 写出大肠杆菌中Lys 代谢途径，说明利用大肠杆菌发酵生产Lys

的菌种特性和控制要点。

Glucose 草酰乙酸 Asp

(天冬氨酸激酶AK ，同功酶)

天冬氨酸磷酸（asp-p ）

β-半醛

（同功酶）

Lys

Thr Met

大肠杆菌赖氨酸代谢特点：关键酶是天冬氨酸激酶是一个同功酶，分别受三个代谢产物的抑制，这三个终产物分别是：Lys 、Met 和Thr ，只有当这三个代谢产物同时过量时，Asp 激酶的活性才能完全被抑制。

控制要点：要使菌体合成并积累Lys ，可以选育Hos -，这样的话，既可以解除β—天冬氨酸的代谢支路，使代谢流向Lys 的方向进行，提高了从底物葡萄糖到产物的转化率；更重要的是由于Hos -，使得代谢过程中不可能产生过量的Met 、Thr ，尽管产生了大量的Lys ，Lys 可以抑制关键酶——天冬氨酸激酶1，但是天冬氨酸激酶2、3的活性由于Met 、Thr 的限量，并没有受到抑制，也就是说，天冬氨酸β—半醛，仍可以大量的生成，这就保证了Lys 的生物合成途径的畅通无阻。

8. 写出黄色短杆菌中Lys 代谢途径，说明利用黄色短杆菌发酵生产Lys 的菌种特性和控制要点。 O-磷酸高丝氨酸 高丝氨酸（Hos ）

Glucose 草酰乙酸

Asp

AK) 天冬氨酸磷酸（asp-p ）

β-半醛

高 氨 酸

O-

Lys

O-琥珀酰高丝氨酸

Thr

特点：（1）天冬氨酸激酶（AK ），在黄色短杆菌中是一个变构酶，并有两个活性中心，分别受Lys 、Thr 的协同反馈抑制。

（2）黄色短杆菌中，存在两个分支点的优先合成机制，如图所示（ ），即优先合成Hos ，然后再优先合成Met ，当Met 过量时，阻遏：催化Hos 琥珀酰高丝氨酸所需要的酶的合成（即，琥珀酰高丝氨酸合成酶），使代谢流向合成Thr 的方向进行，当Thr 过量时，反馈抑制：Asp-β-半醛 Hos所需要的酶的的活性（即高丝氨酸脱氢酶），使代谢流向Lys 的合成上。

控制要点：根据以上代谢特点，利用黄色短杆菌生产Lys ，需要选用Hos-，尽管，从理论上讲，选育Hos- 进行赖氨酸发酵，如果在其培养基中限量供给Thr ，则AK 酶的活性不会受到Lys 的反馈抑制，实际上Lys 对AK 酶的活性存在一定的抑制作用。因此，对于黄色短杆菌的Lys 发酵，仅仅选育Hos- 是不够的但是为了高效率的转化Lys ，可以选育结构类似物抗性突变株：

(1)S-L-半胱氨酸抗性突变株 AECr (2)γ-甲基赖氨酸抗性突变株 MLr （3）L-赖氨酸氧

肟酸盐抗性突变株 LysHxr（4）苏氨酸氧肟酸盐抗性突变株 ThrHxr

使用黄色短杆菌进行赖氨酸的发酵，还可以选育具有双重标记的营养缺陷型突变株（Met- + Thr-）, 其本质上和Hos- 是一样的，但双重标记的营养缺陷型突变株的优点是：遗传性质稳定，恢复突变的几率少。

9. 简述磷酸盐在抗生素发酵过程中的调节作用。

磷酸盐对抗生素发酵的影响具有双重性，主要表现在：

（1）高浓度的磷酸盐对抗生素的生物合成具有抑制和阻遏作用

①抑制或阻遏抗生素合成途经中的某些关键酶。已有许多研究证明：当磷酸盐的浓度≧10mmol/L时，菌体内与抗生素合成有关的酶的活性将受到抑制。

②高浓度的磷酸盐可以改变菌体的代谢途径。

高浓度的磷酸盐改变MEP ，HMP ，不利于HMP 的进行，当然也不利于以HMP 途经中的中间产为前提的次级代谢产物的生物合成。

（2）磷酸盐浓度低时，菌体生长速度缓慢，生长量（菌体浓度）也不够，不利于抗生素的生物合成。

10. 说明微生物细胞内NH +

4参与分解与合成代谢的途径。

在抗生物的发酵过程中，培养基中如果存在容易被利用的无机氨态氮，例如：（NH 4）2SO 4、NH 4CL 等，或其他可以被迅速利用的氮源，则对抗生素的合成有强烈的抑制作用。

