产蛋白酶菌的筛选及产酶条件优化

陇东大学

学士学位毕业论文（设计） 蛋白酶产生菌的筛选及产酶条件优化

生命科学与技术学院

08生物技术班

作者：

指导教师：

蛋白酶产生菌的筛选及产酶条件优化

何泰 杜旭 谢丽娟 ，刘丽萍

(陇东学院 生命科学与技术学院，甘肃 庆阳 745000)

摘要：采用陇东学院污水处理厂附近土壤、农田土壤及养殖场附近土壤作为样品，利用牛奶水解圈筛选模型从中分离筛选得到产蛋白酶能力较高的菌株whr1，初步鉴定该菌株属于芽孢杆菌。并对其产酶条件进行优化，结果显示该菌最适培养时间为24h，最佳碳源为质量浓度1% 蔗糖，最佳氮源为质量浓度1.5%酵母膏，最适初始pH值为6.0，最适发酵温度为35℃。

关键词：菌种筛选，鉴定，蛋白酶，条件优化

Protease produced the screening of the bacteria and the optimization of the

enzyme production conditions

（College of life science and technology, Longdong University, Qingyang 74500, Gansu, China）

Abstract：The sewage treatment plant soil near east institute, soil and soil samples near farms .Using milk hydrolysis circle screening model separating screening in high ability get protease whr1 strains. Preliminary appraisal of the fungus belong to bacillus. After the optimization of the condition, the capability of whr1 was improved, the optimal condition is: The time is 24h; carbon source is sucrose 1%; nitrogen source is Yeast extract 1.5 %, the pH is 6.0; fermentation temperature is 30℃.

Keyword: Screening，Identified，Protease, Conditions optimization

0引言

蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶[1]，也是目前世界上产销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的60％，微生物蛋白酶从微生物中提取，不受资源、环境和空间的限制，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性[2,3]。目前，蛋白酶的研究仍注重于新品种的发掘，并通过分离筛选、发酵条件优化和诱变育种或构建基因工程菌等综合手段获得高产蛋白酶的优良菌株[4,10]。我国的蛋白酶研究还存在如微生物资源开发不足，蛋白酶种类较少，酶制剂品种单一等问题。

本论文从以下几方面对蛋白酶产生菌株进行较为系统的研究：从土壤中筛选出产蛋白酶能力较高菌株。对筛选出的菌株进行形态学的鉴定，将菌株初步确定到属。研究产蛋白酶菌株发酵产酶条件，对培养基成分和发酵条件进行优化，确定最佳培养基配方和发酵条件，进一步提高菌株的产酶活力。

1实验材料及方法

1.1 实验材料与仪器

1.1.1 实验仪器

电热压力蒸汽灭菌锅 全温振荡培养箱 生化培养箱 超净工作台 电子分析天平 离心机 pH测量仪 分光光度计 水浴锅 微波炉

1.1.2 实验材料

①样品：分别采自陇东学院污水处理厂附近，农田土壤及养殖场附近的土壤。

②主要试剂：脱脂奶粉，氯化钠（NaCl），蔗糖，碳酸钠，酪氨酸，尿素，琼脂粉，牛肉膏，蛋白胨，三氯乙酸，结晶紫，干酪素，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠

③ 培养基

种子斜面培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，琼脂粉20.0g，水1000ml，121℃灭菌20min，备用。

筛选培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，琼脂粉20.0g，脱脂奶粉25.0g，水1000ml，106℃灭菌6min，备用。

基础培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，水1000ml，121℃灭菌20min，备用。 ④试剂配制

0.4mol/L碳酸钠溶液：称取无水碳酸钠42.4g，定容至1000ml。

0.4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液：称取三氯乙酸65.4g，定容至1000ml。

pH7.2磷酸缓冲液：称取磷酸二氢钠31.2g，定容至1000ml，即成0.2mol溶液（A液）。称取磷酸氢二钠71.63g，定容至1000ml，即成1.2mol溶液（B液）。取A液28mL和B液72ml，再用蒸馏水稀释1倍，即成0.1mol/L pH7.2的磷酸缓冲液。

