高效液相色谱法在蛋白质分离检测中的应用
高效液相色谱法在蛋白质分离检测中的应用
植物丁颖班 何健伟 [1**********]7
摘 要 : 对近年来高效液相色谱法分离和测定蛋白质技术作一综述,比较详细地介绍了各种HPLC 模式、检测器, 以及联用技术的应用情况。对今后高效液相色谱法在蛋白质研究方面的作用作一展望。
关键词:高效液相色谱 检测模式 蛋白质 分离测定 联用技术
前言:蛋白质是生命有机体的主要成分, 在生命体生长发育的各个阶段都起着重要作用。所以蛋白质的分离和检测一直是人们研究的热点。然而蛋白质是一种长链高分子化合物, 相对分子量 大, 在溶液中的扩散系数小、黏度大、易变性, 这增加了蛋白质分离、分析的困难。目前,高效液相色谱法广泛用于蛋白质的分离和检测。高效液相色谱(HPLC)具有分析速度快、分离效能高, 检测灵敏度高样品适用范围广等优点因此在药学研究和生物医学测定中都得到了广泛的应用。在高效液相色谱技术中, 分配色谱、亲和色谱、离子交换色谱和凝胶排阻色谱都能够用于蛋白质的分离与鉴定。本文对这几种色谱作一简要介绍。
1 HPLC基本原理
HPLC由液体输送系统、进样系统、色谱柱和检 测系统 4部分所组成。输液泵将流动相 以稳定的流速 (或压力) 输送至分析体系 ,在进 入色谱柱之前通过 进样器将样品导人 ,流动相将样 品带人色谱柱 ,在色 谱柱 中各组分依照分配系数 、吸附力大小 、带 电性 质 ,乃至分子量大小的差异而被分离 ,并依次随流动相流至检测器 ,将检测到的信号送至数据系统记录 、 处理或保存。随着HPLC 技术的日趋成熟, 它已成为 分离和检测蛋白质的重要工具 。
2 蛋白质的HPLC 分离模式
物理、化学功能等特征差异是蛋白质分离、检测的基础。根据蛋白质的大小、形状、电荷、疏水性功能等特性以及蛋白质的来源、实验要求等可以选择不同的模式来分离目标蛋白质
2.1 反 相 高 效 液 相 色 谱 (RP-一HPLC)
RP_HPLC在HPLC 各种模式中的应用最为广泛, 但目前比较流行的色谱柱在蛋白质的检测方面并不多见 。这是因为蛋白质的混合物要在 RP— HPLC中得到分离, 必须有极性的差异, 且在固定相和流动相中都有分配 ,而蛋白质通常都是强极性的化合物, 与柱的结合较闲难。另外,RP_HPLc 常用的流动相, 如甲醇、乙腈等都能使蛋白质变性沉积而导致色谱柱报废。因此, 当RP_ HPLC 用于蛋白质分析时, 一般需要低pH 值流动相、较高的温度及使用乙腈或异丙醇作为有机部分 ,氟乙酸(TFA)作为离子对试剂 ,是反相色谱中最常用的添加剂——蛋白质的保留性质和选择性与 反相色谱键合固定相的性质有关。随着研究的深入, 越来越多的小分子蛋白质和多肽已经能够使用RP-HPLC 进行分离 分 析
2.2 高效亲和色谱 (HPAFC)
HPAFC 的基本原理是抗原抗体反应 ,它可以从复杂的混合物中直接分离到目标蛋白质 ,特别适合疫苗、糖蛋白和抗体等的分离纯化。HPAFC 可以分离纯化酶、抗体、抗原、结合蛋白、受体蛋白、辅助蛋白等, 也可以分离变性蛋白、化学改性蛋白等, 在蛋白质化学中起着重要作用. 目前乳源性的功能蛋白, 如乳铁蛋白、乳清蛋白、乳球蛋白等 ,都可以用该法得到纯化。
2.3 高效离子交换色谱 (HPIEC)
HPIEC是根据蛋白质分子在一定的 DH 和离子强度条件下所带电荷的差异将其分离的。这种技