4+NH 可以强烈的刺激菌体的生长，进而影响了菌体从生长型到产物积累性的转变，影响了抗生素的生物合成。发酵中期当微生物群体进入产物合成期时，如果向发酵液中流加氮源，则可以造成 发酵逆转 ，使微生物群体返回到生长期而停止产物的合成

11. 写出谷氨酸发酵的最理想途径，说明CO 2固定化反应的重要性。

Glucose EMP 丙酮酸 + 丙酮酸

CO 2

CO 2

草酰乙酸

（草酰乙酸

羧化酶）

乙酰辅酶A 4二羧酸

苹果酸

（苹果酸激酶）

柠檬酸（DCA 循环封闭）

谷氨酸

体系不存在CO2固定反应：

3/2 C6H12O6 + NH4+ == C5H9O4 + 4 CO2 产率：147 /（180*3/2） == 54.4% 体系存在CO2固定反应：

C6H12O6 + NH4+ == C5H9O4 + CO2 产率：147 / 180 == 81.7%

可见，在GA 的生物合成过程中，CO2固定反应对于产率的提高有着多么重要的作用。

12. 谷氨酸产生菌之所以能够合成、积累并分泌大量的GA ，其菌种内在的原因有哪些？

1. α—KGA 脱氢酶酶活性微弱或丧失 这是菌体生成并积累α—KGA 的关键，从上图可以看出，α—KGA 是菌体进行TCA 循环的中间性产物，很快在α—KGA 脱氢酶的作用下氧化脱羧生成琥珀酸辅酶A ，在正常的微生物体内他的浓度很低，也就是说，由α—KGA 进行还原氨基化生成GA 的可能性很少。只有当体内α—KGA 脱氢酶活性很低时，TCA 循环才能够停止，α—KGA 才得以积累。

2.GA 产生菌体内的NADPH 的在氧化能力欠缺或丧失（1）如上图所示，NADPH 是α—KGA 还原氨基化生成GA 必须物质，而且该还原氨基化所需要的NADPH 是与柠檬酸氧化脱羧相偶联 的。（2）由于NADPH 的在氧化能力欠缺或丧失，使得体内的NADPH 有一定的积累，NADPH 对于抑制α—KGA 的脱羧氧化有一定的意义。

3. 产生菌体内必须有乙醛酸循环（DCA ）的关键酶——异柠檬酸裂解酶。该酶是一种调节酶，或称为别构酶，其活性可以通过某种方式进行调节，通过该酶酶活性的调节来实现DCA 循环的封闭，DCA 循环的封闭是实现GA 发酵的首要条件。

4+4. 菌体有强烈的L —谷氨酸脱氢酶活性α—KGA + NH +NADPH == GA + NADP L—谷氨酸

脱氢酶，实质上GA 产生菌体内该酶的酶活性都很强，该反应的关键是与异柠檬酸脱羧氧化相偶联

13. 谷氨酸产生菌之所以能够在10%以上的葡萄糖培养基上，生产大量的GA, 除了上述谷氨酸产生菌的内在本质外，其需要的外在条件有什么？

1. 供氧浓度 过量：NADPH 的再氧化能力会加强，使α—KGA 的还原氨基化受到影响，不利于GA 的生成。 供氧不足：积累大量的乳酸，使发酵液的pH 值下降，不利于GA 的产生，同时，一部分葡萄糖转成了乳酸，影响了糖酸转化率，降低了产物的提出率。

4+2. NH浓度（1）影响到发酵液的pH 值（2）与产物的形成有关：过低，不利于α—KGA 的还原氨基化 过高，产生固安酰胺 NH4+的供给方式：（1）液氨 （2）流加尿素

