环境因素对微生物的影响
环境因素对微生物的影响
和紫外诱变效应
了解物理、化学、生物因素抑制或杀死微生物的作用方法以及紫外诱变原理，初步掌握紫外线诱变育种的方法；练习单菌落划线分离微生物。
一、 实验目的
二、 实验原理
微生物在自然界中分布广泛，生长发育受环境影响，且不同微生物受环境影响不同。 1. 温度：温度影响蛋白质、核酸等生物大分子的结构与功能以及细胞结构，从而
影响微生物的生长、繁殖和新陈代谢。粘质沙雷氏菌能产生红色或紫红色色素，菌落表面颜色随着色素量的增加呈现出由橙黄到深红色逐渐加深的变化趋势。 2. 化学因素: 可分为致死剂和抑制剂。常用的化学消毒剂主要包括重金属及其盐
类、有机溶剂(酚、醇、醛等)、卤族元素及其化合物和表面活性剂等。常用的3个指标：最低抑制浓度（MIC）、半致死剂量和最低致死剂量。
3. 生物因素：许多微生物在其生命活动过程中能产生某种能选择性地抑制或杀死
其他微生物的特殊代谢产物。不同抗生素的抗菌谱是不同的：产黄青霉分泌的
＋－
青霉素主要抗G细菌，链霉素以抗G细菌为主。
4. 紫外线：紫外线诱导形成胸腺嘧啶二聚体来破坏DNA结构，或使空气产生臭氧
(O3)来杀菌。其杀菌力最强的波长是226-256nm部分，只适用于空气及物体表面的灭菌，它距离照射物以不超过1.2米为宜。
5. 紫外线诱变：紫外线对细菌生长的影响有不同效果：剂量高、时间长、距离短
就易杀死它们，剂量低、时间短、距离长时就会有少量个体残存下来，其中一些个体的遗传特性发生了变异。我们可以利用这种特性来进行灭菌或菌种选育工作。
三、 实验仪器、材料和用具
1. 紫外照射箱，37℃培养箱、25℃培养箱、30℃培养箱 2. 24个淀粉培养基平板
3. 在一边已长成一直线状菌落的产黄青霉，泾阳链霉菌平板各1个
4. 培养18小时的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌菌液、粘质赛氏杆菌的平板
5. 无菌的小圆滤纸片、接种环、黑纸、标签纸、酒精灯、记号笔、试管架
6. 0.5%碘、75%乙醇、1.5%双氧水、1%稀释的84消毒液、95%乙醇、5%双氧水和1%甲醛混合液
四、 实验步骤
1. 温度对微生物的影响
用接种环在培养好的黏质赛氏杆菌平板上取出少量菌苔，在3个肉汤蛋白胨平板上进行单菌落划线分离，贴好标签，将平板分别放置在25℃、30℃和37℃培养箱中进行培养，24h后 取出，观察不同温度下培养的黏质赛氏杆菌生长状况和产生色素情况。
2. 化学因素对微生物的影响
用无菌吸头吸取100μl培养了18h的金黄色葡萄球菌液于肉汤蛋白胨培养基上，用无菌涂布棒涂布均匀。放置片刻，等菌液全部被培养基吸收后进行下一步实验。将上述培养皿用记号笔分成7份，六等份内各标明一种药物名称：0.5%碘、75%乙醇、1.5%双氧水、1%稀释的84消毒液、95%乙醇、5%双氧水和1%甲醛混合液，一等份作空白对照。用无菌镊子将小滤纸片分别浸入各种药剂中，取出，并在试管内壁上除去多余药液后，以无菌操作将纸片对号放入培养皿的小区内（每种药剂专用一把镊子)。置37℃培养箱培养24h后观察结果。比较抑菌圈大小。
3. 生物因素对微生物的影响
用肉汤蛋白胨培养基制成平板，在平板一侧，用接种环取产黄青霉的孢子，在平板上划一直线接种，置于28℃培养48～72h（已由助教完成）。待形成菌苔后，从距产黄青霉的菌苔边缘5mm处用接种环并分别垂直向外划直线接种已培养18h的大肠杆菌、黏质赛氏杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌。在37℃培养箱中培养24h，观察结果。
用同样的方法做泾阳链霉菌的抗菌谱试验。 4. 紫外线对微生物的影响
