白芨的无菌萌发与组织培养
云南大学学报(自然科学版),2010,32(S1):422~425JournalofYunnanUniversity
CN53-1045/NISSN0258-7971
白芨的无菌萌发与组织培养
叶
静,郑晓君,管常东,牛
芸,马海英
(云南大学生命科学学院,云南昆明650091)
摘要:以白芨成熟蒴果为材料,在不同培养基上进行无菌播种,种子萌发后利用组织培养方法进行无性系繁殖.试验结果表明:种子萌发的最佳培养基为1/2MS+6-BA1.0mg/L+1%活性炭;丛生芽增殖的最佳培1/2MS+0.5mg/LNAA用于生根的养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.15mg/L;不同于已有的研究结果,效果不佳,有待进一步研究.
关键词:白芨;种子萌发;组织培养;培养基中图分类号:Q813.1
文献标识码:A
文章编号:0258-7971(2010)S1-0422-05
白芨(Bletillastriata(Thunb.)Reichb.f.)为
兰科白芨属多年生草本植物.白芨的块茎为我国传统中药,白芨花色艳丽,也是一种很好的景观植物,因此市场对白芨的需求十分旺盛.由于市场需求的扩大,近年来我国大部分地区的野生白芨遭到过度采挖,导致其野生自然资源急剧减少,濒临灭绝,被国家列为重点保护的野生药用植物之一.为
人工繁育和栽培白芨势在必保护白芨野生资源,行.
白芨的种子非常细小且无胚乳,因此在自然状
况下很难萌发和生长,实生苗的栽培较为困难,传.但分株繁殖周期长,统栽培主要靠分株繁殖繁殖效率低,而且耗种量大,很难满足大量栽培的需要.组织培养技术可以快速繁殖大量种苗,远较分株繁殖法快捷高效.本文采用白芨成熟蒴果为材在不同培养基上进行无菌播种,种子萌发后利料,
用组织培养方法进行无性系繁殖,旨在实现白芨种苗的规模化生产而探索有效的快速扩繁技术.
[2-5]
[1]
先用75%的酒精表面消毒30s,再用0.1%的升汞(HgCl2)消毒10min,无菌水冲洗5~6次,用无菌滤纸吸干表面水分.然后在无菌条件下,用消过毒的手术刀切开蒴果顶部,用无菌镊子将种子均匀抖落在培养基上,立即盖上瓶盖,做好标记后,放在培养箱进行暗培养5d,再移至培养室,培养温度(25±2)℃,光照度2000~2500lx,光照12h/d.
实验设计了6组培养基,并在此基础上以不同pH设置2个实验组,pH分别为7.0与5.8,故共进行了12组培养基的实验.
表1
种子萌发培养基
Tab.1Differentmediumsofseedgermination编号1234567
配方
1/2MS+NAA1.0mg/L
1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L1/2MS+6-BA1.0mg/L1/2MS+6-BA1.5mg/L1/2MS+6-BA2.0mg/L
1/2MS+6-BA1.0mg/L+1%活性炭
1
1.11.2
材料与方法
植物材料实验采用的是成熟未开裂的野生白芨蒴果,采自云南省昆明市嵩明县果东村后山.
实验方法
(1)无菌播种
将采集的成熟未裂开的蒴果
*
收稿日期:2010-06-25作者简介::叶静(1990-),女,吉林人,云南大学2007级生命科学与技术基地班本科生.
E-mail:mahy@ynu.edu.cn.通讯作者:马海英(1971-),女,博士,主要从事结构植物学与植物发育生物学方面的研究,
第S1期叶静等:白芨的无菌萌发与组织培养423
无菌条件下,将约1cm高的单苗
转接到不同的丛生芽诱导培养基中,每种培养基配光照度2000~制5瓶.培养温度(25±2)℃,2500lx,光照16h/d.丛生芽诱导培养基是以MS为基本培养基,添加不同浓度的细胞分裂素6-BA和生长素NAA,1.0,1.5,2.0mg/L等4个其中6-BA设置了0.5,
梯度,而NAA的质量浓度均为0.15mg/L,因此培养基为MS+6-BA0.5~2.0mg/L+NAA0.15mg/L+pH5.8.
将诱导出的丛生芽切成单苗
分别转接到丛生芽诱导培养基和生根培养基上.培养温度(25±2)℃,光照度2000~2500lx,光照16h/d.
生根培养基为1/2MS+NAA0.5mg/L+pH5.8和1/2MS+NAA0.5mg/L+1%活性炭+pH5.8.
w(琼脂)以上培养基均含w(蔗糖)=3%,
=0.9%.
表2
(2)丛生芽增殖
2
2.1
结果
种子无菌萌发种子播种于培养基上进行培
种子吸胀,由黄褐养.20d后观察到有萌发的迹象,
27d时便可观察到种子变为绿色小球色变成绿色,
33d后原球茎发出绿色的芽尖.体状,即原球茎,4号与7号培养基的种从种子萌发数量来看,
子萌发率明显高于其它培养基,并且长势较好、萌发较快,即以单一激素6-BA且其质量浓度为1.0mg/L时萌发效果最好.其中7号培养基的种子萌发又明显早于4号培养基.有些原球茎在培养60d之后,长出了幼叶,同时很少数的原球茎则会继续长大但并不分化出幼叶(图1A).在同一培养基
常存在不同发育时期的原球茎、芽和幼苗.中,
(3)生根诱导
2.2
1cm高的单苗转接到不同的
15d后便可观察到原球茎出丛生芽诱导培养基中,
丛生芽诱导
30d左右即可观察到丛生芽长出现很多个小突起,
(图1B).
