硫酸软骨素制备工艺研究进展
硫酸软骨素制备工艺研究进展
凌沛学,陈 磊,边 玲,张天民
(山东省药学科学院,山东 济南 250101)
摘 要:介绍了硫酸软骨素生产行业的发展现状以及制备工艺的进展,对酶解-超滤和酶解-树脂法工艺路线进行了综述。
关键词:硫酸软骨素;制备工艺
Process on Preparation Technology of Chondroitin Sulfate
LING Pei-xue, CHEN Lei, BIAN Ling, ZHANG Tian-min
(Shandong Academy of Pharmaceutical Sciences, Jinan 250101, China) Abstract: In this review,current situation of chondroitin sulfate production industry and process on preparation technology of chondroitin sulfate were introduced. The enzymatic-ultrafiltration and the enzymatic-ion exchange resin process routes were also discussed.
Key Words: chondroitin sulfate; preparation technology
1 我国硫酸软骨素行业的发展
我国硫酸软骨素(CS )产业虽然一度强劲发展,但产业现状并不很乐观。生产企业多,部分企业规模偏小,产业集中度低,生产技术不够先进,生产条件差,生产质量管理不规范。我国至今基本上未形成CS 终端产品企业,对国际市场变化应变能力差,受出口营销及国外市场无序竞争等影响,市场需求经常有大的波动,严重制约着我国CS 产业的可持续发展[1]。
经过将近20年的发展,CS 行业的发展进入了一个全面提升的时期。一方面一些个体生产厂家经过多年的积累具有了一定的资本;另一方面随着国内经济的发展,资金和物流发展,使原料集中收集成为可能,这些因素促使CS 行业的发展进入了一个全新的阶段。不少企业通过建造新车间、购置新设备,增加环保设施等措施全面提升行业的整体水品,以手工操作为主的个体经营模式逐步为市场淘汰。
随着行业的发展和环保的要求,生产工艺从此前单一加工软骨提取CS 逐步转变为软骨的综合利用;同时生产规模扩大,要求实现标准化、规范化的连续性生产。
2 硫酸软骨素提取工艺研究进展
收稿日期:2012-09-10
作者简介:凌沛学(1963-),男,研究员,博士生导师 E-mail :[email protected]
CS 在软骨的细胞外间质中存在,并以O 型糖肽键或N 型糖肽键与核心蛋白的丝氨酸以共价键结合[2]。糖肽键结合的主要类型为O 型,而O 型糖肽键在碱性条件下不稳定,同时CS 由于羧基和硫酸基的化学性质为一酸性多糖。因此碱性试剂通常用以提取CS ,以切断糖肽键并中和释出的CS 。使CS 与核心蛋白分离是关键步骤之一。通常用氢氧化钠于碱性水解以释出CS 并转变为可溶性钠盐,有的工艺加入氯化钠调节离子强度,使有利于CS 的分离。
CS 在碱性条件下从核心蛋白释出时,往往连接一些氨基酸残基,故如要求纯度高时需进行酶解纯化步骤。
目前CS 的提取方法主要有中性盐法、碱提取法、碱盐法、酶处理法等。这些制备工艺一般都要经过酶解和活性炭、硅藻土或白陶土等处理,以达到较为理想的效果。近年来也有不少新的CS 提取技术出现。
文献[3]报道了一种无溶剂力化学提取CS 的方法。鲨软骨与水80℃处理10 min ,在80℃, 6 h烘干后粉碎成粉末。氢氧化钠与二氧化硅(磨料) ,在研磨器中用不锈钢球研磨1 min得固体碱试剂。碱试剂与软骨细粉室温共研磨3 min,所得混合物溶于3%氯化钠溶液,调pH 6.0,离心,上清液乙醇沉淀得CS 。该法所得CS 产品收率可从传统工艺的8.5 %增加到9.3 %,纯度可从86 %提高到95 %,由于提取时间从3 h缩短至3 min,能量消耗明显减少。上述实验系用鲨软骨于实验室小规模制备,如工业生产规模软骨以吨计,则不能完全显现此方法的优势。
田甲春[4]等以猪喉管为原料,采用超声辅助法制备CS 。将软骨粉碎超声辅助碱处理139min ,进一步进行酶解、除蛋白质、脱色,最后进行乙醇沉淀。采用超声结合酶解的方法制备CS 收率为23.2%,纯度为86.1%。此方法在生产的周期上有较大的缩短,但是在提高收率上仍然需要做进一步的探索。
Nakano 等[5]将牛鼻软骨粉碎成1 mm³细小颗粒,加入10倍体积的pH 4.5的乙酸溶液在37 ℃下提取7 h,离心。上清液沸腾浓缩并在90 ℃下恒温干燥得到CS 粗品。过DEAE-Sephacel 色谱柱,除去透明质酸和胶原蛋白,得CS 。此工艺可提取牛鼻中70 %以上的CS ,是一种低成本、低消耗的适合工厂生产的工艺。但是目前工厂中应用并不很广泛,主要原因可能是其生产效率不高。