3. 磷酸盐过量：（1）促进EMP 途径，打破EMP 与TCA 之间的平衡，积累丙酮酸，产生乳酸等

（2）产生并积累Val 。Val ①可以抑制葡萄糖丙酮酸，使GA 的生物合成受到阻止②消耗了丙酮酸，降低了糖酸转化率③发酵液中的Val 存在，严重的影响GA 的结晶、提出。

14. 谷氨酸发酵过程中，生物素（V H ）作用表现在那几个方面？

1. 生物素对糖代谢的影响

①生物素对于糖酵解有促进作用，对丙酮酸的有氧氧化——乙酰辅酶A 的生成 也有促进作用，但两者的促进作用不一样，对前者大一些，这样培养基中如果有较丰富的VH ，就会打破糖酵解与丙酮酸氧化之间的平衡，导致丙酮酸的积累，丙酮酸积累则可能导致乳酸的形成，乳酸声称，则使得碳源利用率降低，而且带来的是发酵液的pH 值下降。

②可以通过控制生物素的浓度，以实现对于乙醛酸循环的封闭。

2. 生物素对氮代谢的影响

当VH 缺乏时，异柠檬酸裂解酶的活性减弱，那么相反，当VH 丰富时，异柠檬酸裂解酶的活性必然加强，则DCA 循环正常进行，DCA 循环的进行，一方面提供了大量的“中间性产物”，另一方面，菌体的能和水平得到提高。前者是菌体增殖的物质基础，后者则是菌体增殖的能量的保证。这样的结果是，有利于菌体的增殖和生长，则GA 的生物合成就会受到影响，甚至停止，这在生产上，就是通常我们说的“只长菌，不产酸”的现象。

以上分析说明，GA 发酵过程中，前期，菌体的增殖期，一定的量的生物素是菌体增殖所必需的；而在产物合成期，则要限制生物素的浓度，以保证产物的正常合成。

3. 生物素对菌体细胞膜通透性的影响

细胞膜通透性的调节对于GA 发酵时非常重要的，正如前述，当菌体进入产物合成期时，开始有GA 的产生，这是如果能够大量的把产物及时的排泄到细胞膜外，可以解除GA 对L —谷氨酸脱氢酶活性的抑制作用，从而使现由Glucose 到GA 的高效率转化

生物素对细胞膜合成的影响主要是通过对细胞膜的主要成分——磷脂中的脂肪酸的生物合成来实现的，当限制了菌体脂肪酸的合成时，细胞就会形成一个细胞膜不完整的菌体。其中，将乙酰辅酶A 羧化生成丙二酰辅酶A 的酶是乙酰辅酶A 羧化酶，该酶的辅酶是VH ，VH 在此反应过程中起到传递CO 2的作用。当培养基中VH 的浓度较低时，细胞膜的合成就会受影响。

15. 生物素（V H ）如何封闭乙醛酸循环的？

DCA 循环的关键酶是异柠檬酸裂解酶，研究表明，该酶受以下几个因素的影响：① 为醋酸诱导②受琥珀酸的阻遏，其活性受琥珀酸的抑制

这样，当VH 缺乏时：（1）丙酮酸的有氧氧化就会减弱(由于VH 对TCA 循环的促进作用) ，则：乙酰辅酶A 的生成量就会少，醋酸浓度降低，它的诱导作用降低；

（2）VH 对TCA 循环的促进作用的降低，使得其中间产物琥珀酸的氧化速度降低，其浓度得到积累，这样它的阻遏和抑制作用加强；两者综合的作用使得，异柠檬酸裂解酶的活性丧失，DCA 循环得到封闭。

16. 微生物群体当实现从生长型到产物积累性的转变后，从外观上通常会有哪些变化？这些变化的本质是由什么引起的？

庆大霉素的发酵（放线菌）在菌体的增殖期，菌丝体细长，而进入庆大霉素的合成期，菌丝体变得粗短；地衣芽孢杆菌由原来生长期的粗短型转变成细长。这与同样是细菌发酵的谷氨酸发酵不同，后者当菌体从生长型转变成产物积累型后，其形态由细长变为粗短。