2％酪蛋白溶液：准确称取干酪素2g，称准至0.002g，加入0.1N氢氧化钠10mL，在水浴中加热使溶解（必要时用小火加热煮沸），然后用pH7.2磷酸缓冲液定容至100ml即成。配置后应及时使用或放入冰箱内保存，否则极易繁殖细菌，引起变质。

100µg/mL酪氨酸溶液：精确称取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1g，逐步加入6ml 1mol/L盐酸使溶解，用0.2mol/L盐酸定容至100ml，其浓度为1000µg/mL，在吸取此液10ml，以0.2mol/L盐酸定容至100ml，其浓度为100µg/mL的酪氨酸溶液。此溶液配成后液应及时使用或放入冰箱内保存，以免繁殖细菌而变质。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株筛选

富集：将从陇东学院污水处理厂附近，实验楼前植物园土壤及养殖场附近的土壤采集的土壤 ,分别称取5g土样，放入装有45ml无菌水的三角瓶中，37℃震荡培养24h。

初筛：将富集培养的菌液取1ml，用无菌水依次稀释到10，分别取 10 、10 、10 三个梯度各0.1ml土壤稀释液制成混菌平板，将培养皿放入37℃培养箱中培养24h

选择生长良好、

形态明显的单

菌落，用无菌牙

签挑种到牛奶筛选培养基上，每个平皿中接4-5个，37℃培养箱中培养24h。挑选出能在牛奶筛选培养基上产生水解圈的单菌落，接种到斜面培养基上，放入冰箱冷藏。

复筛:从冰箱中取出初筛得到的菌株，转接试管斜面活化，37℃下恒温培养 24 h。各取1环，接种到装液量为20ml基础培养基的50ml三角瓶中，在37℃条件下摇床培养24h。分别取各菌株发酵液10μl滴加在牛奶筛选平板中的滤纸片上 (直径为12mm)，然后将培养皿放入37℃的培养箱中培养24h，取出后测量水解圈直径与菌落直径。重复此过程3次，取平均值，选取水解圈直径与菌落直径差值最大的菌株作为出发菌株whr1。

1.2.2 蛋白酶产生菌酶活力的测定

酶活测定原理：酶活力是指酶催化某些化学反应的能力。酶活力的大小可以用在一定条件下它所催化的某一化学反应的初速度来表示。测定酶活力实际就是测定被酶所催化的化学反应的速度，即可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表示。蛋白酶可以催化酪蛋白水解生成酪氨酸。酪氨酸为含有酚羟基的氨基酸，可与福林试剂发生福林酚反应。（福林酚反应：福林试剂在碱性条件下极其不稳定，容易定量地被酚类化合物还原，生成钨蓝和钼蓝的混合物，而呈现出不同深浅的蓝色。）利用比色法即可测定酪氨酸的生成量，用蛋白酶在单位时间内水解酪蛋白产生的酪氨酸的量来表示酶活力[11]。

酶液的制备：

从斜面培养基中取1环菌种于30ml基础发酵培养基中，在37℃、140rpm摇床上培养12h，再分别取1ml经12h培养的菌液于不同条件的液体培养基中培养24h，然后培养液于5000rpm离心10min取其上清液为酶液。

酪氨酸标准曲线的制作：

取6支25ml的比色管，编号，按下表操作

表1-1 制作酪氨酸的标准曲线 [8,9]-7-5-6-7。取出培养好的平皿，管号 试剂

测定步骤：

取6支试管编

号按表1分别

吸取不同浓度

酪氨酸1ml，各酪氨酸最终浓度，µg/ml 蒸馏水，ml 100µg/ml酪氨酸，ml 1 10 0 0 2 8 2 20 3 6 4 40 4 4 6 60 5 2 8 80 6 0 10 100 加入0.4mol/L碳酸钠5ml，在各加入的福林试剂1ml。摇匀置于水浴锅中，40℃保温发色20min，用722型分光光度计进行测定（波长660nm）。测三次，取平均值。将1-6号管所测得的光密度（OD）减去一号管所测得的光密度为净OD值。

