醛氧化酶的研究进展

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醛氧化酶的研究进展

米家琦, 李 燕*

(中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所药物代谢室, 天然药物活性物质与功能国家重点实验室,

活性物质发现与适药化研究北京市重点实验室, 北京 100050)

摘要: 醛氧化酶 (aldehyde oxidase, AOX) 是一类高度保守的钼−黄素蛋白, 主要存在于哺乳动物细胞质中, 具有广泛的底物特异性, 可催化醛类及含氮、含氧杂环类化合物的氧化反应。该酶体内分布较广, 存在种属及个体间差异, 在药物及外源物的I 相代谢中发挥重要作用。本文将简要介绍AOX 的生物学特性及在药物代谢中的作用。

关键词: 醛氧化酶; 药物代谢; 钼−黄素蛋白

中图分类号: R963 文献标识码: A 文章编号: 0513-4870 (2014) 05-0582-08

Advances in the study of aldehyde oxidases

MI Jia-qi, LI Yan*

(Department of Drug Metabolism, Key Laboratory of Active Substances Discovery and Drug Ability Evaluation, State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines, Institute of Materia Medica,

Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China)

Abstract : Aldehyde oxidase (AOX), a highly conserved molybdoflavoenzyme in mammal cytoplasm, has broad substrate specificity and ability to catalyze the oxidation of aldehydes and nitrogen, oxygen-containing heterocyclic rings. AOX was found to widely distribute with the individual differences in vivo and plays an important role in phase I metabolism of drugs and xenobiotics. The biological characteristics of AOX and its contributions in drug metabolism are introduced briefly in this review.

Key words: aldehyde oxidase; drug metabolism; molybdoflavoenzyme

1 引言

钼蛋白辅助因子 (molybdenum cofactor, MoCo) [2]。

有关AOX 的报道最早可追溯到20世纪30年代, 虽然此后陆续出现相关报道, 但直到近年来才逐渐得到重视。随着研究的深入, 发现其独特的结构、组织分布以及物种间差异等均对药物代谢产生重要影响。即便如此, 对于AOX 的了解仍十分有限, 远不及对细胞色素P450的认识深入。本文主要从AOX 的结构与种属分布差异、催化反应类型与机制以及在

醛氧化酶 (aldehyde oxidase, AOX) 与黄嘌呤氧

化酶 (xanthine oxidoreductase, XOR) 及亚硫酸氧化酶 (sulphite oxidase, SO) 相似, 同属钼−黄素蛋白家族 (molybdoflavoenzymes, MFEs) , 是参与嘌呤类分解代谢的重要酶系[1]。上述酶系发挥催化作用时需要黄素腺嘌呤二核苷酸 (flavin adenosine dinucleotide, FAD) 和有机钼化合物作为辅助因子, 后者也被称为

药物代谢与新药研发中的应用进行简要介绍。

2 醛氧化酶的结构与氧化机制 收稿日期: 2013-11-28; 修回日期: 2014-02-20.

基金项目: 十二五新药创制重大专项 (2012ZX09301002-001-007,

2012ZX09301002-006, 2012ZX09103-101-001); 国家自然科学基金资助项目 (81072696).

*通讯作者 Tel / Fax: 86-10-63165172, E-mail: [email protected]

醛氧化酶主要存在于哺乳动物细胞质中, 是一种与黄嘌呤氧化酶XOR 同源的钼蛋白, 二者的氨基酸序列高度相似。AOX 的活性形式如图1所示[3],

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由两个长度为150 kDa亚基组成的同源二聚体构成, 其中每个亚基又含有3个结构域: 长度为20 kDa、可结合两个铁原子的N 末端结构域, 长度为40 kDa、包含一个FAD 结合位点的结构域以及一个长度为 85 kDa、含有底物结合口袋及MoCo 结合位点的C 末端结构域, 3个结构域之间借铰链区相连。

图1 AOX结构示意图[3]