3 国内应用较多的两种工艺
目前国内应用较多的是酶解法,生产工艺为:软骨→蒸煮→酶解→过滤→醇沉→再溶解→氧化漂白→二次醇沉→脱水烘干。此方法的酶解效率较高,生产周期较短,生产中使用的酸、碱、盐量少。但是此方法需要大量的乙醇,乙醇回收又需要能源。采用此法所生产的CS 含量一般在90 %以下。
随着能源价格的日益增加以及国内外市场对于CS 品质要求的日益提升,实际的工业生产中越来越多的生产厂家采用了酶解-超滤和酶解-树脂法进行生产。
3.1 酶解-超滤法
超滤技术的优点是操作简便,成本低廉,不需增加任何化学试剂,尤其是超滤技术的实验条件温和,与蒸发、冷冻干燥相比没有相的变化,而且不引起温度、pH 的变化,因而可以防止生物大分子的变性、失活和自溶。 Lignot 等[6]经比较研究证实了超滤技术用于浓缩纯化CS 的可行性。超滤可以分离除去大部分的无机盐和小分子肽,并通过检测透过液电导率反映除去效果。同时通过超滤可将提取液的体积浓缩至原提取液的30 %~50 %,节约乙醇用量,并且如果超滤设备选择合适,操作得当,通过一次醇沉就可以得到含量90 %以上的CS 产品。
随着超滤时间的延长,液中肽含量虽然逐渐降低,但即使无时间限制地超滤下去,最终还是有大约20 % (以软骨总蛋白质质量计) 的蛋白质留在了超滤膜的浓缩液里,难以去除蛋白质[7]。
对于不同原料来源的CS 制备,应具体考虑提取液中CS 的相对分子质量(M r )及其中蛋白质与肽的M r 选择合适的超滤膜以达到最佳的分离效果,一般超滤膜的M r 位于3×103~10×103之间。
在超滤过程中,由于被截留的杂质在膜表面上不断积累,会产生浓差极化现象,当膜面溶质浓度达到某一极限时即生成凝胶层,使膜的透水量急剧下降,这使得超滤的应用受到一定程度的限制。为此,需通过试验进行研究,以确定最佳的工艺和运行条件。
3.2 酶解-树脂法
由于制备CS 的原料不同,会与CS 共存一些性质相近的杂质,如其他糖胺聚糖,故可用离子交换剂进一步纯化。阴离子交换树脂适用于不同糖胺聚糖之间
的分离。由于不同糖胺聚糖的分子结构不同,所携带的负电荷量不同,在阴离子交换树脂上的保留行为不同,因此可采用不同盐浓度洗脱而得以分离。
酶解-树脂提取法工艺[8]:将鲸鱼软骨绞碎,用蛋白酶55 ℃保温水解20 h,再加盐酸中和至近中性,过滤,调整滤液中氯化钠浓度达到0.5 mol/L后,将溶液通过离子交换树脂柱吸附完毕,用0.5 mol/L的氯化钠溶液洗涤,再用1.8mol/L 的氯化钠溶液洗脱,流速2 L/h,洗脱液乙醇沉淀,收集沉淀,干燥,即得成品。这种方法相对来说产率较高,纯度也较高,生产周期较短,且对环境污染较小,是比较理想的制备方法。
离子交换剂的种类,用量,操作条件都影响纯度和收率,应根据实际生产情况和要求选择合适的离子交换剂,确定使用条件。
酶解-超滤法和酶解-树脂法两种方法是现在生产中比较常用的两种方法,两种方法都具有操作简单方便,降低能源消耗,降低有机溶剂的使用量,保证生产的连续性和标准化操作,提高产品质量的优点。比较来看酶解-超滤法适合大规模的生产制备,酶解-树脂法更适合小规模生产或者少量CS 产品的精制。 参考文献
[1]
[2] 张天民,凌沛学. 硫酸软骨素的过去、现在和将来[J ]. 食品与药品,2010,12(01):1-3. Lamari F N, Karamanos N K. Structure of chondroitin sulfate[J]. Adv Pharmacol, 2006, 53:
33-38.
[3]
[4] 凌沛学,何兆雄. 硫酸软骨素[M]. 北京:中国轻工业出版社,2012:44. 田甲春,韩玲,杨晓丽. 超声波辅助法提取硫酸软骨素的工艺研究[J ].食品科学,
2010,31(2) : 79-81.
[5] Nakano T, Ikawa N,Ozimek L.An economical method to extract chondroitin
sulphate-peptide from bovine nasal cartilage[J ]. Can Agricul Eng,2000,42(4) : 205-208.
[6] Lignot B,Lahogue V,Bourseau P. Enzymatic extraction of chondroitin sulfate from skate
cartilage and concentrationdesalting by ultrafiltration[J〕. J Biotechol, 2003, 103(3):
281-284.
[7] 李燕妮. 超滤法分离提取鸡胸软骨中硫酸软骨素和Ⅱ型胶原蛋白[J]. 化学与生物工
程,2011,(2): 49-51.
[8] 李良铸,李明晔. 最新生化药物制备技术[M ]. 北京:中国医药科技出版社,2001:
319-320.