测定酶活方法：

取25ml比色管3支，每管内加入酶液1ml，置于40℃水浴中预热2min，再各加入经同样预热的酪蛋白1ml，精确保温10min，时间到后，立即再各加入0.4mol/L三氯乙酸2ml，以终止反应，继续置于水浴中保温20min，使残余蛋白质沉淀后离心或过滤，然后另取25mL试管3支，编号1、2、3，每管内加入滤液1ml，再加0.4mol碳酸钠5ml，已稀释的福林试剂1ml，摇匀，40℃保温发色20min后进行光密度（OD）测定。

空白试验同样取试管3支，编号（1）、（2）、（3），测定方法同上，唯在加酪蛋白之前先加0.4mol/L三氯乙酸2ml，使酶失活，再加入酪蛋白。

1.2.3产酶条件优化

产酶曲线测定：在50ml基础培养基中，分别在37℃下培养0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h，测其酶活。

不同碳源对产酶的影响：在50ml基础培养基中其他成分不变，选用4种浓度为1%的不同的碳源，分别为麦芽糖、乳糖、蔗糖、葡萄糖，37℃ 140 rpm培养最优时间，测其酶活。

不同氮源对产酶的影响：在50ml基础培养基中加入最优碳源，氮源改用5种浓度为1.5%的不同的氮源，其他成分不变，分别是尿素、(NH4)2SO4、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏，37℃以最优时间培养，测其酶活。

不同培养基初始pH值对产酶的影响：在50ml基础培养基中加入最优碳源、氮源，其他成分不变，选用5种不同的pH，分别是pH 5、pH 6、pH 7、pH 8、pH 9，37℃以最优时间培养，测其酶活。 不同温度对产酶的影响：在50ml基础培养基中加入最优碳源、氮源，其他成分不变，采用最优pH值，分别在31℃、33℃、35℃、37℃、39℃下以最优时间培养，测其酶活[6,9]。

2实验结果

2.1 菌株筛选

2.1.1 菌株的分离筛选

将土样利用牛奶筛选培养基分离得到具有蛋白酶活性的菌株，选出其中水解圈较大的whr1号菌

株进行后续实验，并斜面保藏。

图2-1 菌种筛选 图2-2 菌种筛选

2.1.2 菌株的形态特征 图2-3 菌种筛选

对whr1号菌株分离纯化，在37℃培养24h后，观察单菌落，菌落呈透明乳黄色，湿润，菌落表面光滑，边缘形状不规则。革兰氏染色后，显微镜观察菌体呈蓝紫色，是阳性，菌体成直杆状。

[7]

图2-4 whr1革兰氏染色

2.2 蛋白酶酶活测定

整理数据作图得到酪氨酸的标准曲线，如图2-5所示：

图2-5 酪氨酸的标准曲线

酶活定义：在40℃下每分钟水解酪蛋白产生1µg酪氨酸，定义为1个酶活单位(U/ml)。 酶活计算公式：

酶活力(U/ml)=4*A*N/10

式中：A---由样品测得OD值，查标准曲线得相当的酪氨酸微克数；

4---4毫升反应液取出1ml测定；

10---反应10分钟；

N---稀释酶液的倍数。

2.3 条件优化

2.3.1不同培养时间对产酶的影响

产酶曲线测定：在50ml基础培养基中，分别在37℃下培养0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h，测其酶活。实验结果如图2-6所示

图2-6 时间对酶活性的影响

由表中可知，在培养24h和30h时差异不显著，18h和24h差异极显著，原因可能是0-24h时，随着时间的延长，酶活逐渐增加，培养到24h时菌株产酶活性最高，可能菌群生长已达到对数期。24-30h随着时间的延长，酶活逐渐降低，可能菌群生长到达稳定期。36h时酶活最低，菌群生长已

到达衰亡期。按理24h和30h都可以作为最佳培养时间，但考虑到省时省料，所以选择24h为细菌最佳培养时间。

2.3.2 不同碳源对产酶的影响

不同碳源对产酶的影响：在50ml基础培养基中其他成分不变，选用4种浓度为1%的不同的碳源，分别为麦芽糖、乳糖、蔗糖、葡萄糖，37℃培养最优时间，测其酶活。实验结果如图2-7所示：

图2-7 碳源对酶活性的影响

常用的碳源是一些单糖、低聚糖和多聚糖等碳水化合物。从表中可以看出，蔗糖最有利于产酶，酶活最大，与各个碳源之间差异极显著；麦芽糖次之，乳糖最小，尽管葡萄糖是速效碳源，但是也有关于葡萄糖会抑制蛋白酶产生的报道，故选择蔗糖为whr1菌株发酵培养基的碳源。