目前对哺乳动物体内钼离子的了解大多是通过直接提取动物体内蛋白分析而得, 包括底物特异性、动力学、光谱学性质和三级结构特征等。虽然已有文献报道, 黑腹果蝇XOR 可在构巢曲霉中表达[4], 大鼠Aox1可在大肠杆菌中表达[5], 但具有催化活性的重组MFE 在异源系统的有效表达仍比较困难, 主要原因是常用培养体系大多不具备相应的MoCo 生物合成机制, 或是很难产生足够量MoCo 供给MFE 载脂蛋白的合成。

AOX 催化过程如图2A 所示[6], 参与此过程的 氧化还原位点按照其接收电子的顺序自上而下依次排列: 底物R-H 在钼原子处被氧化生成产物R-OH, 相应的还原产物则在黄素辅助因子处被氧分子重新氧化回到氧化形式, 2Fe/2S (通常从简写作还原状态, 图中用“red ”标注) 介导电子从MoCo 向FAD 的传导, 同时也可在催化过程中储存反应中间体。催化机制为在碱性条件下, Mo-OH对底物羰基C 原子进行亲核攻击从而发生氧化反应, AOX结构中第1 271位的谷氨酸 (Glu) 残基直接参与此过程 (图2B) 。

众所周知, CYP450在外源物和药物代谢中起重要作用, 而AOX 介导的氧化羟基化反应则是对其很好的补充。虽然两种酶蛋白均是将分子氧作为电子的最终接受体[7−9], 但与CYP450不同的是, AOX所需的分子氧来源于水而非氧气。AOX 催化含氮杂环的

图2 AOX催化过程及机制示意图[6]

反应时以负氧阴离子亲核攻击杂原子邻位的碳原子以启动反应, 其难易程度直接决定此反应能否发生, 也决定了该杂环化合物是不是AOX 的底物。CYP450还可氧化芳杂环中的氮生成氧化产物, 如氧化吡啶, 而AOX 不催化此类反应。除此之外, AOX也不能催化类似CYP450介导的N -或者O -脱烃基氧化反应。

此外, XOR与AOX 的结构及基因起源具有较高相似性, 但催化机制与AOX 存在明显差异。生理状态下, 80%的XOR 以黄嘌呤氧化脱氢酶[10, 11] (xanthine

oxidase dehydrogenase, XDH) 形式存在, 催化过程中将电子传递给NAD +生成NADH, XDH进一步将电子

传递给氧分子, 释放过氧阴离子 (O2•−) 和过氧化氢

(H2O 2) 后转变为XOR, 半胱氨酸残基是介导这一过程的重要结构。目前已经证实哺乳动物XDH 结构中存在高度保守的Cys 535和Cys 992[12], 但在AOX 中起到关键作用的则是酪氨酸残基[13], 且在催化过程中并不以脱氢酶形式参与电子的传递, 因而不需要NAD +作为辅助因子, 也就不存在与之结合需要的特

定酪氨酸残基[14]。

与AOX 同属钼−黄素蛋白家族的SO, 虽然结构中的MoCo 也为其催化过程中的关键位点[15], 但是其结构与AOX 存在明显差异[16]。以动物体内的SO 为例, 其活性形式同源二聚体的每个亚基包含两个氧化还原中心, 即MoCo 结合位点以及b 型血红素结合位点, 其催化过程及机制与上述位点关系密切。

另外, AOX不仅具有氧化活性, 还具有一定的还原能力, 其作用与CYP450还原酶、NAD(P)H-醌氧

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化还原酶等具有交叉性, 均可催化亚砜和硝基的还原及环裂解, 但具体机制至今尚未明了。 3 种属差异与组织分布

直至20世纪末还认为脊椎动物MFE 只包含AOX1和XOR 两个成员。人体内编码这两种蛋白的基因分别存在第2号染色体的p 和q 臂[17−20], 其他高等脊椎动物亦如此。随着近年来对相关基因研究的不断深入, 发现实际情况更为复杂, 如小鼠中就存在4种醛氧化酶[21−23]。

与广泛存在于原核生物、植物、动物及人类中 达量最高, 并受肝内活性的影响。AOX 在其他组织中的分布因物种不同而存在较大差异, 如小鼠肺组织Aox 活性显著高于大鼠同组织[38, 39]。人除肝外组织中, 肺、胃肠道、肾等排泄器官也可检测到AOX 活性, 胃肠道中AOX 主要表达在小肠和大肠。呼吸系统中AOX 主要在上皮细胞和肺泡细胞中表达, 高于气管和支气管。肾脏的近端小管、远端小管和收集管都能检测到较高水平的AOX 活性。此外, 内分泌组织和脑中也可检测到AOX 活性[40]。 4 底物与抑制剂