术已经成功地用于分离蛋白质 ,成为分离 、检测蛋白质的重要方法。并且,当选择的流动相的pH 值合适时能维持蛋白质的生物活性。由于HPIEC 是一吸附性的梯度洗脱过程。所以具有很好的负载力。并且,人们的研究证明,HPIEC 与 RP —HPLC 都是分离膜蛋白的首选方法 。在离子交换色谱填料研究方面。聚合 物离子交换剂颇受重视。因为这种固定相具有稳定性好、离子交换容量大、对蛋白质的分离有选择性等特点。
2.3.1 阴离子交换色谱
大多数蛋白质在生理 pH值 6—8时, 都带负电 荷 ,因此常用阴离子交换色谱来分离 。如人乳或牛乳中的 骨桥蛋白 , 通常就可以用 pH 值 5.0 -7.0 的弱阴离子交换色谱纯化 。采用阴离子交换色谱分离乳蛋白时 ,一般是有针对性的分离某一种蛋白质时的效果较好 , 如分离骨桥蛋白时 , 纯 度可以达到 8 5 % 以 上 ,但是如果要将大多数常量蛋白质都同时得到分离, 则必须与其他手段 (如膜分离或分子筛) 联用。
2.3.2 阳离子交换色谱
对于乳品中一些等电点较高的蛋白质 ,如乳铁蛋白 (Lactoferin),采用强阳离子色谱的分离手段则更为有效 。且在分离乳铁蛋白的同时 ,乳过氧化物酶 (Lactoperoxidase) 也可以得到分离,如将强阳离子交换柱与超滤的方法相结合 ,最终乳铁蛋白的纯度可以达到 94%
2.4 高效凝胶过滤色谱 (H P S E C )
凝胶过滤色谱也称体 积 排 阻 色 谱 (Size exclusion chromatography ,SEC) ,是根据分子相对大小将其进行分离的 一种色谱技术。相对于吸附性液相色谱技术而言。SEC 的分辨力和样品负载力都很低。但是 SEC 是一种温和的技术。可用来平衡柱及分离样品的缓冲液范围较广,所以近年来关于利用 SEC分离蛋白质的报道也不少。
2.5高 效 疏 水 色 谱(HPHIC)
高效疏水色谱(HIC)是用来分离构象不稳定蛋白质的技术之一。其分离机制类似于反相液相色谱。只是用 水性缓冲液代替了有机溶 剂。在以键合氟 化物 作固定相, 用 SDS 或CTAB 作 流动相的胶束高效 液相色谱 中。胶束提供了一 个溶质溶解 的非均相环境, 可用于蛋白质的分离。近年来 ,人们将非线性色谱理论应用于蛋白质的分离更加完善了高效 液相色谱技术。在 实际应用中, 特别是进行复 杂样品的分离时。通常需要采用几种分离模式结合使用 ,才能获得理想的目标产物。
3用于蛋白质分离检测的 HPLC检测器(HPLCD)
3.1 紫外吸收检测器 (UVD)3.2 光电二极管矩阵检测器 (PDAD)
UV检测器是目前应用最广泛的检测器, 它灵敏度高,线性范围宽 ,可用于梯度洗脱 。近年来较大的改进包括:1 采用高效的光学 系 统 , 以降低噪声水平 ;2 测 定 波 长 范 围 变 宽 ,可 达 1 9 0 — 9 0 0 n m ; 3 用 时 问 程 序 切 换 波 长 ,以通过基线调整功能消除基 线漂移;4 极宽 的线性范 围及测量范围 ( 0 .0001 — 4 A U F S ) ; 5 漂 移 低; 6 波长的准确度以及重复性好。HPLC 结合UV 检测器检测蛋白质的研究很多 ,主要是利用其灵敏度高 、重复性好等优点 。
3.3荧光检测器(FD)
荧光检测器是一种专用型检测器, 具有高的灵敏度和可靠性。一般情况下。可比紫外吸收检测器的灵敏度高出两个数量级, 且对仪器的稳定性依赖较小, 可作梯度洗脱; 所 以,荧光检测器 适于蛋白质的痕量分析。激光诱导荧光检测器具有高灵 敏度, 在蛋白质的分析中也 受到人们的重视和利用 。