2.3.3不同氮源对产酶的影响

不同氮源对产酶的影响：在50ml发酵培养基中加入最优碳源，氮源改用5种浓度为1.5%的不同的氮源，其他成分不变，分别是尿素、(NH4)2SO4、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏，37℃以最优时间培养，测其酶活。实验结果如图2-8所示

图2-8 氮源对酶活性的影响

由表可知，在有机氮源中，以酵母膏、牛肉膏为氮源时发酵液酶活均较高，酵母膏最高，与其他氮源差异极显著；与有机氮源相比，无机氮源不利于菌体产酶，有机氮源的产酶效果要比无机氮源要好。有机氮源成份复杂，可能是含有的物质对产酶有一定的促进和诱导作用。由此结果，选择酵母膏为whr1菌株发酵培养基的氮源。

2.3.4 培养基不同初始pH值对产酶的影响

培养基不同初始pH值对产酶的影响：在50ml基础培养基中加入最优碳源、氮源，其他成分不变,选用5种不同的pH，分别是pH 5、pH 6、pH 7、pH 8、pH 9，37℃以最优时间培养，测其酶活，实验结果如图2-9所示。

图2-9 pH值对酶活性的影响

对大多数菌种来说，菌种有保持其体内细胞酸质度在近中性条件的能力，这样有利于菌体进行正常的新陈代谢和各种酶反应。但介质的pH值对细胞的新陈代谢和产酶有间接的影响。我们只做了培养基起始pH对产酶的影响，分别调整发酵液起始pH为5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，其它条件固定，进行摇瓶发酵试验，测定蛋白酶活力。结果表明，发酵培养基的起始pH值为6.0时，酶活力最高，与各个pH值差异极显著。pH偏高或偏低，都不利于菌体产酶。因此，确定发酵培养基的起始pH值为6.0。

2.3.5 不同温度对产酶的影响

不同温度对产酶的影响：在50ml基础培养基中加入最优碳、氮源,其他成分不变，采用最优pH值，分别在31℃、33℃、35℃、37℃、39℃下140rpm以最优时间培养，测其酶活。实验结果如图2-10所示

图2-10 温度对酶活性的影响

由于大多数细菌为中温菌，因此本试验选择了分别设定发酵温度为31，33，35，37，39，其它条件固定，进行摇瓶发酵试验，测定蛋白酶活力。35℃产酶量最高，与其他温度差异极显著。为其最适培养温度。温度的变化不但会影响发酵液的物理性质，也会影响各种酶反应的速率和蛋白质的

性质。温度升高，反应速率加大，生长代谢快，生产期提前，但是菌体容易衰老，发酵周期缩短，从而影响酶的最终产量。此外，温度高。最初细菌大量繁殖，其进行分解代谢释放的热量．使整个发酵体系的温度变得更高，加速了细菌的死亡。因此，要得到高产量的产物，必须选择适宜的发酵温度。若温度过低，细菌增殖周期加长，细菌总量较低，直接影响酶产量。

3.结论

（1）通过牛奶筛选培养基采用透明圈法从采集的土样中筛选得到蛋白酶产生菌whr1，对其纯化分离，培养一天后，进行形态学鉴定。在普通营养琼脂平板上菌落生长为边缘整齐，菌落成乳白色，菌落表面不透明，不产生色素。初步鉴定为芽孢杆菌。

（2）whr1号菌株的种子液扩大培养，发酵液在37℃ 140rpm条件下，培养到24h 酶活达到最大值。

（3）实验得出培养基最佳条件为：培养基中最佳碳源添加量为质量浓度1%的蔗糖，最佳氮源添加量为质量浓度1.5%的酵母膏，最适初始pH值为6. 0，最适发酵温度为35℃。最初未优化前所测酶活为4.501U/ml，经产酶优化后所测最高酶活为49.296U/ml。

通过对筛选出的蛋白酶产生菌的相关特性研究，我们可以通过改变或者调节菌株的外界条件来提高酶活性，使其可以应用与工业生产中，发挥生物资源的优势。

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