6-BA不同浓度对丛生芽诱导的影响
Tab.2Effectofdifferentconcentrationsof6-BAonmultipleshootbudsinduction
6-BA/(mg·L-1)
0.51.01.52.0
NAA/(mg·L-1)
0.150.150.150.15
总接种数/个
50505050
总萌芽数/个
16444232
诱导率/%
32888064
6-BA质量浓度为1.0mg/L,NAA为从表2可见,
0.15mg/L时诱导率最高,丛生芽长势较好,诱导率最高,相较于其它不同浓度的培养基中的苗健壮,颜色鲜绿.6-BA浓度较低时,丛生芽诱导系数降低,苗细小,颜色偏黄.6-BA浓度较高时,也会使丛生芽诱导率降低,但又比6-BA浓度较低时的诱导率高.2.3根诱导导培养基中.
30d后便可观察到在不含活性炭的培养基中,
假鳞茎基部出现了许多幼根(图1C),在生根的同时,幼苗明显地长高变粗,并且叶片逐渐增多,同时颜色加深,最后形成了健壮的完整植株.生根的小在无菌操作条件下,将诱导出的丛生芽切成约2cm高的单苗分别转接到的两种根诱
组培苗可以进行炼苗进而移栽到培养室外,逐步驯化直至实现野外栽培.
在含活性炭的培养基中,白芨苗长势不佳,较弱小,颜色偏黄,可见活性炭对生根有抑制作用.
3
3.1
讨论
本实验白芨的种子在各培养基上的萌发率均达90%以上,除极少数种
白芨种子的无菌萌发
子可能因培养基失水而未能吸涨外,均能萌发.张
[6]
建霞等发现蒴果的胚龄越长,白芨种子的有胚率越高.本研究所用的白芨蒴果为野外采集的已经成熟但尚未开裂的蒴果,显然是正常有性生殖的类型,故萌发率高.
424云南大学学报(自然科学版)第32卷
图1
Fig.1
种子无菌萌发(A),丛生芽诱导(B),生根诱导(C)
ThegerminationofBletillastriataseed(A),Multipleshootbudsinduction(B),Rootingoftubeplantlets(C)
无菌播种实验中配制了2种不同pH值的培
养基,即5.8和7.0.通常植物组织培养实验中,采而pH为7.0的培养基被用的培养基pH值为5.8,
认为不利于植物生长.但我们通过实验发现,白芨在pH为7.0的培养基和pH为5.8的培养基中,萌发状况相差不多,同时萌发后白芨苗生长状况良在后续的丛生芽诱导以及根诱导过程中无生长好,
差异.当pH为7.0时,培养基的硬度较好,不易液化,对苗的支撑作用好.因此,在白芨培养体系中可考虑使用pH为7.0的培养基.
通过实验表明,白芨种子在单一激素6-BA且其质量浓度为1.0mg/L的培养基中萌发效果最这与袁宁等好,
[7]
绝大多数采用的都是添加相似.诱导生根阶段,
NAA,过去对白芨的多项研究也是采用NAA诱导生根
[8-10]
.本研究也采用1/2MS+NAA0.5mg/L
的培养基进行生根诱导.但与过去报道的研究结果
本实验采用此培养基的生根效果不够理想.不同,
这可能和兰科植物本身的根发育特性有关,也可能和实验期间温度降低有关.为保证移栽的效果,今后还需要对此进行深入研究.
3.3活性炭对白芨组织培养的影响
在植物组织
培养中经常要用到活性炭.活性炭的加入可以促进或抑制离体生长.通过实验发现,加入活性炭有利于种子的萌发以及白芨幼苗的生长.而在诱导白芨苗生根时,活性炭的加入会抑制生根,其原因可能是因为活性炭会吸附培养基中由白芨生长代谢产生的有毒物质,从而有利于种子的萌发,以及白芨幼苗的生长,但同时活性炭也会吸附部分营养物质,本实验生根培养时使用1/2MS的培养基,其营但由养物质浓度低.生根的苗会需要更多的营养,于活性炭吸附了一些营养物质,致使苗无法获得足够的营养物质生长,因此其生根受到抑制.
的结果相似.此外,本实验对培
养基中添加活性炭的研究表明,活性炭可以有效地
促进白芨种子在基本培养基上的萌发,其萌发率和萌发速率都明显地高于其他培养基.
3.2不同生长调节剂对白芨丛生芽增殖与生根诱导的影响根据前人的研究,本实验主要使用了6-BA和NAA2种植物激素.结果表明,不同浓度而的6-BA对白芨丛生芽的诱导有很大影响,NAA的影响很小.当6-BA质量浓度为1.0mg/L时诱导率最高,这与朱玉球
[8]
[9]
、吴华芬等的结果
第S1期叶静等:白芨的无菌萌发与组织培养425
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SeedgerminationandtissuecultureofBletillastriata
YEJing,ZHENGXiao-jun,GUANChang-dong,NIUYun,MAHai-ying
(TheSchoolofLifeSciences,YunnanUniversity,Kunming650091,China)
Abstract:EfficientprotocolswereestablishedforinvitroseedgerminationofBletillastriata(Thunb.)Reichb.fandmultipleshootbudsinductionfrominvitro-raisedseedlings.Theeffectsoftwoplantgrowthregu-latorsandctivatedcharcoal(AC)weremeasured.Thebetterprotocolforseedgerminationis1/2MS+6-BA1.0mg/L+1%AC,andthatformultipleshootbudsinductionisMS+6-BA1.0mg/L+NAA0.15mg/L.Unlikepreviousstudiesbyotherpeople,themediumwith1/2MS+0.5mg/LNAAwasnotidealforthegrowthofroots.Thiswillneedmoreresearchontherootformationmedium.
Keywords:Bletillastriata;seedgermination;tissueculture;medium