外观：菌体停止生长但形态发生变化，变大OD 值变大。

本质：某些营养成分成为限制性因子

17. 从能荷的角度解释柠檬酸发酵过程中，“只长菌，不产酸”的原因。

菌体要大量合成柠檬酸，从葡萄糖经过EMP 到柠檬酸整个代谢途径需要畅通，在这个过程中，有一步反应：丙酮酸氧化脱羧，每分子丙酮酸可产生一分子的NADH ，在有氧的条件下，每分子的NADH 经过呼吸链彻底氧化成H2O ，并氧化磷酸化产生3分子的ATP ，造成了微生物体内能荷的增加，能荷增加则抑制PFK 等关键酶的酶活性，使得从葡萄糖到柠檬酸的代谢停止。如果NADH （还原型）不能够快速的被氧化转变成NAD （氧化型），则整个反应就会因为缺乏作为推动力的氧化型的NAD 而停止，仍然不能够合成柠檬酸。而实际上，柠檬酸产生菌可以在有氧的条件下大量生成柠檬酸，即NADH 即被氧化了，又没有产生ATP 。该菌体内存在一条侧系呼吸链，NAD(P)H经过该呼吸链，可以正常的传递H+，将其氧化为H2O ，但是并没有氧化磷酸化生成ATP ，该侧系呼吸链中的酶系强烈需氧，如果在柠檬酸的发酵过程中，发酵液的溶氧浓度在很低的水平维持一段时间，或者在这期间中断供氧一段时间（20分钟，根据处理情况如：紧急保压等）则这一侧系呼吸链不可逆的失活，其结果是菌体不再产酸，而是产生了大量的菌体，因为，标准呼吸链的存在使得菌体在代谢过程中产生了大量的ATP ，用于菌体自身的生长上，这种现象，在生产上通常称之为：只长菌不产酸 。

第五章

1. 基本概念

发酵热：发酵过程中，由于菌体对培养基利用而发生的生物反应及搅拌时产生的摩擦等等，都会产生一定的热量。同时罐壁的散热、水分的蒸发等也带走了一部分热量，发酵过程中释放出来的净热量称为发酵热Q 发酵热 = Q生物热 + Q搅拌热 + Q蒸发热 + Q辐谢热 生物热：微生物在生长过程中，由于培养基中的营养性物质：糖、蛋白质、脂肪等被氧化，同时产生大量的热量，这些热量一部分用于合成高能物质（ATP\GTP）等，这些高能物质用于菌体自身的生长、繁殖上；剩余的另一部分，则以热的形式散发出来，其表现在外观上，就是使培养基的温度升高，这一部分热量称之为生物热

发酵动力学类型：发酵过程中菌体生长与碳源消耗及产物合成之间不同的动力学关系，分为生长偶联型、部分生长偶联型和非生长偶联型发酵

生长相关型发酵：产物生成速率与细胞生长速率有紧密联系，合成的产物通常是分解代谢的直接产物

混合生长相关型发酵：生长与产物生成相关(如乳酸、柠檬酸、谷氨酸等的发酵) 。 非生长相关型发酵：在生长和产物无关联的发酵模式中，细胞生长时，无产物，但细胞停止生长后，则有大量产物积累，产物的形成速率只与细胞积累量有关。

微生物的比生长速率：以单位细胞浓度为基准的细胞生长速率。μ=r/c r：细胞生长绝对速率 c：细胞浓度

搅拌轴功率：搅拌器输入搅拌流体的功率，即用以克服流体阻力所需用的功率。 氧传递动力学方程：dc/dt = kLa×(c* - c) 也可以写成以（P*-P）为推动力的氧传递方程式：dc/dt = kLa×（P*-P）

式中：dc/dt——溶氧速率，mol/m3.h kLa ——体积溶氧系数，1/h c*——与气相中氧的分压呈平衡的液相中的氧的浓度，也就是一定体系下的液相中的最大的溶氧浓度，mol/ m3 c ——液相中氧的实际浓度，mol/ m3