高度保守的XOR 不同, 除细菌表达AOX [24−27]外, 原核生物中是否存在AOX 目前仍未得到充分证实。此 外, 原核生物中的MFE (如异喹啉氧化酶[28]) 即便氨基酸序列和底物特异性与脊椎动物AOX 具有一定的相似性, 但两者并不能归为同类酶蛋白。牡蛎的AOX [1, 29−35]是第一个被成功结晶的钼−黄素蛋白, 也是唯一一个与脊椎动物AOX 存在远亲关系的AOX, 但其结构中缺乏FAD 结构域, 相比脊椎动物存在显著的结构差异。

小鼠Aox 集中在1号染色体的c1带, 共包含4个基因, 长度为350 kb。经蛋白质一级结构确认, 上述4个基因对应的蛋白产物具有较高的相似性, 即60%的氨基酸序列相同。

若按照从染色体端粒到着丝粒的方向排列, Aox1最靠近染色体端粒, 是哺乳动物中首先被报道的牛醛氧化酶的同源基因[36], 同时也是人AOX1的同源基因。Aox3位于Aox1下游约5 kb处, 而后相距约20 kb处是Aox4, 而Aox3l1则位于Aox4下游约10 kb处。AOX 呈基因簇形式存在, 大鼠基因簇位于染色体9q31[22], 与小鼠极为相近。

犬第37号染色体存在两个醛氧化酶基因, 与啮齿类动物Aox1、Aox3高度相似的DNA 序列不能编码活性蛋白产物[37], 而与Aox4、Aox3l1同源的序列则可以。由于目前仍缺乏实验数据的确证, 因此很难确定其基因序列的正确性。

人体内仅存在一种醛氧化酶, 与小鼠Aox1同源[1]

, 由染色体2q32.3−33.1基因编码。黑猩猩染色体2b 中的小部分与人类染色体2q32.3−33.1基本一致。而在猕猴体内, 位于第12号染色体的3段相关基因分别编码Aox1、Aox4、Aox3l1对应蛋白。

哺乳动物AOX 可通过基因删除或插入假基因的方式达到抑制表达的目的, 与物种进化过程相关, 但其具体原因还有待进一步研究。目前已知啮齿类和有袋类动物是仅有的两类具有全部4个AOX 的生物。

AOX 广泛分布于体内多个组织器官中, 肝脏表

AOX 可催化多种化合物的氧化、还原反应, 其底物主要包括: 醛类、亚硝基化合物、亚胺类及杂环类化合物等。临床众多含氮、含氧杂环类药物都可经AOX 代谢, 如常见的酞嗪类、喹唑啉类、氨基蝶呤类药物[41, 42], 经典底物吡哆醛、甲氨蝶呤经AOX1的氧化反应如图3所示。另有研究显示, 经典免疫抑制剂、抗肿瘤药甲氨蝶呤在人和灵长类动物体内均可被AOX 氧化生成7-羟基化物, 啮齿类则无此反应[43], 呈现一定的种属差异。

图3 吡哆醛、甲氨蝶呤经AOX1氧化反应示意图

AOX 已被证实可以氧化嘧啶和嘌呤类似物。上述化合物中部分是其特异性底物, 其余则是AOX 与XOR 的共同底物。以6-巯基嘌呤为例, 可先被XOR 代谢成6-巯黄嘌呤再经AOX 或XOR 生成6-硫尿 酸[44], 与此相似的还有咖啡因的代谢, 同样也是由AOX 和XOR 共同参与[45]。上述研究说明AOX 和XOR 可竞争性地催化二者的共同底物, 而这种竞争作用的机制较为复杂, 给药物间相互作用预测增加了一定的难度。