3.4 其他检测器
除上述几种常用的检测器外, 还有以下检测器可以使用 。
(1)电化学检测器(ECD):一种痕量、超痕量的检测器 ,对蛋白质具有高度选择性。
(2)蒸发散射检测器(ELSD): 可 以 准 确 定 量 未知 蛋 白 , 并 适 于 梯 度 洗 脱 , 可 以 与 H P IE C 配合使用 。
(3) 示 差 折 光 检 测 器(DFD): 以往多用于糖类的检测 ,灵敏度较低 ,但是随着艺水平的提高, 它作为通用型检测器也开始被用于蛋白质的检测。
(4) 多 角 激 光 散 射 (MALLS) 检 测 器 (又称绝对分子量检测器):它可以用于测定蛋 白质聚合物的分子量及其分布, 是测量溶液 中蛋 白质分子量的理想方法 ,灵敏度很高 ,且不需要进行柱子校准 ,不需要用蛋白质的标准品
4 HPLC与其他色谱光谱技术的联用
为了使蛋白质的检测更加准确方便,人们研究了各种 HPLC联用技术 。目前常用的比较成功的联用技术 主要有:
高效液相色谱 一 质 谱 ( H P L C — M s 、高 效 液 相 色 谱 一 毛细管电泳HPLC —CE) 、高效液相色谱一 等速电泳(HPLC—ITP) 、高效液相色谱一电感耦合等离子体原子发射光谱 (HPLC—ICP-AES) 。
4.2 HPLC— CE
HPLC— CE联用技术特别适合细胞或组织中蛋白质的分离。在分离检测复杂蛋白质样品时,HPCE 可以作为HPIE 的补充。有时可很好地分离利用HPLC 无法分离的蛋白质在HPCE 上即可实现。毛细管区带电泳(CZE)与HPLC 联用也可以很好的分离检测一些蛋白质。
4-3 HPLC-ICPI—AES
ICP—AES 是十分重要的化学形态分析技术.HPIE 与 ICAES 的结合赋予它多元素同时检测的特性。国外科学家利用此联用技术对人类肝部的金属硫蛋白中的金属分布作了准确的定性定量分析 。
4 .4 HPLC — U F
超滤技术是一种好的样品预处理手段 ,在用离子交换色谱分离乳清酪蛋白, 以获得 B一乳球蛋白时, 由于多数乳蛋白的等电点差异不明显 ,故分离效果不佳 ,但如用超滤的手段 ,先将蛋 白质控制在一定分子量大小区间内, 则可以获得良好的分离效果。
5 小结
HPLC 法可以根据蛋白质的不同生理特性 , 采用不同的色谱柱和检测器对其进行分离检测 ,并且具有 分离效率高 、分析速度快 、样品用量少 、灵敏度高 、分离和测定一次完成等优点 。
HPLC 法分离蛋白质的不同模式 ,可对其他领域蛋白质的研究提供强有力的手段。同时也看到 ,这些色谱柱和检测器都存在各自的侧重点 ,很难找到一种符合全部要求 的理想 的检测器和色谱柱 ,所以利用 HPLC法分离检测蛋白质的研究还会继续 ,以发现更方便 、快速 、灵敏度更高 , 通用性更好的 H PLC 分析方法 ,推动蛋白质化学的发展。
参考文献
多肽物质分离与分析方法研究进展 赵锐 ,顾谦群 ,管华诗 。《中国海洋药物》杂志 2000 年第 3 期(总第 75 期)
高效液相色谱法在蛋白质分离检测中的应用 唐玲玲, 夏明 农产品加工·学刊
高效液相色谱分离和检测蛋白质 周云龙. 张著森 龙岩学院学报
高效液相色谱在多肽,蛋白质分离纯化中的应用 中国药科大学生化教研室 高向东 高效液相色谱法在蛋白质分析中应用 周雅琳 阚健全 陈宗道