氧传递的双膜理论：○1溶氧过程存在一个界面，这个界面的厚度可以忽略不计。在这个界面上，气相中氧的分压与溶于液相中氧的浓度呈平衡关系，既Pi 与Ci 呈平衡关系，符合亨利定律：Ci= K *Pi ②传质过程是一个稳定的过程，各点氧的浓度不是时间的函数。 ○3气膜、液膜都以层流状态存在。

泡沫：定义：泡沫是指气体分散在少量液体中的一种体系。在这个体系中，分散相是气体 连续相是液体。

化学消泡：向发酵液中流加一定量的消泡剂，利用消泡剂的特殊性质消除掉泡沫的方法 机械消泡：一种物理消泡方法，靠机械强烈震动，压力的变化促使气泡破裂或借机械力将排出气体中的液体加以分离回收。

2. 计算酵母菌在厌氧条件下代谢葡萄糖的发酵热？计算在好氧条件下的发酵热？两者比较说明什么？

（1）酵母菌在有氧条件下生长的生物热

在有氧的的条件下Glucose 经过MEP 途经生成丙酮酸，丙酮酸进TCA 循环被氧化成CO2和H2O ，并有38分子的ATP 生成，总反应式如下： C6H12O6 + 38ADP + 38Pi = 38ATP + 6H2O + 6CO2 + Q生物热

-10×38×4.18KJ/mol

这一部分的能量用于菌体生长代谢，即△G= -10×38×4.18KJ/mol

根据化学反应的基本原理，对于一个化学反应，可以看成是一个平衡过程，则有下式： O 生物热 = O可逆 = T•△S = △H - △G = -674-(-380) = - 294kcol/mol

式中：△H 为反应的焓差，可以计算如下：

△H = △HG,C298 - △HCO2,C298 - △HH2O,C298

△HG,C298—葡萄糖的标准燃烧热，-674×4.18KJ/mol

△HCO2,C298，△HH2O,C298 分别表示CO2和H2O 的标准燃烧热0.

△G 为反应的焓差，即自由能，其值为 -10×38×4.18KJ/mol

则：

O 生物热 = -294kcol/mol = - 294×4.18KJ/mol

这就意味着，酵母菌在有氧的条件下，每氧化1mol 的葡萄糖则可以产生：

- 294×4.18KJ/mol，用于使发酵液的温度升高。

（2）酵母菌在无氧的条件下

Glucose经过MEP 途径生成2分子的丙酮酸，在无氧的条件下完全氧化生成乙醇、CO2。 生物热

-10×2×同样，有下列方程：

Q 生物热 = Q可逆 = T•△S = △H-△G

=-674 - 2(-315 ) = - 20kcol/mol

式中：△H 为反应的焓差，可以计算如下：

△H = △HG,C298 - △HCO2,C298 - △HH2O,C298 - △H C2H5OH,C298

△HG,C298—葡萄糖的标准燃烧热，-674×4.18KJ/mol

△H C2H5OH,C298—乙醇的标准然热，-315×4.18KJ/mol

△HCO2,C298，△HH2O,C298 分别表示CO2和H2O 的标准燃烧热，0

△G 为反应的焓差，即自由能，其值为 -10×2×4.18KJ/mol

则：

O 生物热 = -20kcol/mol = - 20×4.18KJ/mol

这就意味着，酵母菌在无氧的条件下，每氧化1mol 的葡萄糖则可以产生：

- 20×4.18KJ/mol，用于使发酵液的温度升高。

以上计算表明：有氧代谢和无氧代谢，其生物热差别是很大的。这一计算结果本质上是由于在不同的代谢条件下，形成的代谢产物是不同的，其产能水平也是不同的，因此生物热也不相同。