用无菌吸头吸取100μl培养了18h的金黄色葡萄球菌液于肉汤蛋白胨培养基平板上，以无菌涂棒涂布均匀，用一张正方形锡纸条遮住部分平板，打开皿盖；置紫外灯下照射3min后取出锡纸（或纸条），盖上皿盖。在黑暗中（或红灯下）用双层报纸包裹，倒置于37℃培养箱中培养24h后观察结果。
5. 紫外线对微生物的诱变效应
（1）菌液的制备：把枯草杆菌菌种接入有100ml培养基的250ml无菌三角瓶中，37℃，200r/min摇床培养18h。
(2)稀释：取摇瓶培养至对数生长期的菌液（菌液浓度为108～1010ml）0.5ml入4.5ml生理盐水或0.1ml入0.9ml生理盐水中，进行10倍稀释，稀释度为10-1～10-8。
(3)涂布：取10-1～10-8的菌液各100μl涂平板，每个稀释度涂平板2块。
(4)紫外线处理：分别对10-6，10-5，10-4，10-3，10-2，10-1的平板照射10s，20s，30s，40s，50s，60s（紫外灯功率为30W，照射距离为30cm）以10-7和10-8平板作对照。处理后的培养皿在黑暗中（或红灯下）用双层纸包好，倒置37℃培养，48h后观察并记录结果。
（5）观察诱变效应：讲培养皿取出，分别向菌落分散开的平板内加卢戈碘液（或革氏碘液）数滴，在菌落周围将出现透明圈，分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值（HC值）。与对照平板进行比较。
五、 实验结果和分析
1. 温度影响
图1 温度对黏质赛杆菌的影响（从左到右依次为25℃、30℃、37℃）
表1 温度对黏质赛杆菌的影响
分析：按理说，低温有利于次级代谢产物积累，所以25赛杆菌生长，所以该温度应该颜色最浅且菌落最大。但是结果25℃菌落颜色不如30℃深，推测是因为涂板的时候没有涂好，所以细菌生长总量25℃比较少，因而颜色稍浅。当然，也不排除我们拿到的菌种最适产色素的温度在30℃左右，比25℃高。 2. 化学因素影响
图2 化学因素对微生物生长的影响（顺时针依次为1.5%双氧水、95%乙醇、0.5%碘、1%稀释的84消毒液、75%乙醇、5%双氧水和1%甲醛混合液） 表2 化学试剂的抑菌现象
由图、表可知：抑菌能力：75%乙醇 > 0.5%碘 > 1%稀疏的84消毒液 > 95%乙醇 > 1.5%H202 > 5%H202，1%甲醛
5%H202，1%甲醛没有观察到抑菌环,而1.5%H202有抑菌环,分析可能双氧水和甲醛发生作用降低了二者的抑菌能力,或者是整个区域的菌都没有了所以没有观察到抑菌环 75%乙醇抑菌能力大于95%乙醇,分析原因可能是95%的乙醇很容易挥发,所以实际作用的时候浓度反而不如75%的乙醇,所以抑菌作用反而更差.
同时可知，平时用于消毒的碘液和84消毒液的抑菌作用还是比较理想的。
3. 生物因素影响
黏氏赛杆菌 大肠杆菌
图3 产黄青霉对微生物生长的影响
由图可见：枯草杆菌距产黄青霉远端长势稍微好于近端；黏氏赛杆菌和大肠杆菌没有明显区别，但看起来近端菌落颜色稍微比远端浅，应该也有一定影响；金黄色葡萄球菌远端比近端长势明显好。
分析：产黄青霉产生青霉素，与肽聚糖五肽侧链末端D－丙氨酰－D－丙氨酸结构类似，青霉素竞争与转肽酶结合形成青霉素转肽酶复合物，从而破坏细胞壁完整的网状结构，
＋－＋－
由于G菌细胞壁肽聚糖比例远远大于G菌，所有青霉素对G菌的作用强于G菌。而
＋－
在这些菌种中，枯草杆菌和金黄色葡萄球菌为G菌，所有受到的抑制比较强烈；G菌也会受到抑制，不过抑制作用没有那么明显。
黏氏赛杆菌 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌
图4 泾阳链霉菌对微生物生长的影响
由图可见：枯草杆菌在离泾阳链霉菌近端生长比远端明显更差，黏氏赛杆菌近端比远端颜色稍浅，大肠杆菌近端比远端生长稍微差一些，金黄色葡萄球菌在近端几乎没有生长，远端则长势较好。
