PCR实验报告-实时荧光

实验报告书

药物对大鼠局部脑缺血再灌注保护作用下

报告时间：2012年9月22日

荧光定量PCR （qPCR ）实验过程

实验名称：药物对大鼠局部脑缺血再灌注保护作用下基因表达情况 1. 实验材料与仪器

高纯总RNA 快速提取试剂盒购自Generay 公司；

逆转录试剂盒RevertAid First Strand cDNA synthesis Kit购自Fermentas 公司； qPCR 试剂IQ SYBR Green Supermix购自Bio-Rad 公司。 OD 值测量仪器(高精度分光光度计) 为Merinton SMA4000；

定量PCR 仪为CFX connect Real-Time PCR System，配套使用的分析软件为BIO-RAD CFX Manager。

相关耗材(Tip头、EP 管等) 购自Thermal Scientific Fisher公司，均为无RNase 、DNase 和无热源的分子生物学耗材。

2. 实验方法与操作步骤

2.1 Trizol法提取细胞总RNA

注：本实验共27个大鼠脑组织样本，分别标注为： 第3天取材样本：

正常组CK3d-1、CK3d-2、CK3d-3； 模型组M3d-1、M3d-2、M3d-3； 治疗组T3d-1、T3d-2、T3d-3； 第7天取材样本：

正常组CK7d-1、CK7d-2、CK7d-3； 模型组M7d-1、M7d-2、M7d-3； 治疗组T7d-1、T7d-2、T7d-3； 第14天取材样本：

正常组CK14d-1、CK14d-2、CK14d-3； 模型组M14d-1、M14d-2、M14d-3； 治疗组T14d-1、T14d-2、T14d-3；

1) 组织约200mg 用液氮研磨至粉末状，加1ml Trizol 继续研磨至匀浆，室温放

置~15min，使其充分裂解。 2) 12,000rpm 离心 5min ，弃沉淀

3) 用1ml 针筒，26-G 号针头抽吸裂解液15-20次，以剪切基因组DNA 。 4) 按200ul 氯仿/ml Trizol 加入氯仿，剧烈振荡混匀30s 。 5) 室温 12,000rpm 离心 5min 。

6) 吸取上层水相，至另一离心管中，加入150ul 无水乙醇，混匀。

7) 将上述溶液全部（包括沉淀）转移到套放于2ml 收集管内的GenClean 柱中，

室温放置2min ，12000rpm 离心1分钟。

8) 弃去废液，加入45ul RPE Solution，12000rpm ，室温离心30s 。 9) 重复步骤6。

10) 弃去废液，将柱子放回收集管，10000rpm ，室温离心30s 。

11) 将柱子转移至RNase-free 的1.5ml 离心管中，在柱内膜的中央小心加入

40ulDEPC-H 2O ，55~80℃放置2分钟。

12) 12000rpm ，室温离心1min 。（H 2O 、TE 或 0.5%SDS均须用DEPC 处理并高

压灭菌。）

2.2 RNA纯度的测定和RNA 的定量

以相应溶剂为对照(Blank)，取2μl RNA溶液于Merinton SMA4000检测，观察A260/A280 、A260/A230比值及连续波长吸收峰，并计算RNA 溶液浓度，判断RNA 提取质量：A260/A280>2.0且

OD 值检测结果另附。见于最终报告“4. 补充文件”文件夹。 2.4逆转录实验

1) 把以下试剂加入到EP 管中（总共12 μl）： 总RNA

x μl(约1μg)

Oligo(dT)18引物 随机引物 DEPC 水

1μl 1μl 10-x μl

2) 混匀，短暂离心，65℃干浴5min 。 3) 在冰上冷却，短暂离心，再放回冰上。 4) 往EP 管里面加入以下试剂（总共8μl）： 5 x Reaction Buffer

4μl 1μl 2μl 1μl

Ribolock TM RNase Inhibition(20U/μl) 10mM dNTP(mix)

RevertAid TM M-MmLv Reverse Transcriptase

至总体积20μl

5) 混匀，25℃干浴5min ，接着42℃干浴60min 。 6) 70℃干浴5min 终止反应。

7) -70℃保存cDNA 。按RNA OD值报告所示浓度计算ddH 2O 量，将RT 产物稀释

成一致水平。

2.5荧光定量PCR 扩增实验 1) 引物序列如下：

：：目标基因的Genbank ID为；PCR 产物大小为：150 bp。

：：目标基因的Genbank ID为Gene ID: ；PCR 产物大小为：140 bp。

：：目标基因的Genbank ID为PCR 产物大小为：303 bp。

2) PCR 扩增反应体系 iQ SYBR GRN SUPERMX Forward primer, 10 µM Reverse primer, 10 µM

12.5 μl 1 μl 1 μl

cDNA(加水稀释成一致水平) 10.5μl

3) qPCR 实验参数 1: 50.0°C for 3min 2: 95.0°C for 3min 3: 95.0°C for 10s 4: 59.0°C for 20s

5: 72.0°C for 20s Plate Read 6: GOTO 3, 45 more times

7: Melt Curve 70°C to 95°C : Increment 0.5°C for 10s Plate Read

3．实验结果的统计与分析

实验结果由荧光定量PCR 分析软件BIO-RAD CFX Manager进行统计和计算，并生成相应的PDF 文档和EXCEL 原始数据文件。结果呈示如下：

图1. 单样本BDNF 、EGF 基因检测分析

说明：

1. 上图呈示的均为2-ΔΔCt 分析结果，以Actin 为内参。

2. 图1为单个样本分析检测结果，以CK3d-1为“control ”，图片来自于

图2. 样本组间基因的综合分析

Analysis 1分析文件；图2为合并三个重复样本综合分析结果，以合并后CK3d 为“control ”， 图片来自于Analysis 2分析文件；见于 “3. 综合文件”。

3. “1. 原始文件”中为Bio-Rad qPCR 仪器数据文件，可用CFX Manager 软件分析；

4. “2. 原始数据”中为直接从原始文件中导出未经处理的数据，客户若需更

多分析可用该文件夹中数据。