3.pH 值对微生物生长的影响主要表现在那几个方面？

1. pH值影响到了酶的活性，不同的酶有其最适合的pH 值，当菌体中的酶系处于不适合的pH 值环境时，必然影响到其代谢活动。

2.pH 值影响了菌体细胞膜的带电状态，从而影响了细胞膜的渗透性，必然就会影响营养物质的吸收与代谢产物的排泄。

3.pH 值影响Medium 中的营养成份和中间性代谢产物的电离状态，从而影响了M 对这些物质的正常利用。

4.pH 值不同，其菌体代谢途径也会发生变化，代谢产物也不同。

5.pH 对细胞形态的影响这实际上是pH 值对细胞生长和代谢途径影响的外部（宏观）表现

5. 说明发酵过程中泡沫的消长规律？

通常，在发酵初期，由于培养基中的大量的发泡物质的存在，使得泡沫较多，但这时的泡沫大，易破碎；随着菌体的大量的增殖，以及大量的发泡物质被消耗，发酵过程中有一段时间泡沫很少；当菌体进入对数生长期后，由于菌体呼吸强度的增加，泡沫越来越多；当菌体进入产物合成期后，发酵液的泡沫仍然继续增加，这主要是由于菌体合成的产物增加了发酵液的粘度；发酵后期，由于大量的菌体的死亡以及死亡菌体细胞的菌体自溶，使得发酵液中的大分子蛋白质浓度增加，泡沫更为严重。

6. 影响泡沫稳定的因素有哪些？

1. 与通风量、搅拌转速有关 通风量越大，泡沫越多；搅拌转速越大，泡沫越多。

2. 培养基的成分 发泡物质：玉米浆、蛋白胨、花生粉、豆粕粉、黄豆粉、酵母粉、糖蜜等 泡沫的稳定物质：glucose, 起泡性较差，但是它可以增加发酵液的粘度，稳定泡沫的存在。

3. 与灭菌的操作有关 灭菌过程中，灭菌的强度越大，其发酵液中的泡沫越多

4. 泡沫与菌体的生长代谢有关

7. 选择化学消泡剂的原则是什么？化学消泡主要有什么缺点？

（0）对发酵过程中的微生物的生长和代谢无副作用，对人、动物无毒性。（产品人用，母液用于饲料的生产）（1）能够迅速的消泡，对泡沫的控制持久性好。（2）高温灭菌不变性，在高温灭菌的温度下，对设备无腐蚀，也不产生腐蚀性的物质。发酵过程中流加的消泡剂需要先灭菌后流加, 培养基中先要加一部分。（3）对产品的后述操作不产生不利的影响。（4）不干扰发酵过程中的分析系统的正常工作，DO 、PH 等（5）对氧的传递不产生不利的影响。

（6）来源丰富，价格低廉。（7）分散性还好，有利于泡沫的控制。

1. 天然油脂类主要有：玉米油、豆油、棉籽油、花生油等

优点：价格便宜，来源较广泛，在中间加入后可以作为微生物的C 原使用。

缺点：不能一次性的加入的过多，否则，各种油脂会被脂肪酸酶分解成各种脂肪酸，造成发酵液的PH 值的下降。油脂易氧化，氧化了的油脂对微生物的生长和代谢可能带来抑制作用。

2. 聚醚类：生产上应用较多的是：聚氧乙烯氧丙烯甘油，又称为泡敌（GPE ），其使用量在0.3-0.35%，消泡能力为天然油脂的10倍以上。聚氧丙烯（GP) 也是一种消泡剂，其与环氧乙烷加成则生成聚氧乙烯氧丙烯（GPE ）泡敌，前者，具有良好的抑跑能力，后者，具有良好的消泡能力。在实际生产中，可以考虑两者共同使用。

3. 硅酮类：聚甲基硅氧烷及其衍生物。为无色液体，不溶于水，试验表明，适合于微碱性的细菌、放线菌的发酵，对于发酵液的pH 值为5左右的霉菌类的发酵，其消泡能力很差。

8. 高粘性物系发酵过程中，搅拌产生的影响有哪些？

a 对传热的影响 高粘度的物系发酵的发酵和其他发酵一样，发酵过程中有大量的热量产生，由于物料的高粘性使得热量的传递非常困难。

b 搅拌对气液混合的影响 不同的搅拌速率对于气液混合也会带来比较显著的影响。以黄源胶发酵为例，搅拌转速对黄原胶的发酵有着重要的影响，而且这种影响随着发酵液中黄原胶浓度的增加将变得更为严重。

9. 以谷氨酸发酵过程中pH 值的变化规律为例，说明为什么pH 值的变化是反应过程中菌体生长和产物合成的综合性指标？（书上没有，自己想）