分析：泾阳链霉菌产生链霉素，链霉素作用于核糖核酸30S亚基，由于真核生物是（60S
＋40S），原核生物是（30S＋50S），所以链霉素作用于原核生物。因而对所有细菌都有一定影响。由观察结果可见，其对金黄色葡萄球菌的抑制作用最为强烈。 4. 紫外线杀菌效果观察
图5 紫外杀菌效果
由图可见：报纸遮盖区域长出了菌，而直接紫外照射区域没有菌长出
分析：紫外线具有杀菌作用主要是因为它诱导形成胸腺嘧啶二聚体来破坏DNA的结构，使其不能正常行使功能。但是它透过物质能力很差，所以只适用于空气及物体表面的灭菌，且距离照射物以不超过1.2米为宜。实验中，报纸阻挡了紫外线的照射，所有报纸遮盖区域的菌没有被杀死而生长，直接暴露在紫外灯下的菌被杀死所有没有生长。 5. 紫外诱变
附：平均值
处理后活菌数1处理后活菌数2
；
2
稀释度为107稀释度为10810
应有菌数，此处n为稀释度中10的指数； -7-n
210存活率
平均值
应有菌数
致死率1存活率
由表可知：紫外照射的致死率还是很高的，且基本随照射时间的增加而增大
-7
分析：平板中总有一块是无法计数，而另一块可以计数且菌落数不是很多。观察10和10-8的结果，也是一块板菌落多于另一块。估计是菌落少的那块涂得不够好，可能菌液还未干就倒置，结果菌液大部分都流了出来。但是得到的结果是比较符合预期的，紫外照射时间越长杀菌效果越好。
附：HC值
透明圈直径
，统计不完全，只是在每个平板里挑了几个比较有代表性的
菌落直径
进行测量。
由表可知：HC值一般在1左右，其中有些菌落HC值偏大，有些则偏小。其中，照射时
间长的HC偏大的菌落更多。
分析：HC值比平均值偏离，说明淀粉酶活性改变，不管是增强还是减弱，都有可能是诱变的作用。
六、 思考
1. 紫外诱变要注意哪些方面？
（1） 稀释要做好，因为前面每一步稀释都对后面有影响，所以务必每一步都精
确稀释
（2） 涂板要时间长一点，这样会涂得比较均匀，方便后来的计数操作 （3） 涂板后要等菌液干了再倒置，否则菌液可能流出来 （4） 紫外处理要注意距离和照射角度 （5） 紫外处理后要在黑暗下包平皿
2. 为什么紫外杀菌和紫外诱变操作后要注意无光操作？
紫外诱变的机理是使DNA中嘧啶5，6双键加成形成嘧啶二聚体交联体，组织双链解开和复制，或一条链形成二聚体不修复，最终导致碱基互换、缺失、重排甚至移框。
而细菌可以进行光修复，可见光（400nm效果最好）激活DNA光裂合酶或DNA光修复酶，能识别紫外照射产生的丁烷嘧啶二体二聚体，切开嘧啶二体的环丁烷使解聚为单体。
3. 为什么紫外杀菌和紫外诱变操作后可以有红色光？
因为光修复机制采用的是蓝光或近UV光子，最好效果在400nm处，所以红光不会激发光修复机制，对实验没有什么影响。
七、 实验小结
从实验告诉我们的信息来看，这次实验告诉我们：
1. 温度对细菌的生长有不同影响，细菌的最适生长温度不一定是次级代谢产物积
累最多的温度，这一点在工业生产中极为重要，所需的产品是初级代谢产物还是次级代谢产物，需要控制的温度就有所不同。
2. 化学因素影响中，95%的乙醇杀菌效果反而没有那么好，所以考虑一种试剂的杀
菌效果时不能光看浓度，浓度很高结果全部挥发了作用一样不好，就要求多次实验确定合适的浓度。
3. 生物因素影响中，最初我以为和产黄青霉对比，泾阳链霉菌应该是对革兰氏阴
性菌强烈抑制，结果不是，它对所有原核生物都有抑制作用，所以说实践是很重要的。
4. 紫外杀菌告诉我们，紫外杀菌效果是很好的，但是建立在其有效范围的基础上，
距离太远不行，有遮盖物也不行，所以要用紫外杀菌时务必考虑这些因素。 此外，这次实验最多的是练习，练习涂板和划单菌落，我想还是孰能生巧吧，操作多了便对培养基和接种环更加了解了，也就更有手感，涂起来也不那么容易吧培养基划破了。
八、 参考资料
陈金春 微生物实验教程 清华大学出版社 2005年