米家琦等: 醛氧化酶的研究进展

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目前通常认为AOX 相比于XOR 具有更加广泛的底物特异性: XOR的氧化反应主要只涉及嘌呤、嘧啶、黄嘌呤及次黄嘌呤类化合物, 而AOX 则可催化脂肪族及芳香族醛类, 含氧、含氮杂环等[46−48]。此外, 并且AOX 可在无氧条件下催化包括1-硝基芘、2-硝基芴、4-硝基联苯在内的多种环境污染物的硝基还原反应[49]。其可能的原因在于AOX 的底物结合口袋相较XOR 而言更大也更易发生变构现象, 因而可结合多种结构特性的化合物。

数年来, 关于AOX 抑制剂的讨论一直未有定数, 相关的文献报道也存在一定分歧, 其主要原因可能在于抑制剂设计只针对AOX 不同结构域, 具体作用机制研究尚不完善, 因而至今没有较为系统的归纳总结, 现仅列举代表性化合物说明。

苯醌类化合物1-甲萘醌 (维生素K3[50]), 为体外研究的常用抑制剂[51−53], 对4种AOX 均可产生抑制作用 (1 μmol·L−1), 但对XOR 则无影响, 因此多用于区分AOX 和XOR 的底物。需要特别注意的是, 1-甲萘醌同时也是NAD(P)H-苯醌氧化还原酶的强抑制剂, 实验中还需排除这两种酶的干扰, 避免误判。

甾醇类及部分酚类化合物如天然性激素雌二 醇、炔雌醇及人工合成雌激素 (雷洛昔芬、己烯雌酚) 等[54, 55]均具很强的AOX 抑制作用, 其中雷洛昔芬的研究最为深入, 在nmol·L−1水平就可明显抑制人AOX 活性[55], 而其他的抑制剂大多在μmol·L−1才能表现出相似作用[56]。雷洛昔芬双甲基衍生物的抑制活性较原型药下降了约1 000倍, 说明结构中的酚羟基与活性密切相关。此外, 结构中疏水2-苯氧基哌啶也是活性相关结构, 但哌啶环上氮的碱性强弱对活性无明显影响[55]。

吩噻嗪类药物如氯丙嗪、奋乃静等也是AOX 的强抑制剂, 抑制浓度低于1 μmol·L−1, 且可作用于不同物种的AOX [54]。

近来, 黄酮类化合物对AOX 的抑制作用逐渐引起注意。由于这类化合物广泛存在于人类日常饮食和常用中草药中, 且会减少生物体内活性氧的生成进而影响疾病的发展进程, 因而其与AOX 的相互作用的研究亟待深入[57]。除去以上提到的几类化合物外, AOX抑制剂还常常含有吖啶、喹啉、氨基胍、二苯甲基等结构。 5 AOX与药物代谢

如前所述, 具有芳香骨架或者含氮杂环化合物都可能是AOX 的底物, 因此人AOX1在药物的Ⅰ相代谢中具有重要的研究价值。由于AOX 依赖的代谢反应可能影响相关药物的药效、代谢特性与毒性反应,

了解这些具有特定化学基团的药物与AOX 之间的相互作用应当成为常规评价指标[3]。但遗憾的是, 这类研究涉及的体外检测体系如重组蛋白、高表达细胞模型及富含该成分的细胞或组织片段的应用受到条件限制, 导致体外AOX1氧化代谢研究的难度增加。

人肝细胞浆中几乎检测不到CYP450活性, 可用于药物经AOX1代谢的研究。但是受制备工艺限制, 其稳定性较差。另外, 由于明显的种属差异, 大鼠和小鼠的胞浆均不能替代人肝细胞浆, 目前认为来源于猕猴和DBA/2、CBA 小鼠的胞浆提取物可以替代人源化样品[58]。

应用细胞模型评价AOX 介导的药物代谢也有一定局限性。由于体外细胞中AOX1 mRNA的翻译及全酶的装配过程常存在缺陷, 因而很难在转染细胞系中检测到其活性。如常见HepG2细胞系可以产生AOX1的转录产物, 但对于其能否合成相应蛋白仍存在争议[58−60]。另外, 两个常用人肝细胞系Hep3B 和PLC/PRF/5则不表达AOX1[59]。

低温保存的人肝细胞和原代细胞可以用于此类研究[56, 59, 61], 但实验材料的稀缺性在很大程度上限制了其应用。到目前为止, 还未能通过基因工程手段建立可稳定高表达AOX1的哺乳动物来源细胞系, 常用的宿主细胞大多缺乏一个或多个MoCo 合成中所必需的组分[1, 2, 62]。如能克服上述问题, 建立稳定高表达AOX1的细胞系, 无疑将对体外代谢研究具有很大帮助。

大多数啮齿类动物肝脏可同时表达Aox1和Aox3, 但以Aox3为主, 人类则只表达AOX1。已知小鼠Aox3的底物特异性和人AOX1对应的小鼠Aox1存在明显差异[58]。DBA/2和CBA 近交品系小鼠因其肝脏Aox3存在后天基因沉默现象而基本不表达, 可作为体内研究动物[58]。

但是即便如此, 使用啮齿类动物依旧存在一定局限性, 即与人类代谢过程存在催化性质和活性的差异。如人体内N 1-甲基烟酰胺经AOX 的代谢后主要生成N 1-甲基-2-吡啶酮-5-甲酰胺, 而 在啮齿类中则生成几乎等量的N 1-甲基-2-吡啶酮-5-甲酰胺和N 1-甲基-4-吡啶酮-5-甲酰胺[63]。此外, 啮齿类Aox 肝外表达也存在显著差异, 比如哈氏腺中富含Aox4[64]。犬中AOX1和AOX3以假基因形式存在[37], 所以检测不到其活性。相较于以上提到的实验动物, 猕猴肝脏中只表达单一类型AOX, 且与人类AOX1的同源性超过90%[65], 因此可用于AOX 的体内研究, 是目前所知最佳体内研究动物。此外, 有关AOX 参与的药物的体内外过程桥接, 特别是体内清除率的预测正逐渐成为研究的热点[66−68]。

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人群中AOX 活性的个体差异主要源于其等位基因的存在, 且已被证实影响甲氨蝶呤的羟基化反应[38]。编码区单个核苷酸错义引起的基因多态性可能导 References

[1]

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除基因差异外, 在啮齿类动物已发现性别差异也会影响AOX 活性, 即雄性小鼠的Aox 活性较雌性高出2～4倍

[74]

。这可能是因为雄激素可诱导小鼠Aox1

和Aox3的表达, 而雌激素则起相反作用, 如主要经AOX 代谢的胞苷类似物zebularine 在肠息肉模型中的抗肿瘤效果在雌性动物中优于雄性动物[74, 75]。

此外, 年龄以及疾病状态如癌症、糖尿病的发生及相关治疗药物的应用也会引起AOX 活性的改变。大鼠胚肝中检测不到AOX, 但从出生起表达量显著增加并持续到6周龄[76]。而在日本儿童中的调查[77]发现, AOX1活性在出生后逐步上升, 1岁前的表达水平较成年后低, 这对指导通过此酶代谢的儿科用药具有重要意义。不同肿瘤组织中AOX1的表达量也存在差异

[59]

, 如恶性胶质瘤和乳腺癌等少数肿瘤中

存在AOX1表达上调, 可被用于抗肿瘤前药5-氟-2-氨基嘧啶的原位激活, 以期通过提高靶组织选择性获得更好的治疗效果。与之相比, 更多肿瘤组织中AOX1的表达呈下调趋势, 如原发肝细胞癌中表达水平明显低于正常肝细胞, 提示对于可被AOX1代谢失活的药物, 这些组织可作为潜在的靶点进行研究。 6 结语

近年来, 有关AOX 的研究已日渐成为药物代谢领域的热点。AOX1作为人体内分布广泛的代谢酶, 在药物及外源物的Ⅰ相代谢中均发挥重要作用。由于目前仍缺乏合适的体内外研究模型, 使得药物经AOX 代谢的药理、药代特性及毒性研究仍受一定限制。因此, 应用基因工程或其他技术手段构建理想的人源化模型, 进一步深入研究AOX 的氧化机制及表达调控机制有助于阐明其在药物代谢中的重要作用, 为新药开发及已有药物的代谢机制研究提供重要的理论依据。

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